一种富含有益硫苷低含无益硫苷的绿菜花的培育方法

1.本发明涉及植物育种领域中，一种富含有益硫苷低含无益硫苷的绿菜花的培育方法。


背景技术：

2.大健康产业是近些年发展起来的新兴产业，也是现在人们最关注的热点之一。在蔬菜健康产业中，绿菜花(绿色西兰花)是一种非常重要的蔬菜，其不仅含有其它蔬菜所具有的维生素c、膳食纤维、蛋白质、可溶性糖、矿物元素等营养物质，还富含硫代葡萄糖苷(glucosinolates，简称硫苷)。硫苷种类很多，绿菜花中主要存在3-甲基硫氧烯丙基硫苷(glucoiberin，简称ibe)、2-羟基-3-丁烯基硫苷(progoitrin，简称pro)、2-丙烯基硫苷(sinigrin，sin)、4-甲基硫氧丁基硫苷(glucoraphanin，简称raa)和3-丁烯基硫苷(gluconapin，简称nap)；4-羟基吲哚基-3-甲基硫苷(4-hydroxyglucobrassicin，简称4oh)、4-甲硫基丁烯基硫代葡萄糖苷glucoerucin，eru)、3-甲基吲哚基硫苷(glucobrassicin，简称gbc)、4-甲氧基吲哚基-3-甲基硫苷(4-methoxyglucobrassicin，简称4me)、1-甲氧基吲哚基-3-甲基硫苷(neoglucobrassicin，简称neo)等硫苷成分。目前已知对人体有益的硫苷有raa、4oh、gbc、4me、neo等，水解产生的一些生物活性物质具有抗氧化、延缓衰老、防癌抗癌等作用，对人体健康具有重要的作用；对人体健康不利的硫苷如pro，是致甲状腺肿素5-乙烯唑烷-2-硫酮的前体。raa是绿菜花中硫苷的最主要成分，其raa含量在各种蔬菜中占居首位，因此，绿菜花有“抗癌蔬菜之王”的美誉。但是，绿菜花raa含量在不同品种之间存在较大的差异，变异幅度可高达十倍以上。研究发现，通过遗传改良可以改变绿菜花中硫代葡萄糖苷的含量，同一个品种的硫苷含量在种子、芽苗、花球等不同时期存在相关性，并且以种子和芽苗最高，花球次之。随着人们对硫苷认识的深入，利用绿菜花种子提取有益硫苷的需求和市场在不断扩大，培育富含有益硫苷且低含无益硫苷的绿菜花品种就越来越重要。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题是如何培育富含有益硫苷、低含无益硫苷的绿菜花，尤其是如何培育种子富含有益硫苷、低含无益硫苷的绿菜花。
4.为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种培育绿菜花的方法，所述方法包括：
5.1)将绿菜花品种绿辉进行连续多代自交，获得遗传稳定的自交系；经花期授粉测定自交亲和指数，获得花期自交亲和指数大于2的自交亲和系；
6.2)以步骤1)中所得自交亲和系为轮回亲本，与绿菜花细胞质雄性不育源进行连续多代回交，得到除了育性之外其它形态学性状(如植株和花球形态)与所述轮回亲本相同或相似的细胞质雄性不育系；
7.3)检测步骤1)中所得自交系与步骤2)中所得细胞质雄性不育系的硫代葡萄糖苷的含量，选择自交系中raa含量高于90μmol/gdw且raa、4oh、gbc、4me和neo总含量高于95μ
mol/gdw、pro含量低于1μmol/gdw的株系为父本、细胞质雄性不育系中raa含量高于80μmol/gdw且raa、4oh、gbc、4me和neo总含量高于85μmol/gdw、pro含量低于1μmol/gdw的株系为母本进行杂交，所得杂交一代即为目的绿菜花，实现目的绿菜花的培育。
8.花期自交亲和指数＝结籽数/授粉花数。
9.上述方法中，所述绿菜花细胞质雄性不育源可为碧绿2号。
10.上述方法中，所述硫代葡萄糖苷可为ibe、pro、sin、raa、nap、4oh、eru、gbc、4me和/或neo。
11.上述方法中，步骤2)中回交可为回交五代。
12.每代回交均选择植株和花球形态偏向或类似所述轮回亲本、花粉败育的单株作为母本。
13.上述方法中，步骤1)中自交以单粒传的方式进行。
14.步骤1)中自交代数可视情况而定，只要满足能选出满足步骤1)中条件的自交系即可。在本发明的一个实施例中，所述自交的代数为六代。
15.上述方法中，所述培育目的绿菜花可直接获得其种子。
16.所述培育绿菜花的方法在培育富含有益硫苷绿菜花中的应用，也属于本发明的保护范围。
17.所述培育绿菜花的方法在培育低含无益硫苷绿菜花中的应用，也属于本发明的保护范围。
18.所述培育绿菜花的方法在培育富含有益硫苷且低含无益硫苷绿菜花中的应用，也属于本发明的保护范围。
19.本发明中，所述有益硫苷可为raa、gbc、neo、4oh和/或4me。所述无益硫苷可为pro。
20.本发明提供了一种提高有益硫苷降低无益硫苷的健康功能型绿菜花的培育方法，利用本发明的方法选育出了种子有益硫苷raa、gbc、neo、4oh、4me含量高、无益硫苷pro含量低的绿菜花新品种。
具体实施方式
21.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
22.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
23.hplc检测西兰花中硫代葡萄糖苷(ibe、pro、sin、raa、nap、4oh、eru、gbc、4me、neo)含量的步骤如下：
24.(1)硫代葡萄糖苷的提取
25.将待测种子用真空冷冻干燥机干燥，称量粉碎好的冷冻干燥样品0.2g，放入15ml塑料管中。加入内标tro(苯甲基硫苷)0.25ml，迅速加入100％预热的甲醇，在80℃下水浴20min，每隔4～5分钟涡旋一次。3000r/min下离心10分钟，取上清液倒入15ml塑料管中，放
在冰盆中。沉淀物继续用70％的甲醇提取两次，同上述处理，合并上清液，即为样品液。取一次性注射器，加入玻璃棉压实到0.5ml，放在试管上。加入deae凝胶溶液2ml，用1ml双蒸水洗涤两次，然后加入样品液2ml。待样品液不再滴下时，加入0.02m的naac溶液。待不再有液体滴下，将注射器转移到另一试管上，并加入75μl硫酸酯酶溶液，封口过夜。
26.其中deae凝胶溶液配制方法：称取10g deae sephadex a25葡聚糖凝胶于容量瓶中，加入80ml 2mol/l醋酸溶液浸泡24h后，再加入等体积的2mol/l醋酸溶液，封口于4℃冰箱中存放，待用。硫酸酯酶配制方法：helix pomatia h1型(ec3.1.6.1)，每毫升硫酸酯酶活性单位不低于0.5，硫酸酯酶溶液应即配即用。
27.将过夜的注射器，用双蒸水洗涤3次，每次0.5ml。用注射头挤压注射器，使液体尽可能转移到试管中。将试管中液体通过0.45μm的滤膜转移到小玻璃瓶中，冷冻保存，即为待测溶液。
28.(2)硫代葡萄糖苷的分析
29.将步骤(1)所得待测溶液进行hplc分析。hplc分析条件：waters c18色谱柱，3.9*150mm，5μm；检测波长229nm；柱温：25℃；进样量10μl；流动相流速为1.0ml
·
min-1
，梯度洗脱如下：
30.0-1min(包括1min)：流动相a；
31.1-21min(不包括1min，包括21min)：流动相a的体积百分比含量由100％线性降至0，流动相b的体积百分比含量由0线性升至100％；
32.21-26min(不包括21min，包括26min)：流动相b的体积百分比含量由100％线性降至0，流动相a的体积百分比含量由0线性升至100％；
33.26-31min(不包括26min，包括31min)：流动相b。
34.其中，流动相a：1g四甲基氯化铵(tmacl)溶于2l双蒸水中，混匀，抽滤。
35.流动相b：1g四甲基氯化铵(tmacl)溶于1.6l双蒸水中，加入400ml色谱纯乙腈，混匀，抽滤。
36.采用苯甲基硫苷作为内标，根据保留时间和峰面积对硫苷组分定量测定。利用内标和响应因子来计算硫代葡萄糖苷的含量，单位为μmol/gdw。
37.实施例1、富含有益硫苷低无益硫苷的健康功能型绿菜花的培育
38.培育过程如下：
39.1、将绿菜花品种绿辉以单粒传的方式进行自交分离、提纯，通过6代单株自交，分离获得11个遗传稳定的自交系lh-1、lh-2、lh-3、lh-4、lh-5、lh-6、lh-7、lh-8、lh-9、lh-10、lh-11。
40.2、对步骤1所得11个自交系进行自交亲和性鉴定，获得4个自交亲和系lh-1、lh-2、lh-3和lh-6，这4个自交亲和系满足：花期自交亲和指数大于2，其中花期自交亲和指数＝结籽数/授粉花数。
41.3、分别以步骤2选出的lh-1、lh-2、lh-3和lh-6为轮回亲本，与绿菜花细胞质雄性不育源碧绿2号(京研益农(北京)种业科技有限公司)进行回交转育，经过五代回交之后获得4个绿菜花细胞质雄性不育系cmslh-1、cmslh-2、cmslh-3和cmslh-6。回交的目的是要将自交系转育成细胞质雄性不育系，每代回交均选择植株和花球形态偏向或类似轮回亲本、花粉败育的回交后代单株作为母本，与相应的轮回亲本进行回交授粉，获得回交后代。经过
五代回交选择后，不育系cmslh-1和自交系lh-1除了在花粉育性上存在差异之外，其它性状基本相同。同样，不育系cmslh-2和自交系lh-2、不育系cmslh-3和自交系lh-3以及不育系cmslh-6和自交系lh-6亦如此，除了在花粉育性上存在差异之外，其它形态学性状基本相同。
42.4、以种子为待测样本，分别采用hplc检测绿菜花中硫代葡萄糖苷(ibe、pro、sin、raa、nap、4oh、eru、gbc、4me、neo)的含量，所检测对象为：不育系cmslh-1、cmslh-2、cmslh-3和cmslh-6，自交系lh-1-lh-11。结果如表1所示。
43.表1、不同株系硫代葡萄糖苷的检测结果(单位：μmol/gdw)
44.[0045][0046]
表1中，tol表示总硫代葡萄糖苷含量，tol1表示raa、4oh、gbc、4me和neo总含量。
[0047]
5、以raa含量高于80μmol/gdw且raa、4oh、gbc、4me和neo总含量高于85μmol/gdw、pro含量低于1μmol/gdw的不育系cmslh-3为母本，与raa含量高于90μmol/gdw且raa、4oh、gbc、4me和neo总含量高于95μmol/gdw、pro含量低于1μmol/gdw的自交系lh-5进行杂交，得到cmslh-3
×
lh-5的f1代种子；
[0048]
以不育系cmslh-3为母本，分别与自交系lh-6、lh-8、lh-10进行杂交，得到cmslh-3
×
lh-6、cmslh-3
×
lh-8、cmslh-3
×
lh-10的f1代种子，作为对照；以不育系cmslh-6为母本，分别与自交系lh-3、lh-5、lh-8、lh-10进行杂交，得到cmslh-6
×
lh-3、cmslh-6
×
lh-5、cmslh-6
×
lh-8、cmslh-6
×
lh-10的f1代种子，作为对照。
[0049]
6、采用hplc方法检测步骤5获得的各f1代种子中硫代葡萄糖苷的含量，结果如表2所示。
[0050]
组合cmslh-3
×
lh-5的f1代种子有益硫苷raa、4oh、gbc、4me、neo的总含量(124.147μmol/gdw)分别比亲本cmslh-3(87.749μmol/gdw)和lh-5(96.749μmol/gdw)高41.5％和28.3％；而无益硫苷pro的含量(0.271μmol/gdw)分别比亲本cmslh-3(0.759μmol/gdw)和lh-5(0.926μmol/gdw)低64.3％和70.7％。f1代种子有益硫苷含量的提高和无益硫苷含量的降低均达到了极显著差异水平。
[0051]
组合cmslh-3
×
lh-6的f1代种子有益硫苷raa、4oh、gbc、4me、neo的总含量(117.647μmol/gdw)分别比亲本cmslh-3(87.749μmol/gdw)和lh-6(72.151μmol/gdw)高42.4％和63.1％；而无益硫苷pro的含量(1.347μmol/gdw)比母本cmslh-3(0.759μmol/gdw)高77.5％，比父本lh-6(76.545μmol/gdw)低98.2％。f1代种子有益硫苷含量的提高及无益硫苷含量比母本的提高和比父本的降低均达到了极显著差异水平。
[0052]
组合cmslh-3
×
lh-8的f1代种子有益硫苷raa、4oh、gbc、4me、neo的总含量(99.366μmol/gdw)分别比亲本cmslh-3(87.749μmol/gdw)和lh-8(74.090μmol/gdw)高11.62％和34.1％；而无益硫苷pro的含量(0.124μmol/gdw)分别比亲本cmslh-3(0.759μmol/gdw)和lh-8(55.439μmol/gdw)低83.7％和99.8％。f1代种子有益硫苷含量的提高和无益硫苷含量的降低均达到了极显著差异水平。
[0053]
组合cmslh-3
×
lh-10的f1代种子有益硫苷raa、4oh、gbc、4me、neo的总含量(84.519μmol/gdw)比母本cmslh-3(87.749μmol/gdw)低3.7％，比父本lh-10(58.406μmol/gdw)高44.7％；而无益硫苷pro的含量(0.284μmol/gdw)分别比亲本cmslh-3(0.759μmol/gdw)和lh-10(2.371μmol/gdw)低62.6％和88.0％。f1代种子有益硫苷含量比母本稍有下降，但差异不显著，比父本的提高达到了极显著水平；无益硫苷含量比双亲的降低均达到了极显著差异水平。
[0054]
组合cmslh-6
×
lh-3的f1代种子有益硫苷raa、4oh、gbc、4me、neo的总含量(40.143μmol/gdw)分别比亲本cmslh-6(69.313μmol/gdw)和lh-3(88.566μmol/gdw)低42.1％和54.7％；而无益硫苷pro的含量(68.707μmol/gdw)比母本cmslh-6(79.292μmol/gdw)低13.3％，比父本lh-3(0.712μmol/gdw)高95.5％。f1代种子有益硫苷含量的降低和无益硫苷含量比母本的降低均达到了极显著差异水平，无益硫苷含量比父本的提高也达到了极显著差异水平。
[0055]
组合cmslh-6
×
lh-5的f1代种子有益硫苷raa、4oh、gbc、4me、neo的总含量(35.976μmol/gdw)分别比亲本cmslh-6(69.313μmol/gdw)和lh-5(96.749μmol/gdw)低48.1％和62.8％；而无益硫苷pro的含量(59.423μmol/gdw)比母本cmslh-6(79.292μmol/gdw)低25.1％，比父本lh-5(0.926μmol/gdw)高63.2％。f1代种子有益硫苷含量的降低和无益硫苷含量比母本的降低均达到了极显著差异水平，无益硫苷含量比父本的提高也达到了极显著差异水平。
[0056]
组合cmslh-6
×
lh-8的f1代种子有益硫苷raa、4oh、gbc、4me、neo的总含量(42.379
μmol/gdw)分别比亲本cmslh-6(69.313μmol/gdw)和lh-8(74.090μmol/gdw)低38.9％和42.8％；而无益硫苷pro的含量(98.022μmol/gdw)分别比亲本cmslh-6(79.292μmol/gdw)和lh-8(55.439μmol/gdw)高23.6％和76.8％。f1代种子有益硫苷含量的降低和无益硫苷含量的提高均达到了极显著差异水平。
[0057]
组合cmslh-6
×
lh-10的f1代种子有益硫苷raa、4oh、gbc、4me、neo的总含量(29.227μmol/gdw)分别比亲本cmslh-6(69.313μmol/gdw)和lh-10(58.406μmol/gdw)低57.8％和50.0％；而无益硫苷pro的含量(54.488μmol/gdw)比母本cmslh-6(79.292μmol/gdw)低31.3％，比父本lh-10(2.371μmol/gdw)高22.0％。f1代种子有益硫苷含量的降低和无益硫苷含量比母本的降低均达到了极显著差异水平，无益硫苷含量比父本的提高也达到了极显著差异水平。
[0058]
根据上述结果，只有组合cmslh-3
×
lh-5的f1代种子的有益硫苷raa、4oh、gbc、4me、neo的总含量都比双亲大幅度提高，绝对值高于120μmol/gdw，无益硫苷含量都比双亲大幅度下降，绝对值低于1μmol/gdw，而其他组合均不能实现该目标，说明，在杂交时选择raa含量高于80μmol/gdw且raa、4oh、gbc、4me和neo总含量高于85μmol/gdw，pro含量低于1μmol/gdw的不育系为母本，raa含量高于90μmol/gdw且raa、4oh、gbc、4me和neo总含量高于95μmol/gdw，pro含量低于1μmol/gdw的自交系为父本进行杂交可以成功获得有益硫苷含量大幅度提高且无益硫苷大幅度下降的杂交后代，利用该方法进行育种具有很好的应用前景，可以用于生产有益硫苷含量高和无益硫苷含量低的绿菜花。
[0059]
表2、f1代硫代葡萄糖苷的检测结果(单位：μmol/gdw)
[0060]
[0061]
表2中，tol表示总硫代葡萄糖苷含量，tol1表示raa、4oh、gbc、4me和neo总含量。
[0062]
具体的，cmslh-3与lh-5的f1代种子的制备方法如步骤7所示。
[0063]
7、绿菜花cmslh-3
×
lh-5的f1代种子的生产
[0064]
(1)母本cmslh-3的繁殖
[0065]
利用日光温室或塑料大棚采种，不育系cmslh-3与相应的保持系lh-3以2：1的行比种植，株行距45厘米见方。温室或大棚用纱网与外界隔离。开花之后温室或大棚里放一箱蜜蜂进行授粉。花期结束后拔除保持系lh-3。从不育系cmslh-3植株采种得到母本cmslh-3种子。
[0066]
(2)父本lh-5的繁殖
[0067]
利用日光温室或塑料大棚采种，lh-5按株、行距45厘米种植，温室或大棚用纱网与外界隔离。开花之后温室或大棚里放一箱蜜蜂进行授粉。在开花期，上午9-10时，用4-5％的盐水喷雾于柱头上，隔一天喷一次，不要喷叶子上。采种得到父本lh-5的种子。
[0068]
(3)cmslh-3
×
lh-5的f1代的生产
[0069]
选择隔离条件好的制种基地生产cmslh-3
×
lh-5的f1代种子，要求制种田方圆2公里以上没有种植十字花科蔬菜，尤其是没有绿菜花、白菜花、甘蓝等甘蓝类蔬菜。父本lh-5和母本cmslh-3生育期相近，两者可以同期播种、同期定植。母本：父本以2：1比例定植，株、行距为45厘米。开花期释放蜜蜂授粉。开花之后拔除父本株，只留母本株。开花前注意控水控肥，及时拔除杂株；开花前后加强田间的病虫害管理。花期结束后从母本株收种，即为cmslh-3
×
lh-5的f1代种子。
[0070]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。