磁性纳米模拟酶的制备方法、制得的模拟酶及在检测汞离子中的应用与流程

1.本发明涉及汞离子检测技术领域，具体涉及磁性纳米模拟酶的制备方法、制得的模拟酶及在检测汞离子中的应用。


背景技术：

2.近年来，随着人们生活水平的提高，对于食品安全的重视程度也不断地上升。汞离子作为一种对人体和环境高危害的重金属离子，不仅不能被微生物所降解，而且容易在人体内富集，危害人类身体健康。环境保护局(epa)和世界卫生组织(who)等监管机构已规定饮用水中汞的最大允许限值分别为10nm和30nm，因此建立一种能够在快速检测水中汞离子含量的方法变得重要起来。
3.目前，传统检测汞离子的方法主要包括原子吸收光谱法(cvaas)，原子吸收/发射光谱法(aas/aes)，电感耦合等离子体质谱法(icp-ms)，原子-荧光光谱法(afs)，高效液相色谱法(hplc)，离子选择电极(ise)，火焰光度法和溶出伏安法。然而，由于昂贵且复杂的仪器，费时的样品制备和预浓缩，这些选择性和灵敏的技术仅限于常规检测。因此，如何建立一种快速方便，简单可靠的汞离子检测方法变得重要起来。
4.纳米酶是指具有催化活性的纳米材料，自从2007年发现fe3o4具有过氧化物酶活性以来，许多诸如石墨烯、贵金属和金属氧化物等纳米材料纷纷被发现具有模拟酶的性质。与天然酶相比，纳米酶具有催化活性高，稳定性好，价格低廉等优点，因此被广泛应用于分析检测、生物医学等方面。纳米酶通常具有过氧化物酶活性，能够在过氧化氢存在的条件下催化氧化无色的tmb生产蓝色的oxtmb。
5.公开号为cn103341360a的专利公开一种纳米材料模拟酶及其在汞离子检测上的应用，汞离子与银纳米材料混合后能在空气中的氧气存在下催化氧化辣根过氧化物酶的多种特征底物，但其检测线仅为20nm。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题在于提供一种能够用于检测汞离子的磁性纳米模拟酶的制备方法、制得的模拟酶及其应用，该磁性纳米模拟酶的检测线低。
7.本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题：
8.磁性纳米模拟酶的制备方法，包括以下步骤：
9.(1)将六水合氯化钴、六水合三氯化铁和氢氧化钠溶于乙二醇中，搅拌溶解后，超声形成溶液，所述六水合氯化钴、六水合三氯化铁和氢氧化钠的摩尔比为1:2:16；
10.(2)将步骤(1)中的溶液进行水热反应，反应后冷却至室温；
11.(3)将步骤(2)中的反应产物在永磁铁的吸引下，洗涤，然后干燥。
12.有益效果：本发明仅采用前驱体和还原剂，通过简单的水热法合成磁性纳米模拟酶，反应条件温和；充分利用了磁性纳米模拟酶的强磁性质，简化了洗涤过程，合成的磁性
纳米材料可以循环重复使用，检测汞离子时检测线为3nm，检测线低。
13.优选地，所述步骤(2)中水热反应温度为180-200℃，反应时间为8-12h。
14.优选地，所述步骤(3)中用水和乙醇各洗三次，然后进行真空干燥。
15.采用上述方法制得的磁性纳米模拟酶。
16.有益效果：本发明制得的磁性纳米模拟酶可以用于检测汞离子，以半胱氨酸为探针，灵敏度高，而且磁性纳米材料可以循环重复使用，降低了检测成本。
17.采用上述方法制得的磁性纳米模拟酶在检测汞离子中的应用，包括以下步骤：
18.(1)将磁性纳米模拟酶、过氧化氢溶液、tmb溶液加入到缓冲溶液中反应得到混合溶液；
19.(2)将半胱氨酸溶液与不同浓度的汞离子溶液按体积比为1:1混合孵育得到络合溶液；
20.(3)将步骤(1)混合溶液和步骤(2)络合溶液混合孵育，反应结束后测定652nm处的吸光度a，对照组用去离子水代替汞离子溶液，反应后测定652nm处的吸光度a0，以汞离子浓度为横坐标，δa＝a-a0为纵坐标，建立标准曲线，根据标准曲线即可测得未知样品的浓度。
21.有益效果：本发明利用半胱氨酸能够影响cofe2o
4-h2o
2-tmb体系，且hg
2
与半胱氨酸有特异性结合的特点，建立了一种快速检测hg
2
的比色传感体系。
22.本发明即可采用目视比色法来hg
2
浓度进行半定量检测，又可利用uv-vis测定反应体系吸光度来准确定量检测hg
2
的浓度。
23.优选地，所述缓冲溶液为hac-naac缓冲，所述缓冲溶液的ph值为3-6，tmb溶液的浓度为0.1-0.9mm，过氧化氢溶液的浓度为6-18mm。
24.优选地，所述步骤(1)中的反应温度为20-40℃，反应时间为30min。
25.优选地，测定完成后，外加磁场回收磁性纳米模拟酶。
26.优选地，所述步骤(2)在室温下孵育30min。
27.优选地，所述步骤(3)在室温下孵育30min。
28.本发明的优点在于：本发明仅采用前驱体和还原剂，通过简单的水热法合成磁性纳米模拟酶，反应条件温和；充分利用了磁性纳米模拟酶的强磁性质，简化了洗涤过程，合成的磁性纳米材料可以循环重复使用，检测汞离子时检测线为3nm，检测线低。
29.本发明制得的磁性纳米模拟酶可以用于检测汞离子，以半胱氨酸为探针，灵敏度高，而且磁性纳米材料可以循环重复使用，降低了检测成本。
30.本发明利用半胱氨酸能够影响cofe2o
4-h2o
2-tmb体系，且hg
2
与半胱氨酸有特异性结合的特点，建立了一种快速检测hg
2
的比色传感体系。
31.本发明即可采用目视比色法来hg
2
浓度进行半定量检测，又可利用uv-vis测定反应体系吸光度来准确定量检测hg
2
的浓度。
附图说明
32.图1为本发明实施例中利用纳米酶活性检测hg
2
示意图；
33.图2为本发明实施例7中hg
2
存在和不存在时铁酸钴纳米材料过氧化物模拟酶催化活性的紫外吸收光谱图；
34.图3为本发明实施例7中不同浓度汞离子在反应体系中的颜色变化图；
35.图4为本发明实施例7中不同浓度hg
2
检测的线性关系图；
36.图5为本发明实施例7中标准曲线图；
37.图6为本发明实施例7中磁性纳米酶的电镜图；
38.图7为本发明实施例7中磁性纳米酶与底物tmb结合时的电镜图；
39.图8为本发明实施例7、8-13中hac-naac缓冲溶液的ph值对催化效果影响结果图；
40.图9为本发明实施例7、14-17中孵育温度对催化效果影响结果图；
41.图10为本发明实施例7、18-22中tmb溶液对催化效果影响结果图；
42.图11为本发明实施例7、23-27中h2o2溶液对催化效果影响结果图；
43.图12为本发明实施例7中磁性铁酸钴纳米酶回收重复利用效率结果图；
44.图13为本发明实施例7、31-39中磁性铁酸钴纳米酶对于不同金属离子的选择性检测结果图。
具体实施方式
45.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
46.下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
47.实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
48.实施例1
49.磁性纳米模拟酶的制备方法，具体包括以下步骤：
50.(1)将2mmol水合氯化钴(cocl2·
6h2o)、4mmol水合三氯化铁(fecl3·
6h2o)和16mmol氢氧化钠溶于30ml乙二醇中，搅拌溶解后，超声30分钟形成黄色溶液；
51.(2)将步骤(1)得到的溶液装入聚四氟乙烯容器中，放入烘箱内，180℃条件下反应8小时后，自然冷却至室温，取出黑色悬浮液；
52.(3)在永磁体的作用下，步骤(2)中的悬浮液用去离子水和乙醇分别洗涤三次，真空干燥后，得到磁性纳米模拟酶。
53.实施例2-实施例6
54.实施例2-实施例6的区别之处为各原料配比、反应温度和反应时间不同，具体不同之处如表1所示。
55.表1为实施例2-实施例6各原料用量及反应条件
56.57.实施例7
58.采用实施例2中的磁性纳米模拟酶检测汞离子(hg
2
)，检测示意图如图1所示，具体步骤如下：
59.(1)配制1mg/ml的铁酸钴纳米酶悬浮液(溶剂为水)，配制不同ph值的hac-naac缓冲溶液(0.1m)，配制不同浓度的tmb溶液、h2o2溶液和汞离子标准溶液。
60.(2)将100μl 1mg/ml的铁酸钴磁性纳米颗粒、100μl 0.7mm tmb水溶液、100μl 16mm过氧化氢水溶液加入到400μl hac-naac(ph＝4.0，0.1m)中，反应30分钟后得到蓝色的oxtmb溶液。
61.(3)将200μl 20μm的半胱氨酸水溶液与200μl不同浓度(10-9-5*10-6
m)的汞离子溶液混合，在30℃下孵育30分钟。
62.(4)将步骤(2)和(3)中的溶液混合并在室温下孵育10分钟，会有明显的颜色变化，得到的最终反应液在652nm处测定其吸光度值a。
63.(5)对照组用200μl去离子水代替汞离子溶液，反应后测定652nm处的吸光度a0。以汞离子浓度为横坐标，δa＝a-a0为纵坐标作图，在一定线性范围内得到汞离子标准曲线，根据标准曲线即可测得未知样品的浓度。
64.图2为hg
2
存在和不存在时铁酸钴纳米材料过氧化物模拟酶催化活性的紫外吸收光谱，可以看出，汞离子的存在会显著的抑制铁酸钴催化tmb的反应。
65.图3为不同浓度汞离子在反应体系中的颜色变化图，汞离子浓度由高到低，颜色由深到浅。从实际对比图片中可以看出，当hg
2
的浓度从10nm-5μm时，反应体系有明显的颜色变化，因此通过目视反应体系颜色变化，也可对hg
2
浓度进行半定量检测。
66.图4为不同浓度hg
2
检测的线性关系图，图5为标准曲线图，该比色检测方法对于检测汞离子有良好的反应，hg
2
的检测范围为10-100nm，检测限为3nm，其线性方程为y＝0.98x 0.002，相关系数r2＝0.995。
67.图6和图7分别为磁性纳米酶的电镜图、磁性纳米酶与底物tmb结合时的电镜图，可以看出，本实施例中的磁性纳米酶分散性好，结晶度高，能够在水分充分的与底物tmb进行结合。
68.实施例8
69.实施例8-实施例13与实施例7的区别之处在于：调整hac-naac缓冲溶液的ph值分别为3.0、3.5、4.5、5.0、5.5和6。
70.图8为不同ph催化条件结果图，可以看出，实施例7中ph为4.0条件下，催化效果最佳。
71.实施例14-实施例17
72.实施例14-实施例17与实施例7的区别之处在于：调整步骤(3)中的孵育温度分别为20、25、35、40℃。
73.图9为不同温度催化条件结果图，可以看出，实施例7中温度为30℃条件下，催化效果最佳。
74.实施例18-实施例22
75.实施例18-实施例22与实施例7的区别之处在于：调整tmb溶液的孵浓度分别为0.1、0.3、0.5、0.8、0.9mm。
76.图10为不同tmb溶液浓度下催化条件结果图，可以看出，tmb溶液浓度为0.7mm时，催化效果最佳。
77.实施例23-实施例27
78.实施例23-实施例27与实施例7的区别之处在于：调整h2o2溶液的浓度分别为6、10、12、14、18mm。
79.图11为不同h2o2溶液浓度下催化条件结果图，可以看出，h2o2溶液浓度为16mm时，催化效果最佳。
80.实施例28
81.本实施例与实施例7的区别之处在于：调整半胱氨酸水溶液的体积为100μl。
82.实施例29
83.本实施例与实施例7的区别之处在于：调整汞离子溶液的体积为100μl。
84.实施例30
85.将实施例7、实施例28、实施例29中的磁性铁酸钴纳米酶洗净后重新干燥，按照之前一致的条件进行反应，测量其在652nm处的吸光度，验证其循环使用的高效性。
86.图12为实施例7磁性铁酸钴纳米酶回收重复利用效率结果图，可以看出，经过5次循环使用后，其模拟酶催化效率仍在80％以上，证明了该方法可以作为一种循环高效的检测汞离子的方法。
87.实施例31-实施例39
88.本实施例与实施例7的区别之处在于：将汞离子溶液分别替换成zn
2
、al
3
、cu
2
、na

、ca
2
、mg
2
、k

、pb
2
、ni
2
溶液。
89.图13为对于不同金属离子的选择性检测结果图，可以看出本发明对特异性检测汞离子的优越性。
90.对比例1
91.采用实施例2中的磁性纳米模拟酶检测亚硫酸根离子，检测方法同公开号为cn 111203221 a专利中的实施例7，将其中的铁酸钴纳米团簇模拟酶等量替换成本发明实施例2中的磁性纳米模拟酶。
92.经过检测发现其检测限为1*10-8
m，远远低于cn 111203221 a专利中的检测限5*10-6
m，其检测限较低。
93.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。