一种中药葫芦巴总黄酮和总皂苷有效部位同时提取挥发油的方法及其提取物和应用

1.本发明涉及总黄酮和总皂苷提取方法领域，特别涉及一种中药葫芦巴总黄酮和总皂苷有效部位同时提取挥发油的方法及其提取物和应用。


背景技术：

2.葫芦巴(trigonella foenum-graecum l.)系豆科蝶形花亚科葫芦巴属一年生草本植物，俗称苦豆、芦巴、胡巴、季豆、香豆子等。其属植物共70余种，主要分布在亚洲、非洲和地中海地区。葫芦巴最早起源于中亚，目前印度是其主要的生产国，距今已有4000多年的使用历史。我国的本属植物5种，其中葫芦巴 (trigonella foenum-graecum l.)资源最为丰富，主产于河南、安徽、四川等地,且在东三省、河北、河南、浙江、湖北、贵州、陕西、甘肃、宁夏及新疆等地均有栽培。我国历代的本草著作中均收录有葫芦巴,其入肝、肾二经,味苦、性温,无毒,具有补肾阳、祛寒湿之功效。葫芦巴属于常用中药材之一，目前常将其作为补肾药、祛(肠)风药和健胃药使用。《本草纲目》记载葫芦巴有祛寒行气的功效，可以治疗小肠气痛等疾病。其种子供药用，能补肾壮阳，祛痰除湿，已被用作许多疾病的传统治疗剂，如肠疾病、痛风、疗伤及炎症、高血脂和糖尿病等。葫芦巴属药食同源之品，在医药上葫芦巴及其提取物具有多种药理作用，如降低血糖、调节血脂、抗肿瘤，改善2型糖尿病患者胰岛素抵抗，保护糖尿病肾病肾损伤，保护肾病综合征大鼠肾损伤；同时可作为烹饪用蔬菜，国家烹饪协会已将其列为特种滋补保健蔬菜品种之一。
3.相关研究表明,葫芦巴中主要含有皂苷、黄酮、生物碱、香豆素以及氨基酸、多糖等，其中已发现的皂苷、生物碱和黄酮三类物质就超过50个，包括含量较为丰富的呋甾醇皂苷、薯蓣皂苷、雅姆皂苷等成分。其总黄酮有效部位被证实具有抗氧化、抗抑郁等药理活性，同时对糖尿病、高血脂、围绝经期综合征等有明显的治疗作用；总皂苷有效部位具有抗癌、保护心肌、护肝、抗脑缺血等作用，对糖尿病足、心肌纤维化、脂肪肝等疾病均有良好功效。同时，涉及葫芦巴总黄酮、总皂苷有效部位的提取研究较为丰富，工艺已较为成熟，例如采用超滤法分离技术、膜分离与树脂法联用技术等分离获得葫芦巴总皂苷，采用亚临界醇提法、超声波辅助法、渗漉提取法等获得其总黄酮有效部位。例如，中国专利cn201811254253.6：一种从葫芦巴中提取葫芦巴提取物的方法及应用，该专利通过多次回流提取从葫芦巴中提取总黄酮；中国专利 cn201210232186.4：胡芦巴总黄酮有效部位制备及应用，该发明在提取过程中先采用渗漉提取法，提取液经乙酸乙酯脱脂后，用大孔吸附树脂进行纯化制得葫芦巴总黄酮有效部位。上述专利，只能单一提取葫芦巴中的总黄酮有效部位，因此本发明提出一种同时获得葫芦巴总黄酮和总皂苷有效部位的提取方法。


技术实现要素：

4.鉴以此，本发明提出一种中药葫芦巴总黄酮和总皂苷有效部位同时提取挥发油的方法及其提取物和应用，本发明可以同时对葫芦巴总黄酮和总皂苷的有效部位进行提取。
5.本发明的技术方案是这样实现的：
6.包括以下步骤：
7.s1、将葫芦巴种子剥皮，制得剥皮后的种仁，将剥皮后的种仁以水蒸气蒸馏法蒸馏提取5-7h，重复提取2-4次，制得葫芦巴精油和葫芦巴水煮液。
8.s2、将葫芦巴水煮液静置，过滤，制得葫芦巴过滤提取物，加入乙醇溶液，静置2-4h，制得絮状沉淀物和葫芦巴水提物。
9.s3、葫芦巴水提物加入乙醇溶液析出沉淀，制得第一沉淀和第一上清液。
10.s4、将体积分数为60-80％的乙醇溶液溶液加入第一沉淀中，浸泡14-18h，回流提取2-4次，每次提取时间为1.5-2.5h，合并提取液，将提取液减压浓缩，制得总提物。
11.s5、将蒸馏水加入总提物中，制得总提物水溶液，过滤，依次使用聚酰胺树脂和大孔树脂洗脱，纯水为洗脱剂，收集洗脱液。
12.s6、将s5制得的洗脱液使用聚酰胺树脂洗脱，甲醇为洗脱剂，持续洗脱至无色，收集洗脱液，洗脱液使用多级闪蒸浓缩仪浓缩为浸膏，浸膏喷雾干燥，制得总黄酮有效部位。
13.s7、将s5制得的洗脱液使用聚酰胺树脂和大孔树脂洗脱，乙醇溶液为洗脱剂，收集洗脱剂，洗脱液使用多级闪蒸浓缩仪浓缩为浸膏，浸膏喷雾干燥，制得总皂苷有效部位。
14.进一步的，步骤s2中，所述乙醇溶液和葫芦巴过滤提取物的质量比为4:1。
15.进一步的，步骤s2中，所述乙醇溶液体积分数为28％-32％。
16.进一步的，步骤s2中，所述乙醇溶液体积分数为30％。
17.进一步的，步骤s3中，所述乙醇溶液和葫芦巴水提物质量比为2:1。
18.进一步的，步骤s3中，所述乙醇溶液体积分数为18％-22％。
19.进一步的，步骤s3中，所述乙醇溶液体积分数为20％。
20.进一步的，步骤s4中，所述乙醇溶液和第一沉淀质量比为2:1。
21.进一步的，步骤s4中，所述减压浓缩至总提物密度为0.8-1.0g/ml。
22.进一步的，步骤s5中，所述使用纯水的洗脱流速为3ml/min。
23.进一步的，步骤s7中，所述乙醇溶液的体积分数为95％。
24.进一步的，步骤s2中，所述絮状沉淀物为葫芦巴总多糖，步骤s3中，所述第一上清液浓缩干燥后制得葫芦巴总多糖。
25.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的提取方法可以从葫芦巴种子、熟葫芦巴种子和葫芦巴全草同时提取葫芦巴总黄酮和总皂苷有效部位，提取过程中同时制得葫芦巴精油和葫芦巴总多糖。制备方法简单，采用低级性溶剂充分提取，使葫芦巴中总黄酮和总皂苷有效部位富集，易于操作，成本低廉。
26.本发明制得的葫芦巴总黄酮应用在制备治疗糖尿病的药物中，葫芦巴总皂苷应用在制备治疗脂肪肝的药物中，葫芦巴精油具有还原能力，对枯草芽胞杆菌、大肠杆菌、金黄葡萄球菌、青霉、毛霉种菌和曲霉具有抑制作用，葫芦巴多糖具有较强的抗氧化性。
附图说明
27.图1采用检测波长为254nm的荧光显色结果；
28.图中1葫芦巴种子总皂苷，2葫芦巴种子总黄酮，3熟葫芦巴种子总黄酮，4熟葫芦巴种子总皂苷，5 葫芦巴全草总黄酮，6葫芦巴全草总皂苷。
29.图2采用5％硫酸-乙醇溶液显色结果；
30.图中1葫芦巴种子总皂苷，2葫芦巴种子总黄酮，3熟葫芦巴种子总黄酮，4熟葫芦巴种子总皂苷，5 葫芦巴全草总黄酮，6葫芦巴全草总皂苷。
具体实施方式
31.为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
32.本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
33.本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
34.实施例1
35.(1)葫芦巴种子剥皮，制得剥皮后的种仁，将剥皮后的种仁以水蒸气蒸馏法蒸馏提取6h，重复提取 3次，制得葫芦巴精油和葫芦巴水煮液。
36.(2)将葫芦巴水煮液静置，过滤，制得葫芦巴过滤提取物，加入体积分数为30％的乙醇溶液，乙醇溶液和葫芦巴过滤提取物的质量比为4:1，静置3h，制得絮状沉淀物和葫芦巴水提物。
37.(3)葫芦巴水提物加入体积分数为20％的乙醇溶液中析出沉淀，葫芦巴水提物和乙醇溶液体积比为 1:2，制得第一沉淀和第一上清液。
38.(4)将体积分数为70％的乙醇溶液溶液加入第一沉淀中，第一沉淀和乙醇溶液的质量比为2:1，浸泡 16h，回流提取3次，每次提取时间为2h，合并提取液，将提取液减压浓缩至密度为0.9g/ml，制得总提物。
39.(5)将总提物加入蒸馏水中，制得总提物水溶液，过滤，依次使用聚酰胺树脂和大孔树脂洗脱，洗脱流速为3ml/min，纯水为洗脱剂，收集洗脱液。
40.(6)将步骤(5)制得的洗脱液使用聚酰胺树脂洗脱，甲醇为洗脱剂，持续洗脱至无色，收集洗脱液，洗脱液使用多级闪蒸浓缩仪浓缩为浸膏，浸膏喷雾干燥，制得总黄酮有效部位。
41.(7)将步骤(5)制得的洗脱液使用聚酰胺树脂和大孔树脂洗脱，使用体积分数为95％的乙醇溶液为洗脱剂，收集洗脱液，洗脱液使用多级闪蒸浓缩仪浓缩为浸膏，浸膏喷雾干燥，制得总皂苷有效部位。
42.实施例2
43.(1)葫芦巴种子剥皮，制得剥皮后的种仁，将剥皮后的种仁以水蒸气蒸馏法蒸馏提取5h，重复提取 2次，制得葫芦巴精油和葫芦巴水煮液。
44.(2)将葫芦巴水煮液静置，过滤，制得葫芦巴过滤提取物，加入体积分数为28％的乙醇溶液，乙醇溶液和葫芦巴过滤提取物的质量比为4:1，静置2h，制得絮状沉淀物和葫芦巴水提物。
45.(3)葫芦巴水提物加入体积分数为18％的乙醇溶液中析出沉淀，葫芦巴水提物和乙醇溶液体积比为 1:2，制得第一沉淀和第一上清液。
46.(4)将体积分数为60％的乙醇溶液溶液加入第一沉淀中，第一沉淀和乙醇溶液的质量比为2:1，浸泡 14h，回流提取2次，每次提取时间为1.5h，合并提取液，将提取液减压浓缩至密度为0.8g/ml，制得总提物。
47.(5)将总提物加入蒸馏水中，制得总提物水溶液，过滤，依次使用聚酰胺树脂和大
孔树脂洗脱，洗脱流速为3ml/min，纯水为洗脱剂，收集洗脱液。
48.(6)将步骤(5)制得的洗脱液使用聚酰胺树脂洗脱，甲醇为洗脱剂，持续洗脱至无色，收集洗脱液，洗脱液使用多级闪蒸浓缩仪浓缩为浸膏，浸膏喷雾干燥，制得总黄酮有效部位。
49.(7)将步骤(5)制得的洗脱液使用聚酰胺树脂和大孔树脂洗脱，使用体积分数为95％的乙醇溶液为洗脱剂，收集洗脱液，洗脱液使用多级闪蒸浓缩仪浓缩为浸膏，浸膏喷雾干燥，制得总皂苷有效部位。
50.实施例3
51.(1)葫芦巴种子剥皮，制得剥皮后的种仁，将剥皮后的种仁以水蒸气蒸馏法蒸馏提取7h，重复提取 4次，制得葫芦巴精油和葫芦巴水煮液。
52.(2)将葫芦巴水煮液静置，过滤，制得葫芦巴过滤提取物，加入体积分数为32％的乙醇溶液，乙醇溶液和葫芦巴过滤提取物的质量比为4:1，静置4h，制得絮状沉淀物和葫芦巴水提物。
53.(3)葫芦巴水提物加入体积分数为22％的乙醇溶液中析出沉淀，葫芦巴水提物和乙醇溶液体积比为 1:2，制得第一沉淀和第一上清液。
54.(4)将体积分数为80％的乙醇溶液溶液加入第一沉淀中，第一沉淀和乙醇溶液的质量比为2:1，浸泡18h，回流提取4次，每次提取时间为2.5h，合并提取液，将提取液减压浓缩至密度为0.8g/ml，制得总提物。
55.(5)将总提物加入蒸馏水中，制得总提物水溶液，过滤，依次使用聚酰胺树脂和大孔树脂洗脱，洗脱流速为3ml/min，纯水为洗脱剂，收集洗脱液。
56.(6)将步骤(5)制得的洗脱液使用聚酰胺树脂洗脱，甲醇为洗脱剂，持续洗脱至无色，收集洗脱液，洗脱液使用多级闪蒸浓缩仪浓缩为浸膏，浸膏喷雾干燥，制得总黄酮有效部位。
57.(7)将步骤(5)制得的洗脱液使用聚酰胺树脂和大孔树脂洗脱，使用体积分数为95％的乙醇溶液为洗脱剂，收集洗脱液，洗脱液使用多级闪蒸浓缩仪浓缩为浸膏，浸膏喷雾干燥，制得总皂苷有效部位。
58.试验例1
59.以实施例1的中药葫芦巴总黄酮和总皂苷有效部位同时提取挥发油的方法进行试验。
60.(1)收率计算
61.葫芦巴原料药材1kg，得精油1-2ml，密度0.85-0.95mg/ml。取其种子原药材(233g)、煅炒过的葫芦巴种子(70g)及其全草(256g)以相同流程分别进行提取，收率结果如下表。
62.提取率(％)＝提取物总重量/原料重量
×
100
63.总黄酮收率(％)＝总黄酮有效部位提取量/原料重量
×
100
64.总皂苷收率(％)＝总皂苷有效部位提取量/原料重量
×
100
65.表1葫芦巴种子、熟葫芦巴种子和葫芦巴全草的总提取率、总黄酮收率和总皂苷收率
[0066][0067][0068]
(2)薄层色谱(tlc)检测
[0069]
实验方法：以二氯甲烷：甲醇：水＝95:35:4为展开剂，分别使用波长254nm、5％硫酸-乙醇溶液进行显色。
[0070]
参见图1至图2，实验结果表明，本发明的制备方法能够从葫芦巴种子、熟葫芦巴种子和葫芦巴全草中提取总皂苷有效部位和总黄酮有效部位。
[0071]
(3)液质联用(lc-ms)检测
[0072]
采用高效液相色谱－四极杆－飞行时间质谱法(hplc－q－tof ms)对葫芦巴种子、熟葫芦巴种子和葫芦巴全草中提取的总皂苷有效部位和总黄酮有效部位进行定性分析。将所得各部位干燥，分别称取一定量以甲醇充分溶解，过滤后定容，采用超高效液相色谱-质谱联用技术(uplc-ms)分析。液相色谱条件：waters acquity uplc beh c18 column(3.0mm
×
100mm,1.7μm,waters,usa)，柱温30℃，pda检测器254nm，甲醇(a)-水为流动相，梯度洗脱，0min,5％(v/v)a；30min,90％(v/v)a；40min,90％(v/v) a，流速0.2ml
·
min-1
,进样量5μl。质谱条件：esi源，正离子模式，吹扫气体流速600l
·
h-1
，温度350℃, 锥孔气体流速50l
·
h-1
，离子源温度110℃，锥孔电压30v，数据扫描范围m/z 50-3000。
[0073]
表2.葫芦巴种子总黄酮部位检测结果
[0074][0075]
表3.葫芦巴种子总皂苷部位检测结果
[0076][0077]
表4.熟葫芦巴种子总黄酮部位检测结果
[0078]
[0079][0080]
表5.熟葫芦巴种子总皂苷部位检测结果
[0081][0082]
表6.葫芦巴全草总黄酮部位检测结果
[0083][0084]
表7.葫芦巴全草总皂苷部位检测结果
[0085][0086]
实验结果表明，本发明的制备方法制得的产物为总黄酮和总皂苷。
[0087]
(4)本发明制得的葫芦巴精油、葫芦巴总多糖、总黄酮有效部位和总皂苷有效部位的应用
[0088]
葫芦巴精油活性研究
[0089]
采用铁氰化钾还原法评价样品还原能力。在不同质量浓度的样品溶液中加入2.5ml(0.2mol/l，ph6.6) 磷酸盐缓冲液，加入2.5ml质量分数1％六氰合铁酸钾溶液，混匀，50℃恒温20min，快速冷却后加入2.5ml 质量分数10％三氯乙酸，3000r/min离心10min，取上清液2.5ml，依次加入2.5ml蒸馏水，0.5ml质量分数0.1％三氯化铁，于700nm处测定吸光度，以吸光度表示还原能力，然后根据回归方程计算ec
50
(ec
50
为吸光度为0.5时对应的质量浓度)。
[0090]
以无水乙醇溶液为溶剂配制质量浓度为0.025mg/ml的dpph溶液和质量浓度为0.2mg/ml的vc溶液。以无水乙醇溶液为溶剂先配制0.1mg/ml的葫芦巴精油油溶液，然后稀释成0.01mg/ml、0.02mg/ml、 0.03mg/ml、0.04mg/ml和0.05mg/ml的溶液备用。以无水乙醇
溶液为对照，取dpph溶液2.5ml与2.5ml 无水乙醇溶液混合，测定溶液在517nm的吸光度(a0)。精确吸取上述不同质量浓度的精油溶液2.5ml，与质量浓度0.025mg/ml的dpph溶液2.5ml混合，摇匀后放置30min。以无水乙醇溶液为对照，测定上述溶液在最大吸收峰处吸光度(ai)；精确吸取上述不同质量浓度精油溶液2.5ml，分别与2.5ml无水乙醇溶液混合均匀后，以无水乙醇溶液为对照，测定各溶液在最大吸收峰波长处的吸光度(aj)，分别测得aj，按下式计算清除率：
[0091][0092]
并得到在一定质量浓度范围内的回归方程，通过线性方程计算ic
50
(自由基清除率为50％时所对应的样液质量浓度)。
[0093]
精确称取3.00g猪油，配制不同浓度的样品溶液，用743型rancimat仪110℃、空气流量20l/h下测定其诱导时间，诱导时间越长，说明油样抗氧化性能越好。用同质量浓度vc溶液做对比试验。
[0094]
另将所需实验菌种悬液稀释106倍，以该菌悬液为实验菌进行接种，计数，根据菌悬液浓度调试所用实验菌种的比浊度，加入样品制取抑菌片，接种，37℃恒温培养，规定时间内观察抑菌效果。
[0095]
结果显示，葫芦巴精油有较强的还原能力(ec
50
＝0.6132g/l)，对dpph自由基有较强的清除能力 (ic
50
＝0.0451g/l)，当质量浓度为200mg/l时对猪油的抗氧化活性最强，但其抗氧化活性小于同质量浓度的维生素c；另外，葫芦巴精油对枯草芽胞杆菌、大肠杆菌、金黄葡萄球菌、青霉、毛霉种菌有较强的抑制效果，对黑曲霉也有一定的抑制作用，对其最低抑制浓度分别为：枯草芽胞杆菌0.4g/l，大肠杆菌、金黄葡萄球菌和青霉为0.5g/l，毛霉为0.6g/l，黑曲霉为1.0g/l。
[0096]
葫芦巴多糖有效部位活性研究
[0097]
取0.0625-1.0mg/ml多糖溶液100和300μl反应体系于37℃反应1min，迅速加入1ml显色剂，室温放置20min，取200μl加入96孔微量反应板。蒸馏水代替多糖溶液的反应体系为空白，并设置本底对照，使用酶标仪检测550nm波长处的吸光值，计算样品对羟基自由基的清除率。并得到在一定质量浓度范围内的回归方程，通过线性方程计算ec
50
(自由基清除率为50％时所对应的样液质量浓度)。
[0098]
取0.0625-4.0mg/ml多糖溶液25和650μl反应体系于37℃反应40min，加入1ml显色剂，室温放置10min后取200μl加入96孔微量反应板。蒸馏水代替多糖溶液的反应体系为空白，并设置本底对照，使用酶标仪检测550nm波长处的吸光值，计算样品对超氧阴离子的清除率。并得到在一定质量浓度范围内的回归方程，通过线性方程计算ec
50
(自由基清除率为50％时所对应的样液质量浓度)。
[0099]
结果显示，葫芦巴多糖具有较好的抗氧化性，即较强的清除dpph自由基能力(ic
50
＝0.842mg/ml)，对羟基自由基有一定的清除作用(ec
50
＝2.418mg/ml)，对超氧阴离子有一定的清除能力(ec
50
＝2.528mg /ml)。
[0100]
葫芦巴总黄酮有效部位活性研究
[0101]
葫芦巴总黄酮具有优异的抗氧化能力，对dpph自由基具有极强的清除能力(ic
50
＝0.0703mg/ml)。在以腹腔注射链脲佐菌素(50mg/kg)的糖尿病模型大鼠中，以糖尿病组、阳
性对照组和葫芦巴总黄酮治疗组给药，以饮用水为空白对照组，每日灌胃1次，持续6周，观察其对糖尿病大鼠血糖的影响，结果如下表：
[0102]
表8.葫芦巴总黄酮有效部位对糖尿病大鼠血糖影响的时效关系
[0103][0104]
注：与糖尿病组比较，
*
p《0.05，
**
p《0.01；与对照组相比，
△
p《0.05，
△△
p《0.01。
[0105]
实验结果表明，本发明制得的总黄酮能够应用于糖尿病的治疗，有效抑制血糖上升。
[0106]
葫芦巴总皂苷有效部位活性研究
[0107]
采用葫芦巴总皂苷有效部位提取物喂养酒精所致脂肪肝模型大鼠，以复方水飞蓟片(300mg/kg)为阳性对照药，以生理盐水灌胃为正常对照组，随机以高、中、低剂量葫芦巴总皂苷分组给药，结果显著降低大鼠血清总胆固醇(tc)，低密度脂蛋白(ldl-c)和总胆红素(t bili)水平，降低肝天冬氨酸氨基转移酶(ast)和丙氨酸氨基转移酶(alt)的活性(p《0.01)，具有降血脂、降酶保肝的药理作用，结果如表8-10。
[0108]
表9.葫芦巴总皂苷对酒精脂肪肝大鼠血清tc、ldl水平影响(mmol/l,)
[0109][0110][0111]
注：与正常组比较，
*
p《0.05，
**
p《0.01；与模型组相比，
▲
p《0.05，
▲▲
p《0.01；与阳性对照组相比，
#
p《0.05，
##
p《0.01.
[0112]
表10.葫芦巴总皂苷对酒精脂肪肝大鼠血清alt、ast、t bili水平影响
[0113][0114]
注：与正常组比较，
*
p《0.05，
**
p《0.01；与模型组相比，
▲
p《0.05，
▲▲
p《0.01；与阳性对照组相比，
#
p《0.05，
##
p《0.01.
[0115]
实验结果表明，本发明制得的葫芦巴总皂苷，具有降血脂、降酶保肝的功效，能够应用由酒精导致的脂肪肝。
[0116]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。