用于分离猴血中抗rhsa的酸解液、方法及猴血中抗rhsa抗药抗体的检测方法
技术领域
1.本发明属于生物药免疫原性检测领域，具体而言，涉及一种用于分离猴血中抗rhsa的酸解液、方法及猴血中抗rhsa抗药抗体的检测方法。
背景技术：
2.自1982年首个重组蛋白类药物批准上市以来，目前国内外共有260多种治疗性重组蛋白类药物(包括70多种治疗性单抗药物)在临床上得到了广泛应用，用于230多种适应证的治疗(nat biotechnol,2014.32(10):p.992-1000；health aff(millwood),2015.34(2):p.210-9)。随着对治疗性重组蛋白药物的研究越来越深入，对相关药物给药过程中产生的抗体即抗药抗体(anti-drug antibody，ada)的研究越来越受到重视。抗药抗体的产生，会对治疗性重组蛋白类药物的安全性和有效性带来影响，因此ada的检测是临床用药过程中需要密切关注的指标。
3.在重组人血白蛋白药物的临床前评价阶段，一般用猴子做临床前的安全性评价，针对重组人血白蛋白(rhsa)的免疫原性分析的方案是，把重组人血白蛋白药物注射到猴子体内，用药数月后，抽取猴子血液，检测用药的猴子血中是否产生抗rhsa抗体(ada)，检测时会用一个兔抗或鼠抗rhsa稀释在正常猴血里作为阳性对照。而针对猴血中抗rhsa抗体的检测，尚未有较为完善的方案，也没有能检出毫克级耐药性的方法。
技术实现要素：
4.申请人发现，因为猴血白蛋白的氨基酸组成及蛋白结构和人血白蛋白的高度相似，这就使得加到猴血里的抗rhsa阳性对照和猴血白蛋白结合在一起，无法再和rhsa结合，因为猴血中猴血白蛋白的含量高达600mg/ml，因此常规的酸化方法无法将阳性对照中的抗rhsa与猴血白蛋白分离，也就无法对阳性对照中的抗rhsa进行检测，从而也就不能对实验样品中抗rhsa的水平进行定量。
5.为了解决上述问题，本发明第一方面提供了一种用于分离猴血中抗rhsa的酸解液，包含羧基化蛋白、非离子型表面活性剂和酸性ph缓冲剂，所述ph缓冲剂的缓冲范围为ph4～6。
6.相对于现有技术，本发明的酸解液使用了缓冲范围为ph4～6的ph缓冲剂提供了一种弱酸环境，非离子型表面活性剂的解离效果较为温和,用于打开rhsa和猴血白蛋白的连接，羧基化蛋白对于带阳离子的抗rhsa的结合能力比猴血白蛋白强，以促进打开抗rhsa抗体与猴血白蛋白的复合物。在羧基化蛋白、非离子表面活性剂和酸性ph缓冲剂的条件下，可以实现更好的解离效果，同时可以保持较好的抗rhsa抗体活性，并且具有更高的灵敏度和耐药性。
7.进一步的，羧基化蛋白为羧基化bsa，非离子型表面活性剂为np40，酸性ph缓冲剂为mes。羧基化bsa具有与猴血白蛋白的类似结构，并且带有丰富的负离子，可以更好的发挥
与猴血白蛋白竞争性吸附抗rhsa的作用，np40和mes与羧基化bsa的结合可以产生协同作用，获得更好的解离效果。
8.进一步的，以重量分数计，包含0.2～5％的所述羧基化bsa、0.01～2％的所述np40和1.065～10.65％的所述mes。进一步的，以重量分数计，包含0.5～2％的所述羧基化bsa、0.1～1％的所述np40和1.065～4.26％的所述mes。进一步的，以重量分数计，包含1％的所述羧基化bsa、0.5％的所述np40和2.13％的所述mes。
9.本发明第二方面提供了一种用于分离猴血中抗人白蛋白抗体的方法，包含使用上述酸解液对所述猴血进行解离得到第一解离液，然后降低所述第一酸解液的ph进行反应得到第二解离液。
10.相对于现有技术，本发明的用于分离猴血中抗人白蛋白抗体的方法，使用了包含羧基化蛋白、非离子型表面活性剂和酸性ph缓冲剂，所述ph缓冲剂的缓冲范围为ph4～6的解离液对猴血进行初步的、温和的解离得到第一解离液，并通过降低第一解离液的ph进行彻底的解离得到第二解离液，通过两步酸解，在保证抗rhsa-猴血白蛋白复合物充分解离的同时，还能够很好的维持抗rhsa的活性，并且具有更高的灵敏度和耐药性。
11.本发明第三方面提供了一种猴血中抗rhsa抗药抗体的检测方法，包含下述步骤，
12.制备阳性对照样品：以包含外源性抗rhsa抗体的猴血为阳性对照组；
13.解离步骤：向所述阳性对照组中加入上述任一项酸解液进行一次解离反应；
14.磁珠吸附与分离：使用rhsa磁珠对经过所述解离步骤处理后的所述阳性对照组进行磁珠吸附，磁珠清洗与磁珠分离，得到去除猴血白蛋白的提取液；
15.上机检测。
16.相对于现有技术，本发明的猴血中抗rhsa抗药抗体的检测方法，通过使用保护性的酸解液对阳性对照组进行一次解离反应，从而将阳性对照组中与猴血白蛋白结合的外源性抗rhsa抗体与猴血白蛋白分离，并且不会影响外源性抗rhsa抗体的活性，随后使用了rhsa磁珠(优选的为带有oh基团的rhsa磁珠)富集分离抗rhsa，去除待检样品中的猴血白蛋白，从而解决了阳性对照组中抗rhsa抗体无法检测的问题，由此可以对阳性对照组中抗rhsa抗体进行准确定量，从而可以对含有内源性抗rhsa的实验组进行定量检测，并且具有更高的灵敏度和耐药性。
17.进一步的，于所述一次解离反应后降低所述阳性对照组的ph以进行二次解离反应。通过解离液对猴血进行初步的、温和的一次解离，并通过较低ph环境下的二次解离对抗rhsa-猴血白蛋白复合物进行彻底的解离，两个解离步骤的结合，在保证抗rhsa-猴血白蛋白复合物充分解离的同时，还能够很好的维持抗rhsa的活性。
18.进一步的，rhsa磁珠包含oh基团和用于标记rhsa的nh2基团。oh基团在上述保护性的酸解液中带负电荷，而抗rhsa带正电荷，所以oh基团具有对抗rhsa的吸附作用，可以增强从猴血中竞争性提取抗rhsa的能力；而rhsa分子含有较多的cooh，cooh在edc存在的条件下可以与nh2共价结合，故选择nh2作为标记rhsa的结合基团，标记效率远高于其它基团。使用同时含有oh基团和nh2基团的磁珠，可以产生协同作用，更好的发挥对抗rhsa的富集提取作用。
19.进一步的，使用纳米磁珠化学发光桥接法进行所述上机检测。纳米磁珠化学发光桥接法具有较高的特异性和灵敏度，可以进一步提高抗rhsa抗药抗体的检测效果。纳米磁
珠化学发光桥接法检测抗rhsa抗体具有较高的特异性和灵敏度，和其它步骤具有协同作用。
具体实施方式
20.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
21.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。除非另有说明，否则本文所使用的各组试剂均可通过市售获得。下述样品保护酸化液即酸解液。
22.实施例1
23.第一步，各种试剂的制备。
24.1.制备样品保护酸化液。
25.配方为：1％cooh-bsa、0.5％np40和2.13％mes，使用超纯水作为溶剂。
26.2.制备分离磁珠。
27.用edc一步法制备rhsa标记磁珠，edc使用浓度为1％，磁珠浓度1％，磁珠同时包含oh基团和nh2基团。
28.3.制备rhsa-abei。
29.用edc一步法制备rhsa-abei结合物，edc用量2mg/ml。
30.4.rhsa-biotin的制备。
31.用nhs-biotin制备rhsa-biotin，biotin与rhsa分子数比10：1。
32.5.酸化液1的制备。
33.用纯化水将分析纯醋酸稀释成0.3m。
34.6.酸化液2的制备。
35.用甘氨酸盐酸配制0.1mph2.4缓冲液。
36.7.桥接混合液的制备。
37.由相同分子数的rhsa-biotin和rhsa-abei混合而成。
38.8.中和液的制备。
39.用分析纯tris和盐酸配成1mph11溶液。
40.第二步，抗rhsa抗药抗体的检测方法是：
41.1.制备样品：将兔抗-rhsa加入猴血中，终浓度为250ng/ml，作为阳性对照组样品；在250ng/ml兔抗-rhsa样品中加入rhsa，终浓度为1mg/ml，作为耐药性测试组；并以未添加兔抗rhsa的猴血作为空白基底。
42.2.将15μl样本和15μl样品保护酸化液混合，涡匀，室温静置反应30分钟，此为一次解离反应。
43.3.加入200μl酸化液1，涡匀，室温静置反应20分钟，此为二次解离反应。
44.4.加入30μl rhsa分离磁珠，吹一下，再加入50μl中和液，涡一下。
45.5.然后转移到1号深孔板内，混匀仪放下磁棒套60转速40分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转3分钟。
46.6.将磁珠转移到深孔板2号加入900μl洗液，放下磁棒套90转6分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转5分钟。
47.7.将磁珠转移到深孔板3号加入310μl酸化液2，放下磁棒套90转8分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转14分钟，去除磁珠。
48.8.取出200μl酸化样本室温静置20分钟，再加入55μl混合液和50μl中和液室温静置反应10分钟。
49.9.上全自动分子发光生物免疫分析仪(rightflare60)测试，仪器参数设置：样本100μl，sa磁珠20μl“一步法”孵育时间5分钟。
50.实施例2
51.第一步，各种试剂的制备。
52.1.制备样品保护酸化液。
53.配方为：1％羧基化bsa、0.5％曲拉通x-100和0.1mph7.2pbs，使用超纯水作为溶剂。
54.2.制备分离磁珠。
55.用edc一步法制备rhsa标记磁珠，edc使用浓度为1％，磁珠浓度1％，磁珠同时包含oh基团和nh2基团。
56.3.制备rhsa-abei。
57.用edc一步法制备rhsa-abei结合物，edc用量2mg/ml。
58.4.rhsa-biotin的制备
59.用nhs-biotin制备rhsa-biotin，biotin与rhsa分子数比10：1。
60.5.酸化液1的制备。
61.用纯化水将分析纯醋酸稀释成0.3m。
62.6.酸化液2的制备。
63.用甘氨酸盐酸配制0.1mph2.4缓冲液。
64.7.桥接混合液的制备。
65.由相同分子数的rhsa-biotin和rhsa-abei混合而成。
66.8.中和液的制备。
67.用分析纯tris和盐酸配成1mph11溶液。
68.第二步，抗rhsa抗药抗体的检测方法是：
69.1.制备样品：将兔抗-rhsa加入猴血中，终浓度为250ng/ml，作为阳性对照组样品；在250ng/ml兔抗-rhsa样品中加入rhsa，终浓度为1mg/ml，作为耐药性测试组；并以未添加兔抗rhsa的猴血作为空白基底。
70.2.将15μl样本和15μl样品保护酸化液混合，涡匀，室温静置反应30分钟，此为一次解离反应。
71.3.加入200μl酸化液1，涡匀，室温静置反应20分钟，此为二次解离反应。
72.4.加入30μl rhsa分离磁珠，吹一下，再加入50μl中和液，涡一下。
73.5.然后转移到1号深孔板内，混匀仪放下磁棒套60转速40分钟(磁棒套和磁棒分
离)，然后放下磁棒吸10转3分钟。
74.6.将磁珠转移到深孔板2号加入900μl洗液，放下磁棒套90转6分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转5分钟。
75.7.将磁珠转移到深孔板3号加入310μl酸化液2，放下磁棒套90转8分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转14分钟，去除磁珠。
76.8.取出200μl酸化样本室温静置20分钟，再加入55μl混合液和50μl中和液室温静置反应10分钟。
77.9.上全自动分子发光生物免疫分析仪(rightflare60)测试，仪器参数设置：样本100μl，sa磁珠20μl“一步法”孵育时间5分钟。
78.实施例3
79.第一步，各种试剂的制备。
80.1.制备样品保护酸化液。
81.配方为：0.4％cooh-bsa、0.04％np40和8％mes，使用超纯水作为溶剂。
82.2.制备分离磁珠。
83.用edc一步法制备rhsa标记磁珠，edc使用浓度为1％，磁珠浓度1％，磁珠同时包含oh基团和nh2基团。
84.3.制备rhsa-abei。
85.用edc一步法制备rhsa-abei结合物，edc用量2mg/ml。
86.4.rhsa-biotin的制备
87.用nhs-biotin制备rhsa-biotin，biotin与rhsa分子数比10：1。
88.5.酸化液1的制备。
89.用纯化水将分析纯醋酸稀释成0.3m。
90.6.酸化液2的制备。
91.用甘氨酸盐酸配制0.1mph2.4缓冲液。
92.7.桥接混合液的制备。
93.由相同分子数的rhsa-biotin和rhsa-abei混合而成。
94.8.中和液的制备。
95.用分析纯tris和盐酸配成1mph11溶液。
96.第二步，抗rhsa抗药抗体的检测方法是：
97.1.制备样品：将兔抗-rhsa加入猴血中，终浓度为250ng/ml，作为阳性对照组样品；在250ng/ml兔抗-rhsa样品中加入rhsa终浓度为1mg/ml，作为耐药性测试组；并以未添加兔抗rhsa的猴血作为空白基底。
98.2.将15μl样本和15μl样品保护酸化液混合，涡匀，室温静置反应30分钟，此为一次解离反应。
99.3.加入200μl酸化液1，涡匀，室温静置反应20分钟，此为二次解离反应。
100.4.加入30μl rhsa分离磁珠，吹一下，再加入50μl中和液，涡一下。
101.5.然后转移到1号深孔板内，混匀仪放下磁棒套60转速40分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转3分钟。
102.6.将磁珠转移到深孔板2号加入900μl洗液，放下磁棒套90转6分钟(磁棒套和磁棒
分离)，然后放下磁棒吸10转5分钟。
103.7.将磁珠转移到深孔板3号加入310μl酸化液2，放下磁棒套90转8分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转14分钟，去除磁珠。
104.8.取出200μl酸化样本室温静置20分钟，再加入55μl混合液和50μl中和液室温静置反应10分钟。
105.9.上全自动分子发光生物免疫分析仪(rightflare60)测试，仪器参数设置：样本100μl，sa磁珠20μl“一步法”孵育时间5分钟。
106.实施例4
107.第一步，各种试剂的制备。
108.1.制备样品保护酸化液。
109.配方为：0.5％cooh-bsa、0.1％np40和1.2％mes，使用超纯水作为溶剂。
110.2.制备分离磁珠。
111.用edc一步法制备rhsa标记磁珠，edc使用浓度为1％，磁珠浓度1％，磁珠同时包含oh基团和nh2基团。
112.3.制备rhsa-abei。
113.用edc一步法制备rhsa-abei结合物，edc用量2mg/ml。
114.4.rhsa-biotin的制备
115.用nhs-biotin制备rhsa-biotin，biotin与rhsa分子数比10：1。
116.5.酸化液1的制备。
117.用纯化水将分析纯醋酸稀释成0.3m。
118.6.酸化液2的制备。
119.用甘氨酸盐酸配制0.1mph2.4缓冲液。
120.7.桥接混合液的制备。
121.由相同分子数的rhsa-biotin和rhsa-abei混合而成。
122.8.中和液的制备。
123.用分析纯tris和盐酸配成1mph11溶液。
124.第二步，抗rhsa抗药抗体的检测方法是：
125.1.制备样品：将兔抗-rhsa加入猴血中，终浓度为250ng/ml，作为阳性对照组样品；在250ng/ml兔抗-rhsa样品中加入rhsa终浓度为1mg/ml，作为耐药性测试组；并以未添加兔抗rhsa的猴血作为空白基底。
126.2.将15μl样本和15μl样品保护酸化液混合，涡匀，室温静置反应30分钟，此为一次解离反应。
127.3.加入200μl酸化液1，涡匀，室温静置反应20分钟，此为二次解离反应。
128.4.加入30μl rhsa分离磁珠，吹一下，再加入50μl中和液，涡一下。
129.5.然后转移到1号深孔板内，混匀仪放下磁棒套60转速40分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转3分钟。
130.6.将磁珠转移到深孔板2号加入900μl洗液，放下磁棒套90转6分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转5分钟。
131.7.将磁珠转移到深孔板3号加入310μl酸化液2，放下磁棒套90转8分钟(磁棒套和
磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转14分钟，去除磁珠。
132.8.取出200μl酸化样本室温静置20分钟，再加入55μl混合液和50μl中和液室温静置反应10分钟。
133.9.上全自动分子发光生物免疫分析仪(rightflare60)测试，仪器参数设置：样本100μl，sa磁珠20μl“一步法”孵育时间5分钟。
134.实施例5
135.第一步，各种试剂的制备。
136.1.制备样品保护酸化液。
137.配方为：1％cooh-bsa、0.5％np40和2.13％mes，使用超纯水作为溶剂。
138.2.制备分离磁珠。
139.用edc一步法制备rhsa标记磁珠，edc使用浓度为1％，磁珠浓度1％，磁珠同时包含oh基团和nh2基团。
140.3.制备rhsa-abei。
141.用edc一步法制备rhsa-abei结合物，edc用量2mg/ml。
142.4.rhsa-biotin的制备
143.用nhs-biotin制备rhsa-biotin，biotin与rhsa分子数比10：1。
144.5.酸化液的制备。
145.用甘氨酸盐酸配制0.1mph2.4缓冲液。
146.6.桥接混合液的制备。
147.由相同分子数的rhsa-biotin和rhsa-abei混合而成。
148.7.中和液的制备。
149.用分析纯tris和盐酸配成1mph11溶液。
150.第二步，抗rhsa抗药抗体的检测方法是：
151.1.制备样品：将兔抗-rhsa加入猴血中，终浓度为250ng/ml，作为阳性对照组样品；在250ng/ml兔抗-rhsa样品中加入rhsa终浓度为1mg/ml，作为耐药性测试组；并以未添加兔抗rhsa的猴血作为空白基底。
152.2.将15μl样本和15μl样品保护酸化液混合，涡匀，室温静置反应30分钟，此为一次解离反应，检测一次解离反应的混合液的ph。
153.3.加入200μl双蒸水，涡匀，室温静置反应20分钟。
154.4.加入30μl rhsa分离磁珠，吹一下，再加入15μl中和液，涡一下。
155.5.然后转移到1号深孔板内，混匀仪放下磁棒套60转速40分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转3分钟。
156.6.将磁珠转移到深孔板2号加入900μl洗液，放下磁棒套90转6分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转5分钟。
157.7.将磁珠转移到深孔板3号加入310μl酸化液2，放下磁棒套90转8分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转14分钟，去除磁珠。
158.8.取出200μl酸化样本室温静置20分钟，再加入55μl混合液和50μl中和液室温静置反应10分钟。
159.9.上全自动分子发光生物免疫分析仪(rightflare60)测试，仪器参数设置：样本
100μl，sa磁珠20μl“一步法”孵育时间5分钟。
160.实施例6
161.第一步，各种试剂的制备。
162.1.制备样品保护酸化液。
163.配方为：1％cooh-bsa、0.5％np40和2.13％mes，使用超纯水作为溶剂。
164.2.制备分离磁珠。
165.用edc一步法制备rhsa标记磁珠，edc使用浓度为1％，磁珠浓度1％，磁珠同时包含oh基团和cooh基团，用磁珠的cooh和rhsa的nh2基团结合。
166.3.制备rhsa-abei。
167.用edc一步法制备rhsa-abei结合物，edc用量2mg/ml。
168.4.rhsa-biotin的制备。
169.用nhs-biotin制备rhsa-biotin，biotin与rhsa分子数比10：1。
170.5.酸化液1的制备。
171.用纯化水将分析纯醋酸稀释成0.3m。
172.6.酸化液2的制备。
173.用甘氨酸盐酸配制0.1mph2.4缓冲液。
174.7.桥接混合液的制备。
175.由相同分子数的rhsa-biotin和rhsa-abei混合而成。
176.8.中和液的制备。
177.用分析纯tris和盐酸配成1mph11溶液。
178.第二步，抗rhsa抗药抗体的检测方法是：
179.1.制备样品：将兔抗-rhsa加入猴血中，终浓度为250ng/ml，作为阳性对照组样品；在250ng/ml兔抗-rhsa样品中加入rhsa，终浓度为1mg/ml，作为耐药性测试组；并以未添加兔抗rhsa的猴血作为空白基底。
180.2.将15μl样本和15μl样品保护酸化液混合，涡匀，室温静置反应30分钟，此为一次解离反应。
181.3.加入200μl酸化液1，涡匀，室温静置反应20分钟，此为二次解离反应。
182.4.加入30μl rhsa分离磁珠，吹一下，再加入50μl中和液，涡一下。
183.5.然后转移到1号深孔板内，混匀仪放下磁棒套60转速40分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转3分钟。
184.6.将磁珠转移到深孔板2号加入900μl洗液，放下磁棒套90转6分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转5分钟。
185.7.将磁珠转移到深孔板3号加入310μl酸化液2，放下磁棒套90转8分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转14分钟，去除磁珠。
186.8.取出200μl酸化样本室温静置20分钟，再加入55μl混合液和50μl中和液室温静置反应10分钟。
187.9.上全自动分子发光生物免疫分析仪(rightflare60)测试，仪器参数设置：样本100μl，sa磁珠20μl“一步法”孵育时间5分钟。
188.实施例7
189.第一步，各种试剂的制备。
190.1.制备样品保护酸化液。
191.配方为：1％cooh-bsa、0.5％np40和2.13％mes，使用超纯水作为溶剂。
192.2.制备分离磁珠。
193.用edc一步法制备rhsa标记磁珠，edc使用浓度为1％，磁珠浓度1％，磁珠只带有nh2基团。
194.3.制备rhsa-abei。
195.用edc一步法制备rhsa-abei结合物，edc用量2mg/ml。
196.4.rhsa-biotin的制备。
197.用nhs-biotin制备rhsa-biotin，biotin与rhsa分子数比10：1。
198.5.酸化液1的制备。
199.用纯化水将分析纯醋酸稀释成0.3m。
200.6.酸化液2的制备。
201.用甘氨酸盐酸配制0.1mph2.4缓冲液。
202.7.桥接混合液的制备。
203.由相同分子数的rhsa-biotin和rhsa-abei混合而成。
204.8.中和液的制备。
205.用分析纯tris和盐酸配成1mph11溶液。
206.第二步，抗rhsa抗药抗体的检测方法是：
207.1.制备样品：将兔抗-rhsa加入猴血中，终浓度为250ng/ml，作为阳性对照组样品；在250ng/ml兔抗-rhsa样品中加入rhsa，终浓度为1mg/ml，作为耐药性测试组；并以未添加兔抗rhsa的猴血作为空白基底。
208.2.将15μl样本和15μl样品保护酸化液混合，涡匀，室温静置反应30分钟，此为一次解离反应。
209.3.加入200μl酸化液1，涡匀，室温静置反应20分钟，此为二次解离反应。
210.4.加入30μl rhsa分离磁珠，吹一下，再加入50μl中和液，涡一下。
211.5.然后转移到1号深孔板内，混匀仪放下磁棒套60转速40分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转3分钟。
212.6.将磁珠转移到深孔板2号加入900μl洗液，放下磁棒套90转6分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转5分钟。
213.7.将磁珠转移到深孔板3号加入310μl酸化液2，放下磁棒套90转8分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转14分钟，去除磁珠。
214.8.取出200μl酸化样本室温静置20分钟，再加入55μl混合液和50μl中和液室温静置反应10分钟。
215.9.上全自动分子发光生物免疫分析仪(rightflare60)测试，仪器参数设置：样本100μl，sa磁珠20μl“一步法”孵育时间5分钟。
216.对比例1
217.第一步，各种试剂的制备。
218.1.制备样品保护酸化液。
219.配方为：1％bsa、0.5％np40和2.13％mes，使用超纯水作为溶剂。
220.2.制备分离磁珠。
221.用edc一步法制备rhsa标记磁珠，edc使用浓度为1％，磁珠浓度1％，磁珠同时包含oh基团和nh2基团。
222.3.制备rhsa-abei。
223.用edc一步法制备rhsa-abei结合物，edc用量2mg/ml。
224.4.rhsa-biotin的制备
225.用nhs-biotin制备rhsa-biotin，biotin与rhsa分子数比10：1。
226.5.酸化液1的制备。
227.用纯化水将分析纯醋酸稀释成0.3m。
228.6.酸化液2的制备。
229.用甘氨酸盐酸配制0.1mph2.4缓冲液。
230.7.桥接混合液的制备。
231.由相同分子数的rhsa-biotin和rhsa-abei混合而成。
232.8.中和液的制备。
233.用分析纯tris和盐酸配成1mph11溶液。
234.第二步，抗rhsa抗药抗体的检测方法是：
235.1.制备样品：将兔抗-rhsa加入猴血中，终浓度为250ng/ml，作为阳性对照组样品；在250ng/ml兔抗-rhsa样品中加入rhsa，终浓度为1mg/ml，作为耐药性测试组；并以未添加兔抗rhsa的猴血作为空白基底。
236.2.将15μl样本和15μl样品保护酸化液混合，涡匀，室温静置反应30分钟，此为一次解离反应。
237.3.加入200μl酸化液1，涡匀，室温静置反应20分钟，此为二次解离反应。
238.4.加入30μl rhsa分离磁珠，吹一下，再加入50μl中和液，涡一下。
239.5.然后转移到1号深孔板内，混匀仪放下磁棒套60转速40分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转3分钟。
240.6.将磁珠转移到深孔板2号加入900μl洗液，放下磁棒套90转6分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转5分钟。
241.7.将磁珠转移到深孔板3号加入310μl酸化液2，放下磁棒套90转8分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转14分钟，去除磁珠。
242.8.取出200μl酸化样本室温静置20分钟，再加入55μl混合液和50μl中和液室温静置反应10分钟。
243.9.上全自动分子发光生物免疫分析仪(rightflare60)测试，仪器参数设置：样本100μl，sa磁珠20μl“一步法”孵育时间5分钟。
244.对比例2
245.第一步，各种试剂的制备。
246.1.制备样品保护酸化液。
247.配方为：1％cooh-bsa、0.5％sds和2.13％mes，使用超纯水作为溶剂。
248.2.制备分离磁珠。
249.用edc一步法制备rhsa标记磁珠，edc使用浓度为1％，磁珠浓度1％，磁珠同时包含oh基团和nh2基团。
250.3.制备rhsa-abei。
251.用edc一步法制备rhsa-abei结合物，edc用量2mg/ml。
252.4.rhsa-biotin的制备
253.用nhs-biotin制备rhsa-biotin，biotin与rhsa分子数比10：1。
254.5.酸化液1的制备。
255.用纯化水将分析纯醋酸稀释成0.3m。
256.6.酸化液2的制备。
257.用甘氨酸盐酸配制0.1mph2.4缓冲液。
258.7.桥接混合液的制备。
259.由相同分子数的rhsa-biotin和rhsa-abei混合而成。
260.8.中和液的制备。
261.用分析纯tris和盐酸配成1mph11溶液。
262.第二步，抗rhsa抗药抗体的检测方法是：
263.1.制备样品：将兔抗-rhsa加入猴血中，终浓度为250ng/ml，作为阳性对照组样品；在250ng/ml兔抗-rhsa样品中加入rhsa终浓度为1mg/ml，作为耐药性测试组；并以未添加兔抗rhsa的猴血作为空白基底。
264.2.将15μl样本和15μl样品保护酸化液混合，涡匀，室温静置反应30分钟，此为一次解离反应。
265.3.加入200μl酸化液1，涡匀，室温静置反应20分钟，此为二次解离反应。
266.4.加入30μl rhsa分离磁珠，吹一下，再加入50μl中和液，涡一下。
267.5.然后转移到1号深孔板内，混匀仪放下磁棒套60转速40分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转3分钟。
268.6.将磁珠转移到深孔板2号加入900μl洗液，放下磁棒套90转6分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转5分钟。
269.7.将磁珠转移到深孔板3号加入310μl酸化液2，放下磁棒套90转8分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转14分钟，去除磁珠。
270.8.取出200μl酸化样本室温静置20分钟，再加入55μl混合液和50μl中和液室温静置反应10分钟。
271.9.上全自动分子发光生物免疫分析仪(rightflare60)测试，仪器参数设置：样本100μl，sa磁珠20μl“一步法”孵育时间5分钟。
272.对比例3
273.第一步，各种试剂的制备。
274.1.制备样品保护酸化液。
275.配方为：1％cooh-bsa、0.5％np40和0.1m醋酸缓冲液，使用超纯水作为溶剂。
276.2.制备分离磁珠。
277.用传统的戊二醛二步法制备rhsa标记磁珠，戊二醛使用浓度10％，磁珠浓度1％，磁珠同时包含oh基团和nh2基团。
278.3.制备rhsa-abei。
279.用edc一步法制备rhsa-abei结合物，edc用量2mg/ml。
280.4.rhsa-biotin的制备
281.用nhs-biotin制备rhsa-biotin，biotin与rhsa分子数比10：1。
282.5.酸化液1的制备。
283.用纯化水将分析纯醋酸稀释成0.3m。
284.6.酸化液2的制备。
285.用甘氨酸盐酸配制0.1mph2.4缓冲液。
286.7.桥接混合液的制备。
287.由相同分子数的rhsa-biotin和rhsa-abei混合而成。
288.8.中和液的制备。
289.用分析纯tris和盐酸配成1mph11溶液。
290.第二步，抗rhsa抗药抗体的检测方法是：
291.1.制备样品：将兔抗-rhsa加入猴血中，终浓度为250ng/ml，作为阳性对照组样品；在250ng/ml兔抗-rhsa样品中加入rhsa终浓度为1mg/ml，作为耐药性测试组；并以未添加兔抗rhsa的猴血作为空白基底。
292.2.将15μl样本和15μl样品保护酸化液混合，涡匀，室温静置反应30分钟，此为一次解离反应。
293.3.加入200μl酸化液1，涡匀，室温静置反应20分钟，此为二次解离反应。
294.4.加入30μl rhsa分离磁珠，吹一下，再加入50μl中和液，涡一下。
295.5.然后转移到1号深孔板内，混匀仪放下磁棒套60转速40分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转3分钟。
296.6.将磁珠转移到深孔板2号加入900μl洗液，放下磁棒套90转6分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转5分钟。
297.7.将磁珠转移到深孔板3号加入310μl酸化液2，放下磁棒套90转8分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转14分钟，去除磁珠。
298.8.取出200μl酸化样本室温静置20分钟，再加入55μl混合液和50μl中和液室温静置反应10分钟。
299.9.上全自动分子发光生物免疫分析仪(rightflare60)测试，仪器参数设置：样本100μl，sa磁珠20μl“一步法”孵育时间5分钟。
300.对比例4
301.第一步，各种试剂的制备。
302.1.制备样品酸化液。
303.配方为：0.3m醋酸缓冲液，使用超纯水作为溶剂。
304.2.制备elisa sa包被板。
305.1ug/ml sa蛋白溶解在0.05m碳酸盐缓冲液里，每孔加100ul，4～8℃放置16小时。1％bsa37℃封闭1小时。甩干备用。
306.3.制备rhsa-hrp。
307.用高碘酸钠氧化法制备rhsa-hrp结合物，使用浓度0.5ug/ml。
308.4.rhsa-biotin的制备
309.用nhs-biotin制备rhsa-biotin，biotin与rhsa分子数比10：1。
310.5.桥接混合液的制备。
311.由相同分子数的rhsa-biotin和rhsa-hrp混合而成。
312.6.中和液的制备。
313.用分析纯tris和盐酸配成1mph11溶液。
314.7.显色剂市售
315.8.终止剂市售
316.第二步，抗rhsa抗药抗体的检测方法是：
317.1.制备样品：将兔抗-rhsa加入猴血中，终浓度为250ng/ml，作为阳性对照组样品；在250ng/ml兔抗-rhsa样品中加入rhsa终浓度为1mg/ml，作为耐药性测试组；并以未添加兔抗rhsa的猴血作为空白基底。
318.2.将30μl样本和270μl样品酸化液混合，涡匀，室温静置反应30分钟。
319.3.向步骤2中加入80μl中和液，涡一下，再加入100μl桥接混合液。
320.4.取步骤3液体100μl，加入到elisa sa包被板中，室温静置反应120分钟。
321.5.洗板5次，甩干，每孔加显色剂100μl，室温反应30分钟。
322.6.上酶标仪测定吸光度。
323.上述实施例和对比例的实验数据如表1所述。下述p/n值为各实验组中，阳性对照组与空白基底的检测信号均值的比值。
324.表1，各实施例与对比例的检测结果
325.组别阳性对照组(灵敏度p/n)耐药性测试组(灵敏度耐药度p/n)实施例11.481.32实施例21.251.09实施例31.201.17实施例41.231.16实施例51.201.15实施例61.181.13实施例71.181.09对比例11.081.05对比例21.060.98对比例31.101.08对比例40.971.01
326.根据表1的数据可知，实施例1～7明显好于对比例4，这是因为本发明的猴血中抗rhsa抗药抗体的检测方法，通过使用样品保护酸化液对阳性对照组进行一次解离反应，从而将阳性对照组中与猴血白蛋白结合的外源性抗rhsa抗体与猴血白蛋白分离，并且不会影响外源性抗rhsa抗体的活性。随后使用带有oh基的rhsa磁珠富集分离抗rhsa，去除待检样品中的猴血白蛋白，从而解决了阳性对照组中抗rhsa抗体无法检测的问题，由此可以对阳性对照组中抗rhsa抗体进行准确定量，从而可以对含有内源性抗rhsa的实验组进行定量检测。
327.由表1的数据可知，实施例1～7明显好于对比例1～3，这是因为本发明的酸解液使用了缓冲范围为ph4～6的ph缓冲剂提供了一种弱酸环境，非离子型表面活性剂的解离效果较为温和用于打开rhsa和猴血白蛋白的连接，羧基化蛋白对于带阳离子的抗rhsa的结合能力比猴血白蛋白强，以促进打开rhsa抗体与猴血白蛋白的复合物。在羧基化蛋白、非离子表面活性剂和酸性ph缓冲剂的条件下，可以实现更好的解离效果，同时可以保持较好的抗rhsa抗体活性，并且具有更高的灵敏度和耐药性。羧基化蛋白、非离子表面活性剂和酸性ph缓冲剂缺一不可，否则不能实现三者的协同作用，影响检测结果。
328.由表1的数据可知，各实施例中，在耐药性测试组中加入了1mg/ml的rhsa后，仍然能够达到较好的检测效果。这说明在灵敏度250ng/ml的前提下，本发明的检测方法的耐药性达到了1mg/ml。
329.由表1的数据可知，实施例1的效果好于实施例2～4，这是因为实施例1的各组分使用了最优选的比例。另外，实施例1的效果好于实施例5，这是因为实施例5只进行了一次解离反应，部分rhsa-猴血白蛋白复合体没有解离。
330.由表1的数据可知，实施例1的效果好于实施例6，这是因为实施例1使用了nh2作为rhsa的标记基团，rhsa分子含有较多的cooh，cooh在edc存在的条件下可以与nh2共价结合，故选择nh2作为标记rhsa的结合基团，标记效率远高于其它基团。实施例1的效果好于实施例7，这是因为实施例1使用了oh基团，oh基团在上述检测方法的液体中带负电荷，而抗rhsa带正电荷，所以oh基团具有对抗rhsa的吸附作用，可以增强从猴血中竞争性提取抗rhsa。实施例1效果好于实施例6-7，这是因为使用同时含有oh基团和nh2基团的磁珠，可以产生协同作用，更好的发挥对抗rhsa的吸附作用。
331.以上所述仅对本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。
技术领域
1.本发明属于生物药免疫原性检测领域，具体而言，涉及一种用于分离猴血中抗rhsa的酸解液、方法及猴血中抗rhsa抗药抗体的检测方法。
背景技术：
2.自1982年首个重组蛋白类药物批准上市以来，目前国内外共有260多种治疗性重组蛋白类药物(包括70多种治疗性单抗药物)在临床上得到了广泛应用，用于230多种适应证的治疗(nat biotechnol,2014.32(10):p.992-1000；health aff(millwood),2015.34(2):p.210-9)。随着对治疗性重组蛋白药物的研究越来越深入，对相关药物给药过程中产生的抗体即抗药抗体(anti-drug antibody，ada)的研究越来越受到重视。抗药抗体的产生，会对治疗性重组蛋白类药物的安全性和有效性带来影响，因此ada的检测是临床用药过程中需要密切关注的指标。
3.在重组人血白蛋白药物的临床前评价阶段，一般用猴子做临床前的安全性评价，针对重组人血白蛋白(rhsa)的免疫原性分析的方案是，把重组人血白蛋白药物注射到猴子体内，用药数月后，抽取猴子血液，检测用药的猴子血中是否产生抗rhsa抗体(ada)，检测时会用一个兔抗或鼠抗rhsa稀释在正常猴血里作为阳性对照。而针对猴血中抗rhsa抗体的检测，尚未有较为完善的方案，也没有能检出毫克级耐药性的方法。
技术实现要素：
4.申请人发现，因为猴血白蛋白的氨基酸组成及蛋白结构和人血白蛋白的高度相似，这就使得加到猴血里的抗rhsa阳性对照和猴血白蛋白结合在一起，无法再和rhsa结合，因为猴血中猴血白蛋白的含量高达600mg/ml，因此常规的酸化方法无法将阳性对照中的抗rhsa与猴血白蛋白分离，也就无法对阳性对照中的抗rhsa进行检测，从而也就不能对实验样品中抗rhsa的水平进行定量。
5.为了解决上述问题，本发明第一方面提供了一种用于分离猴血中抗rhsa的酸解液，包含羧基化蛋白、非离子型表面活性剂和酸性ph缓冲剂，所述ph缓冲剂的缓冲范围为ph4～6。
6.相对于现有技术，本发明的酸解液使用了缓冲范围为ph4～6的ph缓冲剂提供了一种弱酸环境，非离子型表面活性剂的解离效果较为温和,用于打开rhsa和猴血白蛋白的连接，羧基化蛋白对于带阳离子的抗rhsa的结合能力比猴血白蛋白强，以促进打开抗rhsa抗体与猴血白蛋白的复合物。在羧基化蛋白、非离子表面活性剂和酸性ph缓冲剂的条件下，可以实现更好的解离效果，同时可以保持较好的抗rhsa抗体活性，并且具有更高的灵敏度和耐药性。
7.进一步的，羧基化蛋白为羧基化bsa，非离子型表面活性剂为np40，酸性ph缓冲剂为mes。羧基化bsa具有与猴血白蛋白的类似结构，并且带有丰富的负离子，可以更好的发挥
与猴血白蛋白竞争性吸附抗rhsa的作用，np40和mes与羧基化bsa的结合可以产生协同作用，获得更好的解离效果。
8.进一步的，以重量分数计，包含0.2～5％的所述羧基化bsa、0.01～2％的所述np40和1.065～10.65％的所述mes。进一步的，以重量分数计，包含0.5～2％的所述羧基化bsa、0.1～1％的所述np40和1.065～4.26％的所述mes。进一步的，以重量分数计，包含1％的所述羧基化bsa、0.5％的所述np40和2.13％的所述mes。
9.本发明第二方面提供了一种用于分离猴血中抗人白蛋白抗体的方法，包含使用上述酸解液对所述猴血进行解离得到第一解离液，然后降低所述第一酸解液的ph进行反应得到第二解离液。
10.相对于现有技术，本发明的用于分离猴血中抗人白蛋白抗体的方法，使用了包含羧基化蛋白、非离子型表面活性剂和酸性ph缓冲剂，所述ph缓冲剂的缓冲范围为ph4～6的解离液对猴血进行初步的、温和的解离得到第一解离液，并通过降低第一解离液的ph进行彻底的解离得到第二解离液，通过两步酸解，在保证抗rhsa-猴血白蛋白复合物充分解离的同时，还能够很好的维持抗rhsa的活性，并且具有更高的灵敏度和耐药性。
11.本发明第三方面提供了一种猴血中抗rhsa抗药抗体的检测方法，包含下述步骤，
12.制备阳性对照样品：以包含外源性抗rhsa抗体的猴血为阳性对照组；
13.解离步骤：向所述阳性对照组中加入上述任一项酸解液进行一次解离反应；
14.磁珠吸附与分离：使用rhsa磁珠对经过所述解离步骤处理后的所述阳性对照组进行磁珠吸附，磁珠清洗与磁珠分离，得到去除猴血白蛋白的提取液；
15.上机检测。
16.相对于现有技术，本发明的猴血中抗rhsa抗药抗体的检测方法，通过使用保护性的酸解液对阳性对照组进行一次解离反应，从而将阳性对照组中与猴血白蛋白结合的外源性抗rhsa抗体与猴血白蛋白分离，并且不会影响外源性抗rhsa抗体的活性，随后使用了rhsa磁珠(优选的为带有oh基团的rhsa磁珠)富集分离抗rhsa，去除待检样品中的猴血白蛋白，从而解决了阳性对照组中抗rhsa抗体无法检测的问题，由此可以对阳性对照组中抗rhsa抗体进行准确定量，从而可以对含有内源性抗rhsa的实验组进行定量检测，并且具有更高的灵敏度和耐药性。
17.进一步的，于所述一次解离反应后降低所述阳性对照组的ph以进行二次解离反应。通过解离液对猴血进行初步的、温和的一次解离，并通过较低ph环境下的二次解离对抗rhsa-猴血白蛋白复合物进行彻底的解离，两个解离步骤的结合，在保证抗rhsa-猴血白蛋白复合物充分解离的同时，还能够很好的维持抗rhsa的活性。
18.进一步的，rhsa磁珠包含oh基团和用于标记rhsa的nh2基团。oh基团在上述保护性的酸解液中带负电荷，而抗rhsa带正电荷，所以oh基团具有对抗rhsa的吸附作用，可以增强从猴血中竞争性提取抗rhsa的能力；而rhsa分子含有较多的cooh，cooh在edc存在的条件下可以与nh2共价结合，故选择nh2作为标记rhsa的结合基团，标记效率远高于其它基团。使用同时含有oh基团和nh2基团的磁珠，可以产生协同作用，更好的发挥对抗rhsa的富集提取作用。
19.进一步的，使用纳米磁珠化学发光桥接法进行所述上机检测。纳米磁珠化学发光桥接法具有较高的特异性和灵敏度，可以进一步提高抗rhsa抗药抗体的检测效果。纳米磁
珠化学发光桥接法检测抗rhsa抗体具有较高的特异性和灵敏度，和其它步骤具有协同作用。
具体实施方式
20.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
21.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。除非另有说明，否则本文所使用的各组试剂均可通过市售获得。下述样品保护酸化液即酸解液。
22.实施例1
23.第一步，各种试剂的制备。
24.1.制备样品保护酸化液。
25.配方为：1％cooh-bsa、0.5％np40和2.13％mes，使用超纯水作为溶剂。
26.2.制备分离磁珠。
27.用edc一步法制备rhsa标记磁珠，edc使用浓度为1％，磁珠浓度1％，磁珠同时包含oh基团和nh2基团。
28.3.制备rhsa-abei。
29.用edc一步法制备rhsa-abei结合物，edc用量2mg/ml。
30.4.rhsa-biotin的制备。
31.用nhs-biotin制备rhsa-biotin，biotin与rhsa分子数比10：1。
32.5.酸化液1的制备。
33.用纯化水将分析纯醋酸稀释成0.3m。
34.6.酸化液2的制备。
35.用甘氨酸盐酸配制0.1mph2.4缓冲液。
36.7.桥接混合液的制备。
37.由相同分子数的rhsa-biotin和rhsa-abei混合而成。
38.8.中和液的制备。
39.用分析纯tris和盐酸配成1mph11溶液。
40.第二步，抗rhsa抗药抗体的检测方法是：
41.1.制备样品：将兔抗-rhsa加入猴血中，终浓度为250ng/ml，作为阳性对照组样品；在250ng/ml兔抗-rhsa样品中加入rhsa，终浓度为1mg/ml，作为耐药性测试组；并以未添加兔抗rhsa的猴血作为空白基底。
42.2.将15μl样本和15μl样品保护酸化液混合，涡匀，室温静置反应30分钟，此为一次解离反应。
43.3.加入200μl酸化液1，涡匀，室温静置反应20分钟，此为二次解离反应。
44.4.加入30μl rhsa分离磁珠，吹一下，再加入50μl中和液，涡一下。
45.5.然后转移到1号深孔板内，混匀仪放下磁棒套60转速40分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转3分钟。
46.6.将磁珠转移到深孔板2号加入900μl洗液，放下磁棒套90转6分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转5分钟。
47.7.将磁珠转移到深孔板3号加入310μl酸化液2，放下磁棒套90转8分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转14分钟，去除磁珠。
48.8.取出200μl酸化样本室温静置20分钟，再加入55μl混合液和50μl中和液室温静置反应10分钟。
49.9.上全自动分子发光生物免疫分析仪(rightflare60)测试，仪器参数设置：样本100μl，sa磁珠20μl“一步法”孵育时间5分钟。
50.实施例2
51.第一步，各种试剂的制备。
52.1.制备样品保护酸化液。
53.配方为：1％羧基化bsa、0.5％曲拉通x-100和0.1mph7.2pbs，使用超纯水作为溶剂。
54.2.制备分离磁珠。
55.用edc一步法制备rhsa标记磁珠，edc使用浓度为1％，磁珠浓度1％，磁珠同时包含oh基团和nh2基团。
56.3.制备rhsa-abei。
57.用edc一步法制备rhsa-abei结合物，edc用量2mg/ml。
58.4.rhsa-biotin的制备
59.用nhs-biotin制备rhsa-biotin，biotin与rhsa分子数比10：1。
60.5.酸化液1的制备。
61.用纯化水将分析纯醋酸稀释成0.3m。
62.6.酸化液2的制备。
63.用甘氨酸盐酸配制0.1mph2.4缓冲液。
64.7.桥接混合液的制备。
65.由相同分子数的rhsa-biotin和rhsa-abei混合而成。
66.8.中和液的制备。
67.用分析纯tris和盐酸配成1mph11溶液。
68.第二步，抗rhsa抗药抗体的检测方法是：
69.1.制备样品：将兔抗-rhsa加入猴血中，终浓度为250ng/ml，作为阳性对照组样品；在250ng/ml兔抗-rhsa样品中加入rhsa，终浓度为1mg/ml，作为耐药性测试组；并以未添加兔抗rhsa的猴血作为空白基底。
70.2.将15μl样本和15μl样品保护酸化液混合，涡匀，室温静置反应30分钟，此为一次解离反应。
71.3.加入200μl酸化液1，涡匀，室温静置反应20分钟，此为二次解离反应。
72.4.加入30μl rhsa分离磁珠，吹一下，再加入50μl中和液，涡一下。
73.5.然后转移到1号深孔板内，混匀仪放下磁棒套60转速40分钟(磁棒套和磁棒分
离)，然后放下磁棒吸10转3分钟。
74.6.将磁珠转移到深孔板2号加入900μl洗液，放下磁棒套90转6分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转5分钟。
75.7.将磁珠转移到深孔板3号加入310μl酸化液2，放下磁棒套90转8分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转14分钟，去除磁珠。
76.8.取出200μl酸化样本室温静置20分钟，再加入55μl混合液和50μl中和液室温静置反应10分钟。
77.9.上全自动分子发光生物免疫分析仪(rightflare60)测试，仪器参数设置：样本100μl，sa磁珠20μl“一步法”孵育时间5分钟。
78.实施例3
79.第一步，各种试剂的制备。
80.1.制备样品保护酸化液。
81.配方为：0.4％cooh-bsa、0.04％np40和8％mes，使用超纯水作为溶剂。
82.2.制备分离磁珠。
83.用edc一步法制备rhsa标记磁珠，edc使用浓度为1％，磁珠浓度1％，磁珠同时包含oh基团和nh2基团。
84.3.制备rhsa-abei。
85.用edc一步法制备rhsa-abei结合物，edc用量2mg/ml。
86.4.rhsa-biotin的制备
87.用nhs-biotin制备rhsa-biotin，biotin与rhsa分子数比10：1。
88.5.酸化液1的制备。
89.用纯化水将分析纯醋酸稀释成0.3m。
90.6.酸化液2的制备。
91.用甘氨酸盐酸配制0.1mph2.4缓冲液。
92.7.桥接混合液的制备。
93.由相同分子数的rhsa-biotin和rhsa-abei混合而成。
94.8.中和液的制备。
95.用分析纯tris和盐酸配成1mph11溶液。
96.第二步，抗rhsa抗药抗体的检测方法是：
97.1.制备样品：将兔抗-rhsa加入猴血中，终浓度为250ng/ml，作为阳性对照组样品；在250ng/ml兔抗-rhsa样品中加入rhsa终浓度为1mg/ml，作为耐药性测试组；并以未添加兔抗rhsa的猴血作为空白基底。
98.2.将15μl样本和15μl样品保护酸化液混合，涡匀，室温静置反应30分钟，此为一次解离反应。
99.3.加入200μl酸化液1，涡匀，室温静置反应20分钟，此为二次解离反应。
100.4.加入30μl rhsa分离磁珠，吹一下，再加入50μl中和液，涡一下。
101.5.然后转移到1号深孔板内，混匀仪放下磁棒套60转速40分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转3分钟。
102.6.将磁珠转移到深孔板2号加入900μl洗液，放下磁棒套90转6分钟(磁棒套和磁棒
分离)，然后放下磁棒吸10转5分钟。
103.7.将磁珠转移到深孔板3号加入310μl酸化液2，放下磁棒套90转8分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转14分钟，去除磁珠。
104.8.取出200μl酸化样本室温静置20分钟，再加入55μl混合液和50μl中和液室温静置反应10分钟。
105.9.上全自动分子发光生物免疫分析仪(rightflare60)测试，仪器参数设置：样本100μl，sa磁珠20μl“一步法”孵育时间5分钟。
106.实施例4
107.第一步，各种试剂的制备。
108.1.制备样品保护酸化液。
109.配方为：0.5％cooh-bsa、0.1％np40和1.2％mes，使用超纯水作为溶剂。
110.2.制备分离磁珠。
111.用edc一步法制备rhsa标记磁珠，edc使用浓度为1％，磁珠浓度1％，磁珠同时包含oh基团和nh2基团。
112.3.制备rhsa-abei。
113.用edc一步法制备rhsa-abei结合物，edc用量2mg/ml。
114.4.rhsa-biotin的制备
115.用nhs-biotin制备rhsa-biotin，biotin与rhsa分子数比10：1。
116.5.酸化液1的制备。
117.用纯化水将分析纯醋酸稀释成0.3m。
118.6.酸化液2的制备。
119.用甘氨酸盐酸配制0.1mph2.4缓冲液。
120.7.桥接混合液的制备。
121.由相同分子数的rhsa-biotin和rhsa-abei混合而成。
122.8.中和液的制备。
123.用分析纯tris和盐酸配成1mph11溶液。
124.第二步，抗rhsa抗药抗体的检测方法是：
125.1.制备样品：将兔抗-rhsa加入猴血中，终浓度为250ng/ml，作为阳性对照组样品；在250ng/ml兔抗-rhsa样品中加入rhsa终浓度为1mg/ml，作为耐药性测试组；并以未添加兔抗rhsa的猴血作为空白基底。
126.2.将15μl样本和15μl样品保护酸化液混合，涡匀，室温静置反应30分钟，此为一次解离反应。
127.3.加入200μl酸化液1，涡匀，室温静置反应20分钟，此为二次解离反应。
128.4.加入30μl rhsa分离磁珠，吹一下，再加入50μl中和液，涡一下。
129.5.然后转移到1号深孔板内，混匀仪放下磁棒套60转速40分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转3分钟。
130.6.将磁珠转移到深孔板2号加入900μl洗液，放下磁棒套90转6分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转5分钟。
131.7.将磁珠转移到深孔板3号加入310μl酸化液2，放下磁棒套90转8分钟(磁棒套和
磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转14分钟，去除磁珠。
132.8.取出200μl酸化样本室温静置20分钟，再加入55μl混合液和50μl中和液室温静置反应10分钟。
133.9.上全自动分子发光生物免疫分析仪(rightflare60)测试，仪器参数设置：样本100μl，sa磁珠20μl“一步法”孵育时间5分钟。
134.实施例5
135.第一步，各种试剂的制备。
136.1.制备样品保护酸化液。
137.配方为：1％cooh-bsa、0.5％np40和2.13％mes，使用超纯水作为溶剂。
138.2.制备分离磁珠。
139.用edc一步法制备rhsa标记磁珠，edc使用浓度为1％，磁珠浓度1％，磁珠同时包含oh基团和nh2基团。
140.3.制备rhsa-abei。
141.用edc一步法制备rhsa-abei结合物，edc用量2mg/ml。
142.4.rhsa-biotin的制备
143.用nhs-biotin制备rhsa-biotin，biotin与rhsa分子数比10：1。
144.5.酸化液的制备。
145.用甘氨酸盐酸配制0.1mph2.4缓冲液。
146.6.桥接混合液的制备。
147.由相同分子数的rhsa-biotin和rhsa-abei混合而成。
148.7.中和液的制备。
149.用分析纯tris和盐酸配成1mph11溶液。
150.第二步，抗rhsa抗药抗体的检测方法是：
151.1.制备样品：将兔抗-rhsa加入猴血中，终浓度为250ng/ml，作为阳性对照组样品；在250ng/ml兔抗-rhsa样品中加入rhsa终浓度为1mg/ml，作为耐药性测试组；并以未添加兔抗rhsa的猴血作为空白基底。
152.2.将15μl样本和15μl样品保护酸化液混合，涡匀，室温静置反应30分钟，此为一次解离反应，检测一次解离反应的混合液的ph。
153.3.加入200μl双蒸水，涡匀，室温静置反应20分钟。
154.4.加入30μl rhsa分离磁珠，吹一下，再加入15μl中和液，涡一下。
155.5.然后转移到1号深孔板内，混匀仪放下磁棒套60转速40分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转3分钟。
156.6.将磁珠转移到深孔板2号加入900μl洗液，放下磁棒套90转6分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转5分钟。
157.7.将磁珠转移到深孔板3号加入310μl酸化液2，放下磁棒套90转8分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转14分钟，去除磁珠。
158.8.取出200μl酸化样本室温静置20分钟，再加入55μl混合液和50μl中和液室温静置反应10分钟。
159.9.上全自动分子发光生物免疫分析仪(rightflare60)测试，仪器参数设置：样本
100μl，sa磁珠20μl“一步法”孵育时间5分钟。
160.实施例6
161.第一步，各种试剂的制备。
162.1.制备样品保护酸化液。
163.配方为：1％cooh-bsa、0.5％np40和2.13％mes，使用超纯水作为溶剂。
164.2.制备分离磁珠。
165.用edc一步法制备rhsa标记磁珠，edc使用浓度为1％，磁珠浓度1％，磁珠同时包含oh基团和cooh基团，用磁珠的cooh和rhsa的nh2基团结合。
166.3.制备rhsa-abei。
167.用edc一步法制备rhsa-abei结合物，edc用量2mg/ml。
168.4.rhsa-biotin的制备。
169.用nhs-biotin制备rhsa-biotin，biotin与rhsa分子数比10：1。
170.5.酸化液1的制备。
171.用纯化水将分析纯醋酸稀释成0.3m。
172.6.酸化液2的制备。
173.用甘氨酸盐酸配制0.1mph2.4缓冲液。
174.7.桥接混合液的制备。
175.由相同分子数的rhsa-biotin和rhsa-abei混合而成。
176.8.中和液的制备。
177.用分析纯tris和盐酸配成1mph11溶液。
178.第二步，抗rhsa抗药抗体的检测方法是：
179.1.制备样品：将兔抗-rhsa加入猴血中，终浓度为250ng/ml，作为阳性对照组样品；在250ng/ml兔抗-rhsa样品中加入rhsa，终浓度为1mg/ml，作为耐药性测试组；并以未添加兔抗rhsa的猴血作为空白基底。
180.2.将15μl样本和15μl样品保护酸化液混合，涡匀，室温静置反应30分钟，此为一次解离反应。
181.3.加入200μl酸化液1，涡匀，室温静置反应20分钟，此为二次解离反应。
182.4.加入30μl rhsa分离磁珠，吹一下，再加入50μl中和液，涡一下。
183.5.然后转移到1号深孔板内，混匀仪放下磁棒套60转速40分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转3分钟。
184.6.将磁珠转移到深孔板2号加入900μl洗液，放下磁棒套90转6分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转5分钟。
185.7.将磁珠转移到深孔板3号加入310μl酸化液2，放下磁棒套90转8分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转14分钟，去除磁珠。
186.8.取出200μl酸化样本室温静置20分钟，再加入55μl混合液和50μl中和液室温静置反应10分钟。
187.9.上全自动分子发光生物免疫分析仪(rightflare60)测试，仪器参数设置：样本100μl，sa磁珠20μl“一步法”孵育时间5分钟。
188.实施例7
189.第一步，各种试剂的制备。
190.1.制备样品保护酸化液。
191.配方为：1％cooh-bsa、0.5％np40和2.13％mes，使用超纯水作为溶剂。
192.2.制备分离磁珠。
193.用edc一步法制备rhsa标记磁珠，edc使用浓度为1％，磁珠浓度1％，磁珠只带有nh2基团。
194.3.制备rhsa-abei。
195.用edc一步法制备rhsa-abei结合物，edc用量2mg/ml。
196.4.rhsa-biotin的制备。
197.用nhs-biotin制备rhsa-biotin，biotin与rhsa分子数比10：1。
198.5.酸化液1的制备。
199.用纯化水将分析纯醋酸稀释成0.3m。
200.6.酸化液2的制备。
201.用甘氨酸盐酸配制0.1mph2.4缓冲液。
202.7.桥接混合液的制备。
203.由相同分子数的rhsa-biotin和rhsa-abei混合而成。
204.8.中和液的制备。
205.用分析纯tris和盐酸配成1mph11溶液。
206.第二步，抗rhsa抗药抗体的检测方法是：
207.1.制备样品：将兔抗-rhsa加入猴血中，终浓度为250ng/ml，作为阳性对照组样品；在250ng/ml兔抗-rhsa样品中加入rhsa，终浓度为1mg/ml，作为耐药性测试组；并以未添加兔抗rhsa的猴血作为空白基底。
208.2.将15μl样本和15μl样品保护酸化液混合，涡匀，室温静置反应30分钟，此为一次解离反应。
209.3.加入200μl酸化液1，涡匀，室温静置反应20分钟，此为二次解离反应。
210.4.加入30μl rhsa分离磁珠，吹一下，再加入50μl中和液，涡一下。
211.5.然后转移到1号深孔板内，混匀仪放下磁棒套60转速40分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转3分钟。
212.6.将磁珠转移到深孔板2号加入900μl洗液，放下磁棒套90转6分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转5分钟。
213.7.将磁珠转移到深孔板3号加入310μl酸化液2，放下磁棒套90转8分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转14分钟，去除磁珠。
214.8.取出200μl酸化样本室温静置20分钟，再加入55μl混合液和50μl中和液室温静置反应10分钟。
215.9.上全自动分子发光生物免疫分析仪(rightflare60)测试，仪器参数设置：样本100μl，sa磁珠20μl“一步法”孵育时间5分钟。
216.对比例1
217.第一步，各种试剂的制备。
218.1.制备样品保护酸化液。
219.配方为：1％bsa、0.5％np40和2.13％mes，使用超纯水作为溶剂。
220.2.制备分离磁珠。
221.用edc一步法制备rhsa标记磁珠，edc使用浓度为1％，磁珠浓度1％，磁珠同时包含oh基团和nh2基团。
222.3.制备rhsa-abei。
223.用edc一步法制备rhsa-abei结合物，edc用量2mg/ml。
224.4.rhsa-biotin的制备
225.用nhs-biotin制备rhsa-biotin，biotin与rhsa分子数比10：1。
226.5.酸化液1的制备。
227.用纯化水将分析纯醋酸稀释成0.3m。
228.6.酸化液2的制备。
229.用甘氨酸盐酸配制0.1mph2.4缓冲液。
230.7.桥接混合液的制备。
231.由相同分子数的rhsa-biotin和rhsa-abei混合而成。
232.8.中和液的制备。
233.用分析纯tris和盐酸配成1mph11溶液。
234.第二步，抗rhsa抗药抗体的检测方法是：
235.1.制备样品：将兔抗-rhsa加入猴血中，终浓度为250ng/ml，作为阳性对照组样品；在250ng/ml兔抗-rhsa样品中加入rhsa，终浓度为1mg/ml，作为耐药性测试组；并以未添加兔抗rhsa的猴血作为空白基底。
236.2.将15μl样本和15μl样品保护酸化液混合，涡匀，室温静置反应30分钟，此为一次解离反应。
237.3.加入200μl酸化液1，涡匀，室温静置反应20分钟，此为二次解离反应。
238.4.加入30μl rhsa分离磁珠，吹一下，再加入50μl中和液，涡一下。
239.5.然后转移到1号深孔板内，混匀仪放下磁棒套60转速40分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转3分钟。
240.6.将磁珠转移到深孔板2号加入900μl洗液，放下磁棒套90转6分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转5分钟。
241.7.将磁珠转移到深孔板3号加入310μl酸化液2，放下磁棒套90转8分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转14分钟，去除磁珠。
242.8.取出200μl酸化样本室温静置20分钟，再加入55μl混合液和50μl中和液室温静置反应10分钟。
243.9.上全自动分子发光生物免疫分析仪(rightflare60)测试，仪器参数设置：样本100μl，sa磁珠20μl“一步法”孵育时间5分钟。
244.对比例2
245.第一步，各种试剂的制备。
246.1.制备样品保护酸化液。
247.配方为：1％cooh-bsa、0.5％sds和2.13％mes，使用超纯水作为溶剂。
248.2.制备分离磁珠。
249.用edc一步法制备rhsa标记磁珠，edc使用浓度为1％，磁珠浓度1％，磁珠同时包含oh基团和nh2基团。
250.3.制备rhsa-abei。
251.用edc一步法制备rhsa-abei结合物，edc用量2mg/ml。
252.4.rhsa-biotin的制备
253.用nhs-biotin制备rhsa-biotin，biotin与rhsa分子数比10：1。
254.5.酸化液1的制备。
255.用纯化水将分析纯醋酸稀释成0.3m。
256.6.酸化液2的制备。
257.用甘氨酸盐酸配制0.1mph2.4缓冲液。
258.7.桥接混合液的制备。
259.由相同分子数的rhsa-biotin和rhsa-abei混合而成。
260.8.中和液的制备。
261.用分析纯tris和盐酸配成1mph11溶液。
262.第二步，抗rhsa抗药抗体的检测方法是：
263.1.制备样品：将兔抗-rhsa加入猴血中，终浓度为250ng/ml，作为阳性对照组样品；在250ng/ml兔抗-rhsa样品中加入rhsa终浓度为1mg/ml，作为耐药性测试组；并以未添加兔抗rhsa的猴血作为空白基底。
264.2.将15μl样本和15μl样品保护酸化液混合，涡匀，室温静置反应30分钟，此为一次解离反应。
265.3.加入200μl酸化液1，涡匀，室温静置反应20分钟，此为二次解离反应。
266.4.加入30μl rhsa分离磁珠，吹一下，再加入50μl中和液，涡一下。
267.5.然后转移到1号深孔板内，混匀仪放下磁棒套60转速40分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转3分钟。
268.6.将磁珠转移到深孔板2号加入900μl洗液，放下磁棒套90转6分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转5分钟。
269.7.将磁珠转移到深孔板3号加入310μl酸化液2，放下磁棒套90转8分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转14分钟，去除磁珠。
270.8.取出200μl酸化样本室温静置20分钟，再加入55μl混合液和50μl中和液室温静置反应10分钟。
271.9.上全自动分子发光生物免疫分析仪(rightflare60)测试，仪器参数设置：样本100μl，sa磁珠20μl“一步法”孵育时间5分钟。
272.对比例3
273.第一步，各种试剂的制备。
274.1.制备样品保护酸化液。
275.配方为：1％cooh-bsa、0.5％np40和0.1m醋酸缓冲液，使用超纯水作为溶剂。
276.2.制备分离磁珠。
277.用传统的戊二醛二步法制备rhsa标记磁珠，戊二醛使用浓度10％，磁珠浓度1％，磁珠同时包含oh基团和nh2基团。
278.3.制备rhsa-abei。
279.用edc一步法制备rhsa-abei结合物，edc用量2mg/ml。
280.4.rhsa-biotin的制备
281.用nhs-biotin制备rhsa-biotin，biotin与rhsa分子数比10：1。
282.5.酸化液1的制备。
283.用纯化水将分析纯醋酸稀释成0.3m。
284.6.酸化液2的制备。
285.用甘氨酸盐酸配制0.1mph2.4缓冲液。
286.7.桥接混合液的制备。
287.由相同分子数的rhsa-biotin和rhsa-abei混合而成。
288.8.中和液的制备。
289.用分析纯tris和盐酸配成1mph11溶液。
290.第二步，抗rhsa抗药抗体的检测方法是：
291.1.制备样品：将兔抗-rhsa加入猴血中，终浓度为250ng/ml，作为阳性对照组样品；在250ng/ml兔抗-rhsa样品中加入rhsa终浓度为1mg/ml，作为耐药性测试组；并以未添加兔抗rhsa的猴血作为空白基底。
292.2.将15μl样本和15μl样品保护酸化液混合，涡匀，室温静置反应30分钟，此为一次解离反应。
293.3.加入200μl酸化液1，涡匀，室温静置反应20分钟，此为二次解离反应。
294.4.加入30μl rhsa分离磁珠，吹一下，再加入50μl中和液，涡一下。
295.5.然后转移到1号深孔板内，混匀仪放下磁棒套60转速40分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转3分钟。
296.6.将磁珠转移到深孔板2号加入900μl洗液，放下磁棒套90转6分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转5分钟。
297.7.将磁珠转移到深孔板3号加入310μl酸化液2，放下磁棒套90转8分钟(磁棒套和磁棒分离)，然后放下磁棒吸10转14分钟，去除磁珠。
298.8.取出200μl酸化样本室温静置20分钟，再加入55μl混合液和50μl中和液室温静置反应10分钟。
299.9.上全自动分子发光生物免疫分析仪(rightflare60)测试，仪器参数设置：样本100μl，sa磁珠20μl“一步法”孵育时间5分钟。
300.对比例4
301.第一步，各种试剂的制备。
302.1.制备样品酸化液。
303.配方为：0.3m醋酸缓冲液，使用超纯水作为溶剂。
304.2.制备elisa sa包被板。
305.1ug/ml sa蛋白溶解在0.05m碳酸盐缓冲液里，每孔加100ul，4～8℃放置16小时。1％bsa37℃封闭1小时。甩干备用。
306.3.制备rhsa-hrp。
307.用高碘酸钠氧化法制备rhsa-hrp结合物，使用浓度0.5ug/ml。
308.4.rhsa-biotin的制备
309.用nhs-biotin制备rhsa-biotin，biotin与rhsa分子数比10：1。
310.5.桥接混合液的制备。
311.由相同分子数的rhsa-biotin和rhsa-hrp混合而成。
312.6.中和液的制备。
313.用分析纯tris和盐酸配成1mph11溶液。
314.7.显色剂市售
315.8.终止剂市售
316.第二步，抗rhsa抗药抗体的检测方法是：
317.1.制备样品：将兔抗-rhsa加入猴血中，终浓度为250ng/ml，作为阳性对照组样品；在250ng/ml兔抗-rhsa样品中加入rhsa终浓度为1mg/ml，作为耐药性测试组；并以未添加兔抗rhsa的猴血作为空白基底。
318.2.将30μl样本和270μl样品酸化液混合，涡匀，室温静置反应30分钟。
319.3.向步骤2中加入80μl中和液，涡一下，再加入100μl桥接混合液。
320.4.取步骤3液体100μl，加入到elisa sa包被板中，室温静置反应120分钟。
321.5.洗板5次，甩干，每孔加显色剂100μl，室温反应30分钟。
322.6.上酶标仪测定吸光度。
323.上述实施例和对比例的实验数据如表1所述。下述p/n值为各实验组中，阳性对照组与空白基底的检测信号均值的比值。
324.表1，各实施例与对比例的检测结果
325.组别阳性对照组(灵敏度p/n)耐药性测试组(灵敏度耐药度p/n)实施例11.481.32实施例21.251.09实施例31.201.17实施例41.231.16实施例51.201.15实施例61.181.13实施例71.181.09对比例11.081.05对比例21.060.98对比例31.101.08对比例40.971.01
326.根据表1的数据可知，实施例1～7明显好于对比例4，这是因为本发明的猴血中抗rhsa抗药抗体的检测方法，通过使用样品保护酸化液对阳性对照组进行一次解离反应，从而将阳性对照组中与猴血白蛋白结合的外源性抗rhsa抗体与猴血白蛋白分离，并且不会影响外源性抗rhsa抗体的活性。随后使用带有oh基的rhsa磁珠富集分离抗rhsa，去除待检样品中的猴血白蛋白，从而解决了阳性对照组中抗rhsa抗体无法检测的问题，由此可以对阳性对照组中抗rhsa抗体进行准确定量，从而可以对含有内源性抗rhsa的实验组进行定量检测。
327.由表1的数据可知，实施例1～7明显好于对比例1～3，这是因为本发明的酸解液使用了缓冲范围为ph4～6的ph缓冲剂提供了一种弱酸环境，非离子型表面活性剂的解离效果较为温和用于打开rhsa和猴血白蛋白的连接，羧基化蛋白对于带阳离子的抗rhsa的结合能力比猴血白蛋白强，以促进打开rhsa抗体与猴血白蛋白的复合物。在羧基化蛋白、非离子表面活性剂和酸性ph缓冲剂的条件下，可以实现更好的解离效果，同时可以保持较好的抗rhsa抗体活性，并且具有更高的灵敏度和耐药性。羧基化蛋白、非离子表面活性剂和酸性ph缓冲剂缺一不可，否则不能实现三者的协同作用，影响检测结果。
328.由表1的数据可知，各实施例中，在耐药性测试组中加入了1mg/ml的rhsa后，仍然能够达到较好的检测效果。这说明在灵敏度250ng/ml的前提下，本发明的检测方法的耐药性达到了1mg/ml。
329.由表1的数据可知，实施例1的效果好于实施例2～4，这是因为实施例1的各组分使用了最优选的比例。另外，实施例1的效果好于实施例5，这是因为实施例5只进行了一次解离反应，部分rhsa-猴血白蛋白复合体没有解离。
330.由表1的数据可知，实施例1的效果好于实施例6，这是因为实施例1使用了nh2作为rhsa的标记基团，rhsa分子含有较多的cooh，cooh在edc存在的条件下可以与nh2共价结合，故选择nh2作为标记rhsa的结合基团，标记效率远高于其它基团。实施例1的效果好于实施例7，这是因为实施例1使用了oh基团，oh基团在上述检测方法的液体中带负电荷，而抗rhsa带正电荷，所以oh基团具有对抗rhsa的吸附作用，可以增强从猴血中竞争性提取抗rhsa。实施例1效果好于实施例6-7，这是因为使用同时含有oh基团和nh2基团的磁珠，可以产生协同作用，更好的发挥对抗rhsa的吸附作用。
331.以上所述仅对本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
