一种基于自养异养转换的生物阴极BOD传感系统的制备的制作方法

oneidensis为对照菌种，对比了三种菌的生长繁殖特性，成膜形态分析、其电化学性能测试以及应用成bod传感器可行性分析。发现只有acinetobacter-378能够实现对乙酸钠和葡萄糖等的快速灵敏响应。
9.2)阴极生物膜的人工构建：
10.(1)工作电极的预处理：将尺寸为10mm
×
10mm
×
3mm大小的石墨片电极用600目的砂纸以画“8”字的方式进行打磨，然后依次用无水乙醇、超纯水分别超声3次，每次20min。将预处理的石墨片电极放置在无菌箱内，室温下晾干，得到预处理的石墨片工作电极。
11.(2)微生物培养：acinetobacter-378菌种保存在-80℃低温冰箱，活化该菌种时首先需要从低温条件下保存的冷冻管中取出原菌，室温下解冻菌种。将配置好的500ml营养肉汤培养基溶液放入高压蒸汽灭菌锅中,在121℃下持续灭菌20min，灭菌完成后室温下冷却。在超净台的无菌环境中，用移液枪吸取一定量的菌液接种入已经灭菌的nb液体培养基中，在37℃、200rpm的摇床中振荡培养。当acinetobacter-378在对数期生长时，以4000rmp/min的速度离心20min，离心后将上清液倒出，然后用无菌磷酸盐缓冲溶液(pbs)清洗3次后收集菌体备用。
12.(3)人造阴极生物膜的构建：制作包埋剂，取5％的nafion膜溶液和68％的ptfe按1:5(nafion:ptfe)搅拌混合，得到适用的nafion/ptfe包埋剂。取适量菌体与包埋剂混合后用移液枪将其滴涂于预处理过的石墨片电极上，常温下晾40min成膜，该过程重复3次，使石墨片电极上具有一定厚度的生物膜，放置于4℃冰箱备用。
13.3)传感器对bod的响应：
14.(1)组装传感器：包括mec反应器主体、电流采集系统和连续进样系统，mec反应器为容量100ml的胶塞玻璃瓶，两端设有进出水口。工作电极选用上述尺寸为10mm
×
10mm
×
3mm大小的石墨片，参比电极为ag/agcl(4.0m kcl)，对电极为面积1cm2的铂片。工作电极与外电路拟采用特殊设计的钛基电子收集器相连。三电极分别连接至八通道电化学工作站的相应端口，以收集电流响应。连续进样系统由曝气装置、连接管和蠕动泵组成。反应器两端分别设有进出口，由蠕动泵以19
±
1ml/min的恒定流量连接至外置曝气装置的储备瓶内。由于传感器需好氧条件下运行，启动前对溶液进行曝气，保持反应器内的高溶解氧浓度。
15.(2)bod响应测定：利用nafion与ptfe包埋剂滴涂法将acinetobacter-378固定于工作电极上，制得人造生物阴极膜bod传感元件。传感器在八通道电化学工作站-0.2v的恒电位下稳定运行，并以时间电流曲线实时记录生物阴极传感器的电流变化，待可重复的稳定的基线电流出现后进行有机物冲击监测。当bod进入系统后，观测电流随时间的变化规律，计算时间-电流曲线的斜率变化，以确定该人造电自养生物阴极膜bod传感元件对不同浓度的bod的响应能力。时间-电流曲线的斜率越大，说明该传感元件对bod的响应越灵敏。
16.有益效果：
17.相比于现有技术，本发明通过将筛选的兼具电自养和异养功能的阴极特性菌acinetobacter-378通过人工合成为生物膜方式制备成生物阴极bod传感元件，实现了对好氧水体中bod的快速检测，克服了生物阳极bod传感元件存在的灵敏度低、假阴性的缺点，为mec型的bod传感元件在水质监测领域提供了一项新技术。
18.1.本发明的微生物膜制备方法操作简单且成本较低。
19.2.使用氧还原生物阴极作为传感元件，将mec型bod传感器的技术范围扩展到好养
自养领域。
20.3.该系统不需要有机物作为电子供体，运行过程中无需补充有机物以保持稳定的基线。
21.4.作为bod传感元件，生物阴极型传感元件比生物阳极型有更低的检出限和更高的灵敏度。
附图说明
22.图1是电自养还原生物阴极bod传感器系统的装置示意图。
23.附图标注：1-八通路恒电位化学工作站，2-循环反应器瓶，3-工作电极，4-参比电极，5-不锈钢网电极，6-出水口，7-进水口，8-蠕动泵，9-循环液储备瓶，10-曝气装置。
24.图2是生物阴极bod传感器对不同浓度葡萄糖溶液的i-t曲线响应图。
25.图3是生物阴极bod传感器对不同浓度乙酸钠溶液的i-t曲线响应图。
26.图4是生物阴极bod传感器对不同浓度下葡萄糖溶液 乙酸钠溶液的i-t曲线响应图。
具体实施方式
27.实施案例1：生物阴极bod传感器对葡萄糖的响应
28.1)生物阴极bod传感器的构建
29.按上述提及的方法将acinetobacter-378修饰到石墨片工作电极上。向mec反应器及循环液储备瓶中加入配置好的阴极电解液，循环液储备瓶中持续曝气以提供无机碳源和电子供体。启动蠕动泵，使整个体系以循环模式进料。三电极分别外接八通道电化学系统，在-0.2v恒电位下对生物膜进行计时电流实时监控，如图1所示。
30.2)生物阴极bod传感器对不同浓度葡萄糖的响应
31.当生物阴极bod传感器达到稳定的基线电流12h后，对其进行有机物的冲击响应测试。为模拟有机负荷的冲击，将不同浓度的葡萄糖溶液添加到循环液储备瓶中，使体系中葡萄糖的最终浓度达到20mg/l、50mg/l、100mg/l，并以没有加入葡萄糖的反应器作为对照组，每组反应器设置2个平行，所有反应器均在室温(25
±
1℃)下运行。
32.实施案例2：生物阴极bod传感器对乙酸钠的响应
33.1)生物阴极bod传感器的构建
34.按上述提及的方法将acinetobacter-378修饰到石墨片工作电极上。向mec反应器及循环液储备瓶中加入配置好的阴极电解液，循环液储备瓶中持续曝气以提供无机碳源和电子供体。启动蠕动泵，使整个体系循环起来。三电极分别外接八通道电化学系统，在-0.2v恒电位下对生物膜进行计时电流实时监控，如图1所示。
35.2)生物阴极bod传感器对不同浓度乙酸钠的响应
36.当生物阴极bod传感器达到稳定的基线电流达12h后，对其进行有机物的冲击响应测试。为模拟有机负荷的冲击，将不同浓度的乙酸钠溶液添加到循环液储备瓶中，使体系中乙酸钠的最终浓度达到20mg/l、50mg/l、100mg/l，并以没有加入乙酸钠的反应器作为对照组，每组反应器设置2个平行，所有反应器均在室温(25
±
1℃)下运行。
37.实施例3：生物阴极bod传感器对葡萄糖，乙酸钠联合冲击的响应
38.1)生物阴极bod传感器的构建
39.按上述提及的方法将acinetobacter-378修饰到石墨片工作电极上。向mec反应器及循环液储备瓶中加入配置好的阴极电解液，循环液储备瓶中持续曝气以提供无机碳源和电子供体。启动蠕动泵，使整个体系循环起来。三电极分别外接八通道电化学系统，在-0.2v恒电位下对生物膜进行计时电流实时监控，如图1所示。
40.2)生物阴极bod传感器对不同浓度葡萄糖，乙酸钠联合冲击的响应
41.当生物阴极bod传感器达到稳定的基线电流达12h后，对其进行有机物的冲击测试。为模拟不同有机负荷的联合冲击，将不同浓度的葡萄糖溶液和乙酸钠溶液添加到循环液储备瓶中，体系中设置的四个浓度为5mg/l葡萄糖溶液 5mg/l乙酸钠溶液、10mg/l葡萄糖溶液 10mg/l乙酸钠溶液、25mg/l葡萄糖溶液 25mg/l乙酸钠溶液、50mg/l葡萄糖溶液 50mg/l乙酸钠溶液，每组反应器设置2个平行，所有反应器均在室温(25
±
1℃)下运行。