一种用于提高免疫力的灵芝组合物及其制备方法与流程

1.本发明属于制药技术领域，具体地，涉及一种用于提高免疫力的灵芝组合物及其制备方法。


背景技术：

2.灵芝(ganoderma lucidum)属于担子菌纲，多孔菌科，灵芝属真菌，素“仙草、瑞草”之美誉，有吉祥如意、尽除百病的含义，赋予灵芝仙丹妙药的美称。
3.灵芝主要生物活性组分包括：多糖、三萜类、蛋白质、氨基酸、甾醇、矿物质等，其中灵芝多糖具有抗氧化清除自由基、刺激胰岛素分泌以促进葡萄糖在外周组织的利用来降低血糖、抗疲劳、促进核酸和蛋白质的合成等多种药理活性，可通过清除自由基、抑制脂质过氧化损伤和增强抗氧化酶的活性对机体起到保护作用；另外，体内自由基过多是诱发炎症、衰老以及肿瘤等疾病的主要因素，因此多糖在抑制肿瘤、免疫调节和消炎等方面也有极其重要的作用；
4.单一灵芝多糖对人体的免疫调节作用较小，且现有灵芝多糖提取率低，纯度低，现有工艺提取多糖的颜色较深，含有较多的色素，影响多糖的质量，同时影响多糖后续如定性、定量及活性分析等研究结果，因此需要进行脱色处理，常用的脱色手段有活性炭脱色，但其脱色残渣难以彻底去除，并且会对多糖产生吸附作用，而过氧化氢脱色由于过氧化氢具有氧化性会破坏多糖结构，树脂脱色法只能用于液体黏度小，色素含量低的料液，并且树脂成本高，易污染，因此，提供一种多糖含量高、纯度高的用于提高免疫力的灵芝组合物及其制备方法是目前需要解决的技术问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种用于提高免疫力的灵芝组合物及其制备方法，以解决背景技术中所提出的技术问题。
6.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
7.一种用于提高免疫力的灵芝组合物的制备方法，包括以下步骤：
8.第一步、将灵芝提取物和姬松茸提取物中加入质量8-10倍的体积分数95％的乙醇溶液，搅拌30-60min后加入脱色剂，温度50℃下，脱色1-2h，过滤，取上清液，浓缩至原体积的1/3得到浸膏；
9.第二步、将明胶、水和甘油在70-80℃化胶30-60min，然后浓缩至水分含量低于40％，加入浸膏，进行压丸处理，在18-28℃下定形4-6h，醇洗3次，冷风干燥24h，得到提高免疫力的灵芝组合物。
10.进一步地，灵芝提取物和姬松茸提取物质量比为3-5：1，明胶、水、甘油和浸膏的用量比为20g：50-70ml：3-5g：10-20g。
11.进一步地，脱色剂由以下步骤制成：
12.步骤s1、向烧瓶中加入3-氨丙基三甲氧基硅烷、thf和三乙胺，温度0℃下滴加乙酰
氯的thf溶液，滴加结束后，室温条件下，搅拌反应24h，反应结束后，旋蒸去除thf，得到酰胺偶联剂；
13.其中，3-氨丙基三甲氧基硅烷、thf、三乙胺和乙酰氯的thf溶液的用量比为5.3mmol：5ml：3ml：5ml，乙酰氯的thf溶液由乙酰氯和thf按照5mmol：5ml混合而成，在碱性条件下，使3-氨丙基三甲氧基硅烷和乙酰氯发生消去hcl的反应，得到酰胺偶联剂，分子结构如下：
[0014][0015]
步骤s2、向三口烧瓶中加入凹凸棒土、氢氧化钠和去离子水，40℃下搅拌0.5h，逐滴滴加cs2，恒温反应1h，加入质量分数10％的硫酸镁溶液和酰胺偶联剂，恒温搅拌30min后减压过滤，滤饼用质量分数40-50％乙醇溶液洗涤2-3次，45℃下真空干燥10-12h，得到改性凹凸棒土；
[0016]
其中，凹凸棒土、氢氧化钠、去离子水、cs2、硫酸镁溶液和酰胺偶联剂的用量比为20g：16g：250-300ml：2.41ml：50ml：2.2-2.5ml，以凹凸棒土为原料，酰胺偶联剂为改性剂，利用氢氧化钠和二硫化碳为黄原酸化剂，得到改性凹凸棒土；
[0017]
步骤s3、将改性凹凸棒土粉碎至45μm以下并与活性炭混合，转速60-80r/min条件下搅拌20-40min后，加入冰醋酸，挤条成型，置于150℃干燥箱中烘干2h，干燥物在氮气保护置于马弗炉内300-320℃下焙烧1-3h，得到脱色剂；
[0018]
其中，改性凹凸棒土、活性炭和冰醋酸的用量比为10g：3g：3.5-4.5ml。
[0019]
进一步地，灵芝提取物由以下步骤制成：
[0020]
步骤a1、将灵芝粉碎过80目筛后置于80-85℃烘箱中干燥6-8h得到灵芝粉，将灵芝粉置于质量分数95％乙醇溶液中浸渍8-12h去除脂类和低聚糖等小分子物质，过滤，滤饼于60℃下干燥至恒重，得到预处理灵芝粉；
[0021]
步骤a2、将预处理灵芝粉置于烧杯中，按照1g：30ml料液比加入酶解液，升温至40℃，功率250w下超声处理100min，然后将产物转移至90℃热水中灭酶10min，趁热减压抽滤后，将滤液浓缩至原体积的1/5，浓缩液加入4倍体积的无水乙醇，4℃下醇沉12h，然后转速4000rpm下离心5min，沉淀收集，上清液浓缩至体积的1/3加入质量分数75％的乙醇溶液4℃下静置24h，然后转速4000rpm下离心5min，合并两次沉淀，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤一次，60℃下干燥至恒重，得到灵芝提取物。
[0022]
进一步地，步骤a1中灵芝粉和乙醇溶液用量比为1-2g：10ml。
[0023]
进一步地，步骤a2中酶解液由纤维素酶、木瓜蛋白酶、半纤维素酶和磷酸缓冲溶液按照3.5g：4g：2.8-3g：100ml混合而成，磷酸缓冲溶液的ph值为5.7。
[0024]
进一步地，姬松茸提取物由以下步骤制成：
[0025]
步骤b1、将干燥的姬松茸粉碎过50目筛，然后加入体积分数95％的乙醇溶液浸泡12h，过滤，滤渣旋蒸去除残留乙醇，得到预处理姬松茸粉；
[0026]
步骤b2、将预处理姬松茸粉和蒸馏水按照1g：20ml混合，煮沸2-3h，过滤收集滤液，残渣置于质量分数5％的氢氧化钠溶液中，50-55℃下浸提2-4h，离心过滤，合并滤液，向滤液中加入浓度3mol/l的乙酸溶液调节ph值为7，再次离心，收集上清液，向上清液中加入体
积分数95％的乙醇溶液至体系中乙醇最终体积分数达到75％，静置12h，离心收集沉淀，于-45℃下冷冻干燥至恒重，得到姬松茸提取物。
[0027]
进一步地，步骤b1中姬松茸粉和乙醇溶液的用量比为200g：700-800ml。
[0028]
进一步地，步骤b2中残渣和氢氧化钠溶液的用量比为1g：10ml。
[0029]
一种用于提高免疫力的灵芝组合物，由以上方法制备得到。
[0030]
本发明的有益效果：
[0031]
本发明提供一种用于提高免疫力的灵芝组合物及其制备方法，通过将灵芝提取物和姬松茸提取物混合脱色制得浸膏，然后与明胶、甘油压制成丸，较为突出的是，本发明采用超声波辅助酶解法提取灵芝多糖，并且采用复合酶(纤维素酶、木瓜蛋白酶、半纤维素酶)，其主要原因是，酸性条件下，复合酶可以更好的溶解灵芝细胞壁的纤维素、半纤维素和木质素结构，使多糖更好的提取出来，本发明加入了姬松茸提取物提高多糖含量，提高组合物的免疫调节性能，并且本发明制备了一种脱色剂，该脱色剂为改性凹凸棒土和活性炭混合烧结得到的产物，表面含有大量的孔隙，兼具活性炭和凹凸棒土的两种吸附性能，能够得吸附色素分子，并且含有黄原酸基、酰胺基团和羟基，具有亲水作用，能够与色素分子之间通过氢键作用进行结合，提高提取物中多糖的纯度，因此，本发明提供的灵芝组合物中多糖含量较高，纯度较高，能够很好地应用于提高免疫力方面。
具体实施方式
[0032]
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0033]
实施例1
[0034]
一种用于提高免疫力的灵芝组合物的制备方法，包括以下步骤：
[0035]
第一步、将30g灵芝提取物和10g姬松茸提取物中加入质量8倍的体积分数95％的乙醇溶液，搅拌30min后加入脱色剂，温度50℃下，脱色1h，过滤，取上清液，浓缩至原体积的1/3得到浸膏；
[0036]
第二步、将20g明胶、50ml水和10g甘油在70℃化胶30min，然后浓缩至水分含量低于40％，然后加入浸膏，进行压丸处理，在18℃下定形4h，醇洗3次，冷风干燥24h，得到提高免疫力的灵芝组合物。
[0037]
其中，脱色剂由以下步骤制成：
[0038]
步骤s1、向烧瓶中加入5.3mmol 3-氨丙基三甲氧基硅烷、5ml thf和3ml三乙胺，温度0℃下滴加5ml乙酰氯的thf溶液，滴加结束后，室温条件下，搅拌反应24h，反应结束后，旋蒸去除thf，得到酰胺偶联剂，乙酰氯的thf溶液由乙酰氯和thf按照5mmol：5ml混合而成；
[0039]
步骤s2、向三口烧瓶中加入20g凹凸棒土、16g氢氧化钠和250ml去离子水，40℃下搅拌0.5h，逐滴滴加2.41ml cs2，恒温反应1h，加入50ml质量分数10％的硫酸镁溶液和2.2ml酰胺偶联剂，恒温搅拌30min后减压过滤，滤饼用质量分数40％乙醇溶液洗涤2次，45℃下真空干燥10h，得到改性凹凸棒土；
[0040]
步骤s3、将10g改性凹凸棒土粉碎至45μm以下并与3g活性炭混合，转速60r/min条
件下搅拌20min后，加入3.5ml冰醋酸，挤条成型，置于150℃干燥箱中烘干2h，干燥物在氮气保护置于马弗炉内300℃下焙烧1h，得到脱色剂；
[0041]
其中，灵芝提取物由以下步骤制成：
[0042]
步骤a1、将10g灵芝粉碎过80目筛后置于80℃烘箱中干燥6h得到灵芝粉，将灵芝粉置于10ml质量分数95％乙醇溶液中浸渍8h去除脂类和低聚糖等小分子物质，过滤，滤饼于60℃下干燥至恒重，得到预处理灵芝粉；
[0043]
步骤a2、将预处理灵芝粉置于烧杯中，按照1g：30ml料液比加入酶解液，升温至40℃，功率250w下超声处理100min，然后将产物转移至90℃热水中灭酶10min，趁热减压抽滤后，将滤液浓缩至原体积的1/5，浓缩液加入4倍体积的无水乙醇，4℃下醇沉12h，然后转速4000rpm下离心5min，沉淀收集，上清液浓缩至体积的1/3加入质量分数75％的乙醇溶液4℃下静置24h，然后转速4000rpm下离心5min，合并两次沉淀，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤一次，60℃下干燥至恒重，得到灵芝提取物，酶解液由纤维素酶、木瓜蛋白酶、半纤维素酶和磷酸缓冲溶液按照3.5g：4g：2.8g：100ml混合而成，磷酸缓冲溶液的ph值为5.7。
[0044]
其中，姬松茸提取物由以下步骤制成：
[0045]
步骤b1、将干燥的200g姬松茸粉碎过50目筛，然后加入700ml体积分数95％的乙醇溶液浸泡12h，过滤，滤渣旋蒸去除残留乙醇，得到预处理姬松茸粉；
[0046]
步骤b2、将预处理姬松茸粉和蒸馏水按照1g：20ml混合，煮沸2h，过滤收集滤液，残渣置于质量分数5％的氢氧化钠溶液中，50℃下浸提2h，离心过滤，合并滤液，向滤液中加入浓度3mol/l的乙酸溶液调节ph值为7，再次离心，收集上清液，向上清液中加入体积分数95％的乙醇溶液至体系中乙醇最终体积分数达到75％，静置12h，离心收集沉淀，于-45℃下冷冻干燥至恒重，得到姬松茸提取物，步骤b2中残渣和氢氧化钠溶液的用量比为1g：10ml。
[0047]
实施例2
[0048]
一种用于提高免疫力的灵芝组合物的制备方法，包括以下步骤：
[0049]
第一步、将40g灵芝提取物和10g姬松茸提取物中加入质量9倍的体积分数95％的乙醇溶液，搅拌40min后加入脱色剂，温度50℃下，脱色1.5h，过滤，取上清液，浓缩至原体积的1/3得到浸膏；
[0050]
第二步、将20g明胶、60ml水和15g甘油在75℃化胶40min，然后浓缩至水分含量低于40％，然后加入浸膏，进行压丸处理，在25℃下定形5h，醇洗3次，冷风干燥24h，得到提高免疫力的灵芝组合物。
[0051]
其中，脱色剂由以下步骤制成：
[0052]
步骤s1、向烧瓶中加入5.3mmol 3-氨丙基三甲氧基硅烷、5ml thf和3ml三乙胺，温度0℃下滴加5ml乙酰氯的thf溶液，滴加结束后，室温条件下，搅拌反应24h，反应结束后，旋蒸去除thf，得到酰胺偶联剂，乙酰氯的thf溶液由乙酰氯和thf按照5mmol：5ml混合而成；
[0053]
步骤s2、向三口烧瓶中加入20g凹凸棒土、16g氢氧化钠和280ml去离子水，40℃下搅拌0.5h，逐滴滴加2.41ml cs2，恒温反应1h，加入50ml质量分数10％的硫酸镁溶液和2.4ml酰胺偶联剂，恒温搅拌30min后减压过滤，滤饼用质量分数45％乙醇溶液洗涤2次，45℃下真空干燥11h，得到改性凹凸棒土；
[0054]
步骤s3、将10g改性凹凸棒土粉碎至45μm以下并与3g活性炭混合，转速70r/min条件下搅拌30min后，加入3.8ml冰醋酸，挤条成型，置于150℃干燥箱中烘干2h，干燥物在氮气
保护置于马弗炉内310℃下焙烧2h，得到脱色剂；
[0055]
其中，灵芝提取物由以下步骤制成：
[0056]
步骤a1、将15g灵芝粉碎过80目筛后置于82℃烘箱中干燥7h得到灵芝粉，将灵芝粉置于10ml质量分数95％乙醇溶液中浸渍10h去除脂类和低聚糖等小分子物质，过滤，滤饼于60℃下干燥至恒重，得到预处理灵芝粉；
[0057]
步骤a2、将预处理灵芝粉置于烧杯中，按照1g：30ml料液比加入酶解液，升温至40℃，功率250w下超声处理100min，然后将产物转移至90℃热水中灭酶10min，趁热减压抽滤后，将滤液浓缩至原体积的1/5，浓缩液加入4倍体积的无水乙醇，4℃下醇沉12h，然后转速4000rpm下离心5min，沉淀收集，上清液浓缩至体积的1/3加入质量分数75％的乙醇溶液4℃下静置24h，然后转速4000rpm下离心5min，合并两次沉淀，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤一次，60℃下干燥至恒重，得到灵芝提取物，酶解液由纤维素酶、木瓜蛋白酶、半纤维素酶和磷酸缓冲溶液按照3.5g：4g：2.9g：100ml混合而成，磷酸缓冲溶液的ph值为5.7。
[0058]
其中，姬松茸提取物由以下步骤制成：
[0059]
步骤b1、将干燥的200g姬松茸粉碎过50目筛，然后加入750ml体积分数95％的乙醇溶液浸泡12h，过滤，滤渣旋蒸去除残留乙醇，得到预处理姬松茸粉；
[0060]
步骤b2、将预处理姬松茸粉和蒸馏水按照1g：20ml混合，煮沸2.5h，过滤收集滤液，残渣置于质量分数5％的氢氧化钠溶液中，53℃下浸提3h，离心过滤，合并滤液，向滤液中加入浓度3mol/l的乙酸溶液调节ph值为7，再次离心，收集上清液，向上清液中加入体积分数95％的乙醇溶液至体系中乙醇最终体积分数达到75％，静置12h，离心收集沉淀，于-45℃下冷冻干燥至恒重，得到姬松茸提取物，步骤b2中残渣和氢氧化钠溶液的用量比为1g：10ml。
[0061]
实施例3
[0062]
一种用于提高免疫力的灵芝组合物的制备方法，包括以下步骤：
[0063]
第一步、将50g灵芝提取物和10g姬松茸提取物中加入质量10倍的体积分数95％的乙醇溶液，搅拌60min后加入脱色剂，温度50℃下，脱色2h，过滤，取上清液，浓缩至原体积的1/3得到浸膏；
[0064]
第二步、将20g明胶、70ml水和20g甘油在80℃化胶60min，然后浓缩至水分含量低于40％，然后加入浸膏，进行压丸处理，在28℃下定形6h，醇洗3次，冷风干燥24h，得到提高免疫力的灵芝组合物。
[0065]
其中，脱色剂由以下步骤制成：
[0066]
步骤s1、向烧瓶中加入5.3mmol 3-氨丙基三甲氧基硅烷、5ml thf和3ml三乙胺，温度0℃下滴加5ml乙酰氯的thf溶液，滴加结束后，室温条件下，搅拌反应24h，反应结束后，旋蒸去除thf，得到酰胺偶联剂，乙酰氯的thf溶液由乙酰氯和thf按照5mmol：5ml混合而成；
[0067]
步骤s2、向三口烧瓶中加入20g凹凸棒土、16g氢氧化钠和300ml去离子水，40℃下搅拌0.5h，逐滴滴加2.41ml cs2，恒温反应1h，加入50ml质量分数10％的硫酸镁溶液和2.5ml酰胺偶联剂，恒温搅拌30min后减压过滤，滤饼用质量分数50％乙醇溶液洗涤3次，45℃下真空干燥12h，得到改性凹凸棒土；
[0068]
步骤s3、将10g改性凹凸棒土粉碎至45μm以下并与3g活性炭混合，转速80r/min条件下搅拌40min后，加入4.5ml冰醋酸，挤条成型，置于150℃干燥箱中烘干2h，干燥物在氮气保护置于马弗炉内320℃下焙烧3h，得到脱色剂；
[0069]
其中，灵芝提取物由以下步骤制成：
[0070]
步骤a1、将20g灵芝粉碎过80目筛后置于85℃烘箱中干燥8h得到灵芝粉，将灵芝粉置于10ml质量分数95％乙醇溶液中浸渍12h去除脂类和低聚糖等小分子物质，过滤，滤饼于60℃下干燥至恒重，得到预处理灵芝粉；
[0071]
步骤a2、将预处理灵芝粉置于烧杯中，按照1g：30ml料液比加入酶解液，升温至40℃，功率250w下超声处理100min，然后将产物转移至90℃热水中灭酶10min，趁热减压抽滤后，将滤液浓缩至原体积的1/5，浓缩液加入4倍体积的无水乙醇，4℃下醇沉12h，然后转速4000rpm下离心5min，沉淀收集，上清液浓缩至体积的1/3加入质量分数75％的乙醇溶液4℃下静置24h，然后转速4000rpm下离心5min，合并两次沉淀，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤一次，60℃下干燥至恒重，得到灵芝提取物，酶解液由纤维素酶、木瓜蛋白酶、半纤维素酶和磷酸缓冲溶液按照3.5g：4g：3g：100ml混合而成，磷酸缓冲溶液的ph值为5.7。
[0072]
其中，姬松茸提取物由以下步骤制成：
[0073]
步骤b1、将干燥的200g姬松茸粉碎过50目筛，然后加入800ml体积分数95％的乙醇溶液浸泡12h，过滤，滤渣旋蒸去除残留乙醇，得到预处理姬松茸粉；
[0074]
步骤b2、将预处理姬松茸粉和蒸馏水按照1g：20ml混合，煮沸3h，过滤收集滤液，残渣置于质量分数5％的氢氧化钠溶液中，55℃下浸提4h，离心过滤，合并滤液，向滤液中加入浓度3mol/l的乙酸溶液调节ph值为7，再次离心，收集上清液，向上清液中加入体积分数95％的乙醇溶液至体系中乙醇最终体积分数达到75％，静置12h，离心收集沉淀，于-45℃下冷冻干燥至恒重，得到姬松茸提取物，步骤b2中残渣和氢氧化钠溶液的用量比为1g：10ml。
[0075]
对比例1
[0076]
将实施例1中的姬松茸提取物去除，其余原料及制备过程不变。
[0077]
对比例2
[0078]
将实施例2中的脱色剂去除，其余原料及制备过程不变。
[0079]
对比例3
[0080]
将实施例3中的脱色剂替换成等量的河南智恩净水材料有限公司出售的木质活性炭。
[0081]
将实施例1-3和对比例1-3的灵芝组合物进行检测，测试内容如下：
[0082]
(一)对小鼠胸腺指数(胸腺平均质量mg/平均体质量g)的影响
[0083]
本试验共分为7组，每组20只小鼠，其中空白组为基础饲料喂养，其余组为各组灵芝组合物(2g/d) 基础饲料喂养，喂养时间为10d，10d后检测其胸腺指数，测试结果如表1所示：
[0084]
表1
[0085]
项目动物数量(只)胸腺指数p值空白组2014.15
±
1.07/实施例12036.42
±
4.82＜0.05实施例22036.38
±
5.79＜0.05实施例32035.91
±
5.26＜0.05对比例12021.54
±
2.21＜0.05对比例22025.41
±
1.41＜0.05
对比例32028.52
±
3.21＜0.05
[0086]
由表1可以看出，实施例1-3灵芝组合物与空白组、对比例1-3相比，对小鼠胸腺指数增加均有显著性差异，效果显著。
[0087]
(二)对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响
[0088]
本试验共分为7组，每组20只小鼠，其中空白组为基础饲料喂养，其余组为各组灵芝组合物(2g/d) 基础饲料喂养，喂养时间为10d，10d后检测淋巴细胞增殖情况，测试结果如表2所示：
[0089]
表2
[0090]
项目动物数量(只)光密度差值p值空白组200.0517
±
0.0235/实施例1200.712
±
0.0315＜0.05实施例2200.715
±
0.0294＜0.05实施例3200.714
±
0.0492＜0.05对比例1200.284
±
0.0345＜0.05对比例2200.314
±
0.0291＜0.05对比例3200.345
±
0.0184＜0.05
[0091]
由表2可以看出，实施例1-3灵芝组合物与空白组、对比例1-3相比，对小鼠测淋巴细胞增殖均有显著性差异，效果显著。
[0092]
(三)对小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响
[0093]
本试验共分为7组，每组20只小鼠，其中空白组为基础饲料喂养，其余组为各组灵芝组合物(2g/d) 基础饲料喂养，喂养时间为10d，10d后检测巨噬细胞吞噬能力情况，测试结果如表3所示：
[0094]
表3
[0095][0096][0097]
由表3可以看出，实施例1-3灵芝组合物与空白组、对比例1-3相比，对巨噬细胞吞噬能力均有显著性差异，效果显著，综上，本发明制备的灵芝组合物具有增加机体免疫力的作用，并非各组成成分功能的简单相加，是各个组成成分的协同增效作用的。
[0098]
在说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结
合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0099]
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。