骨软骨支架及其制备方法与流程

1.本发明涉及骨支架材料领域，尤其涉及一种骨软骨支架及其制备方法。


背景技术：

2.关节软骨是覆盖在关节表面的弹性组织，能够保护软骨下骨组织。软骨缺损通常由衰老、肥胖或机械损伤造成。关节软骨的损伤会导致骨软骨组织逐渐退化，最终导致骨关节炎。如果关节软骨能够保持完整，软骨下骨能够自我再生。然而，由于软骨细胞密度低，且无血管、神经和淋巴组织，故难以自我修复、再生差。尽管过去在组织再生领域获得了巨大的进步，骨软骨缺损再生仍然是具有挑战性的难题。传统的促进骨软骨再生的治疗方法，如骨髓刺激、自体移植物、基质诱导的自体软骨细胞植入，难以实现天然透明软骨样的组织再生。例如，自体移植会引入导致新的创伤，而自体软骨细胞植入则会引发免疫障碍和纤维软骨形成。因此，当前的研究主要致力于在骨软骨缺损区植入支架材料，并在支架中添加活性成分，提升支架的理化性能和促进骨软骨再生的能力。典型骨软骨组织的界面是一个过渡区，包括较软的弹性透明软骨和坚硬的软骨下骨。因此，学者们开始制作双层或多层结构支架，分别模拟透明软骨和软骨下骨的组织结构，形成了硬度和结构渐进变化的支架，实现了更好的修复效果。然而，这些多层支架各层之间通过缝合、粘结或压配结合，其界面结合力较差，增加了支架植入后各层之间分离、脱落的风险。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题在于，提供一种骨软骨支架，其整个结构的结合力良好，制备方法简单，且可完全生物降解。
4.本发明还要解决的技术问题在于，提供一种骨软骨支架的制备方法。
5.为了解决本发明的技术问题，本发明提供了一种骨软骨支架，其包括3d打印成型的软骨下骨层和软骨层；
6.所述软骨层主要由下述重量份的原料制成：
7.甲基丙烯酸酯化明胶20～100份，水900～1200份；
8.所述软骨下骨层主要由下述重量份的原料制成：
9.甲基丙烯酸酯化明胶20～100份，磷酸三钙10～50份，水900～1200份。
10.作为上述技术方案的改进，所述软骨层主要由下述重量份的原料制成：
11.甲基丙烯酸酯化明胶20～100份，黑磷纳米片0.02～0.5份，外泌体0.1～2份，水900～1200份。
12.作为上述技术方案的改进，所述软骨下骨层主要由下述重量份的原料制成：
13.甲基丙烯酸酯化明胶20～100份，磷酸三钙10～50份，黑磷纳米片0.01～1份，外泌体0.01～5份，水900～1200份。
14.作为上述技术方案的改进，所述黑磷纳米片由液相剥离法制得，其粒径为100～1050nm。
15.作为上述技术方案的改进，所述甲基丙烯酸酯化明胶的最大分子量≤1200，所述外泌体为间充质干细胞外泌体。
16.作为上述技术方案的改进，所述软骨层主要由下述重量份的原料制成：
17.甲基丙烯酸酯化明胶45～55份，黑磷纳米片0.03～0.2份，外泌体0.2～1份，水900～1200份。
18.作为上述技术方案的改进，所述软骨下骨层主要由下述重量份的原料制成：
19.甲基丙烯酸酯化明胶40～60份，磷酸三钙20～35份，黑磷纳米片0.05～0.2份，外泌体0.1～1份，水950～1050份。
20.作为上述技术方案的改进，所述软骨下骨层和所述软骨层的厚度比为：(2～4)：(0.5～2)。
21.相应的，本发明还公开了一种上的骨软骨支架的制备方法，其包括：
22.(1)提供甲基丙烯酸酯化明胶、磷酸三钙和水；
23.(2)将甲基丙酸酯化明胶、磷酸三钙、水混合，得到第一混合料；将甲基丙烯酸酯化明胶和水混合，得到第二混合料；
24.(3)3d打印机选用第一混合料打印，得到软骨下骨层，然后选用第二混合料在软骨下骨层上打印形成软骨层，得到中间品；
25.(4)将所述中间品固化，即得到骨软骨支架成品。
26.作为上述技术方案的改进，步骤(3)中，打印过程中，喷嘴到基板的距离为0.05～2mm，喷嘴的移动速度为100～500mm/min；
27.其中，打印第一混合料时，气压为30～40kpa，打印第二混合料时，气压为10～20kpa；
28.实施本发明，具有如下有益效果：
29.本发明中的骨软骨支架，其软骨层和软骨下骨层的主要成分均为甲基丙烯酸酯化明胶，且采用3d打印成型，有效提升了各层之间的结合力。本发明中的软骨下骨层采用甲基丙烯酸酯明胶与磷酸钙复合，得到的支架具备类似软骨下骨的硬度和孔隙，本发明中的软骨层采用甲基丙烯酸酯明胶制成，其具备类似软骨的硬度和弹性。就整体而言，本发明中的支架具备适宜的降解速率，具有良好的生物安全性。此外，本发明在软骨层和软骨下骨层中均引入黑磷纳米片和外泌体，有效提升了关节软骨支架促进骨软骨再生的性能。
附图说明
30.图1是本发明实施4制备得到的骨软骨支架的实物图；
31.图2是本发明实施例1～3、对比例1中软骨下骨层所用原料混合物的溶胀率图；其中，1为对比例1中软骨下骨层所用原料混合物，2为实施例1中软骨下骨层所用原料混合物，3为实施例2中软骨下骨层所用原料混合物，4为实施例3中软骨下骨层所用原料混合物；
32.图3是本发明实施例3、对比例1中软骨下骨层所用原料混合物的降解率实验图(不加胶原酶)，其中，1为对比例1中软骨下骨层所用原料混合物，2为实施例3中软骨下骨层所用原料混合物；
33.图4是本发明实施例3、对比例1中软骨下骨层所用原料混合物的降解率实验图(加胶原酶)，其中，1为对比例1中软骨下骨层所用原料混合物，2为实施例3中软骨下骨层所用
原料混合物；
34.图5是本发明实施例1～3、对比例1中软骨下骨层所用原料混合物的储能模量、损耗模量随时间的变化图；其中，g’1、g”1分别为对比例1中软骨下骨层所用原料混合物的储能模量和损耗模量，g’2、g”2分别为实施例1中软骨下骨层所用原料混合物的储能模量和损耗模量，g’3、g”3分别为实施例2中软骨下骨层所用原料混合物的储能模量和损耗模量，g’4、g”4分别为实施例3中软骨下骨层所用原料混合物的储能模量和损耗模量；
35.图6是本发明实施例1～3、对比例1中软骨下骨层所用原料混合物的储能模量、损耗模量随频率的变化图；其中，g’1、g”1分别为对比例1中软骨下骨层所用原料混合物的储能模量和损耗模量，g’2、g”2分别为实施例1中软骨下骨层所用原料混合物的储能模量和损耗模量，g’3、g”3分别为实施例2中软骨下骨层所用原料混合物的储能模量和损耗模量，g’4、g”4分别为实施例3中软骨下骨层所用原料混合物的储能模量和损耗模量；
36.图7是本发明实施例1～3、对比例1中软骨下骨层所用原料混合物制备得到的第一支架的压缩模量图；1为对比例1中软骨下骨层所用原料混合物制备得到的第一支架，2为实施例1中软骨下骨层所用原料混合物制备得到的第一支架，3为实施例2中软骨下骨层所用原料混合物制备得到的第一支架，4为实施例3中软骨下骨层所用原料混合物制备得到的第一支架；
37.图8是本发明试验例4中空白例的兔膝部标本实物图；
38.图9是本发明试验例4中对照例的兔膝部标本实物图；
39.图10是本发明试验例4中试验例的兔膝部标本实物图；
40.图11是本发明试验例4中空白例的周骨软骨结构的he染色图；
41.图12是本发明试验例4中对照例的周骨软骨结构的he染色图；
42.图13是本发明试验例4中试验例的周骨软骨结构的he染色图。
具体实施方式
43.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图和具体实施方式对本发明作进一步地详细描述。
44.实施例1
45.本实施例提供一种骨软骨支架，其包括3d打印成型的软骨下骨层和软骨层；软骨层主要由下述重量份的原料制成：
46.甲基丙烯酸酯化明胶50份，水1000份；
47.软骨下骨层主要由下述重量份的原料制成：
48.甲基丙烯酸酯化明胶50份，磷酸三钙10份，水1000份。
49.其制备方法为：
50.(1)将50份甲基丙烯酸酯化明胶溶解于1000份水中，并加入10份磷酸三钙，充分搅拌混合均匀，得到第一混合料；
51.将50份甲基丙烯酸酯化明胶溶解于1000份水中，得到第二混合料；
52.(2)挤出3d打印机选用第一混合料，在基板上打印9层总厚度为4.5mm的软骨下骨层，然后选用第二混合料，在软骨下骨层上打印3层总厚度为1.5mm的软骨层，然后采用光照固化，即得。
53.其中，基板的温度为10℃，打印软骨下骨层时，气压为30kpa，打印软骨层时，气压为18kpa。整体打印过程中，喷嘴距离基板的距离为0.3mm，喷嘴的移动速度为150mm/min；打印结束后用400nm，5w光源光照1min，充分固化。
54.实施例2
55.本实施例提供一种骨软骨支架，其包括3d打印成型的软骨下骨层和软骨层；软骨层主要由下述重量份的原料制成：
56.甲基丙烯酸酯化明胶50份，水1000份；
57.软骨下骨层主要由下述重量份的原料制成：
58.甲基丙烯酸酯化明胶50份，磷酸三钙20份，水1000份。
59.其制备方法为：
60.(1)将50份甲基丙烯酸酯化明胶溶解于1000份水中，并加入20份磷酸三钙，在37℃水浴加热条件下充分搅拌混合均匀，得到第一混合料；
61.将50份甲基丙烯酸酯化明胶溶解于1000份水中，得到第二混合料；
62.其中，甲基丙烯酸酯化明胶的制备方法为：
63.称取10g的明胶溶解在100ml的蒸馏水中，50℃溶解后，加入15ml的甲基丙烯酸酐，50℃下反应4h，蒸馏水透析3日(截留分子量：1000)，-80℃冻干，即得甲基丙烯酸化明胶(gelma)。
64.(2)挤出3d打印机选用第一混合料，在基板上打印9层总厚度为3mm的软骨下骨层，然后选用第二混合料，在软骨下骨层上打印3层总厚度为1mm的软骨层，然后采用光照固化，即得。
65.其中，基板的温度为5℃，打印软骨下骨层时，气压为34kpa，打印软骨层时，气压为15kpa。整体打印过程中，喷嘴距离基板的距离为0.2mm，喷嘴的移动速度为300mm/min；打印结束后用405nm，3w光源光照2min，充分固化。
66.实施例3
67.本实施例提供一种骨软骨支架，其包括3d打印成型的软骨下骨层和软骨层；软骨层主要由下述重量份的原料制成：
68.甲基丙烯酸酯化明胶50份，水1000份；
69.软骨下骨层主要由下述重量份的原料制成：
70.甲基丙烯酸酯化明胶50份，磷酸三钙30份，水1000份。
71.其制备方法为：
72.(1)将50份甲基丙烯酸酯化明胶溶解于1000份水中，并加入30份磷酸三钙，在37℃水浴加热条件下充分搅拌混合均匀，得到第一混合料；
73.将50份甲基丙烯酸酯化明胶溶解于1000份水中，得到第二混合料；
74.其中，甲基丙烯酸酯化明胶的制备方法为：
75.称取10g的明胶溶解在100ml的蒸馏水中，50℃溶解后，加入15ml的甲基丙烯酸酐，50℃下反应4h，蒸馏水透析3日(截留分子量：1000)，-80℃冻干，即得甲基丙烯酸化明胶(gelma)。
76.(2)挤出3d打印机选用第一混合料，在基板上打印9层总厚度为3mm的软骨下骨层，然后选用第二混合料，在软骨下骨层上打印3层总厚度为1mm的软骨层，然后采用光照固化，
即得。
77.其中，基板的温度为5℃，打印软骨下骨层时，气压为34kpa，打印软骨层时，气压为15kpa。整体打印过程中，喷嘴距离基板的距离为0.2mm，喷嘴的移动速度为300mm/min；打印结束后用405nm，3w光源光照2min，充分固化。
78.实施例4
79.本实施例提供一种骨软骨支架，其包括3d打印成型的软骨下骨层和软骨层；软骨层主要由下述重量份的原料制成：
80.甲基丙烯酸酯化明胶50份，黑磷纳米片0.1份，间充质干细胞外泌体0.5份，水1000份；
81.软骨下骨层主要由下述重量份的原料制成：
82.甲基丙烯酸酯化明胶50份，磷酸三钙30份，黑磷纳米片0.1份，间充质干细胞外泌体0.5份，水1000份。
83.其制备方法为：
84.(1)将50份甲基丙烯酸酯化明胶溶解于1000份水中，并加入30份磷酸三钙、0.1份黑磷纳米片，在37℃水浴加热条件下充分搅拌混合均匀，然后加入0.5份间充质干细胞外泌体，充分混合后得到第一混合料；
85.将50份甲基丙烯酸酯化明胶溶解于1000份水中，然后加入0.1份黑磷纳米片，0.5份间充质干细胞外泌体，充分混合后得到第二混合料；
86.其中，甲基丙烯酸酯化明胶的制备方法为：
87.称取10g的明胶溶解在100ml的蒸馏水中，50℃溶解后，加入15ml的甲基丙烯酸酐，50℃下反应4h，蒸馏水透析3日(截留分子量：1000)，-80℃冻干，即得甲基丙烯酸化明胶(gelma)。
88.其中，黑磷纳米片的制备方法为：
89.将25mg初始黑磷纳米片溶于50ml纯水中，通入3分钟氩气以消除溶解氧分子，减少剥离过程中的氧化。然后在冰浴条件下对混合溶液进行超声处理12h(强度：250w，开/关循环：45s/15s)。将所得棕色分散液以1000rpm离心10min以去除大块的黑磷纳米片，并收集含有黑磷纳米片的上清液。然后，将收集的含黑磷纳米片的上清液放入离心管中，并在4℃条件下，以3750rpm离心30min以除去水。将获得的纯黑磷纳米片重新悬浮在pbs中，以便进一步使用，并在4℃下储存。
90.(2)挤出3d打印机选用第一混合料，在基板上打印9层总厚度为3mm的软骨下骨层，然后选用第二混合料，在软骨下骨层上打印3层总厚度为1mm的软骨层，然后采用光照固化，即得。
91.其中，基板的温度为5℃，打印软骨下骨层时，气压为34kpa，打印软骨层时，气压为15kpa。整体打印过程中，喷嘴距离基板的距离为0.2mm，喷嘴的移动速度为300mm/min；打印结束后用405nm，3w光源光照2min，充分固化。
92.对比例1
93.本对比例提供一种骨软骨支架，其配方为：
94.甲基丙烯酸酯化明胶50份，水1000份。
95.其制备方法为：
96.(1)将50份甲基丙烯酸酯化明胶溶解于1000份水中，得到混合料；
97.(2)挤出3d打印机选用混合料，在基板上打印12层总厚度为4mm的支架层，然后采用光照固化，即得。
98.其中，基板的温度为5℃，气压为15kpa。整体打印过程中，喷嘴距离基板的距离为0.2mm，喷嘴的移动速度为300mm/min；打印结束后用405nm，3w光源光照2min，充分固化。
99.试验例1
100.将实施例1～3、对比例1中的软骨下骨层所用原料混合物采用实施例2中软骨下骨层的打印方法进行打印，得到第一支架；并对第一支架的溶胀行为进行测定；具体方法如下：
101.将支架置于37℃去离子水中，在指定的时间间隔(0h、2h、6h、12h、24h)，从培养基中取出支架后快速用滤纸吸去表面的水分，作为每个时间节点的湿重称重记录样品质量为mw，24h后将样品冻干并称重，作为干重m0；每个样品平行做三次实验，求其平均值，样品溶胀率按照以下公式计算：
102.溶胀率(％)＝mw/m0×
100％
103.具体实验结果如图2所示。从图中可以看出，6h后各实施例、对比例样品基本达到溶胀平衡。此外还可以看出，每个时间点对比例1的溶胀率最大，随着组合物中磷酸三钙含量的增加，溶胀率呈下降的趋势，这是因为磷酸三钙的加入，增强了水凝胶的硬度，导致溶胀减缓。
104.试验例2
105.将实施例3、对比例1中的软骨下骨层所用原料混合物进行降解试验，具体方法如下：
106.取原料混合物，加入0.25％(w/v)的光引发剂lap，取200μl注入直径为9mm的模具中，用405nm的光源，距离2cm照射40s使其固化，制得一批的圆柱样品，每个样品先进行酒精杀菌处理，再放入无菌pbs溶液放置过夜。随后将样品放入孔板中，每个试样加入2ml ii型胶原酶溶液(2u/ml，用pbs配制)，放入培养箱。然后在0h、1h、3h、6h、12h的时间节点分别拿出3个样品，吸干离心管中液体，把样品放进-80℃冰箱里冷冻放置，所有时间节点结束后把所有样品冻干后称质量。降解率由下式计算：
107.降解率(％)＝(w
0-w
t
)/w
t
×
100％；
108.式中，w0为试样的原始重量，w
t
为各时间节点的试样的重量。
109.结果如图3、图4所示，从图中看出，在28天观察期内，软骨下骨层所用原料混合物绝大部分完成降解。无论在普通pbs降解介质中还是在含有降解酶的pbs降解介质中，对比例1的降解速度均较实施例3的原料要快，这主要是因为磷酸三钙的加入增加了其力学性能，降低了其溶胀率从而导致降解速率变缓。此外还可得知，在有酶的环境下，软骨下骨层所用原料混合物的降解速率比无酶条件下要快。
110.试验例3
111.将实施例3、对比例1中的软骨下骨层所用原料混合物进行动态流变实验，具体方法如下：
112.采用流dhr-2型流变仪(ta仪器，美国)对软骨下骨层所用原料混合物进行了动态流变实验，所用夹具为40mm平板。对于温敏过程，采用振荡模式，测试温度范围为5-40℃，
升/降温速率为5℃/min，应变为1％，频率为2rad/s。对于固化后的组合物，采用振荡-频率扫描，测试温度为25℃，应变1％，角频率扫描范围：0.1-100rad/s。以405nm光源固化组合物制备直径为40mm样品，光源强度25mw/cm2，光照时间30s。使用旋转流变仪对样品进行振荡-应变扫描，振荡角速率为10rad/s，应变1％、温度25℃，应变扫描时间120s。
113.组合物的流变性能见图5和图6。由图中可见，时间扫描振动实验表明软骨下骨层所用原料混合物紫外线照射后具有稳定的储能模量(g’)和损耗模量(g”)，并且g’明显高于g”，这表明软骨下骨层所用原料混合物形成了水凝胶。此外，模量表现出明显的磷酸三钙浓度依赖性。随着磷酸三钙浓度的增加，模量显著增加。
114.试验例4
115.将实施例1～3、对比例1中的软骨下骨层所用原料混合物采用实施例2中软骨下骨层的打印方法进行打印，得到第一支架；将第一支架切成直径4mm、高度5mm的圆柱体，并进行力学性能试验，具体方法如下：
116.十字头速度设置为10mm/min。每次试验至少使用了4个样品。
117.试验结果如图7所示，从图中可以看出，与其他组相比，实施例3中的第一支架在承受30％以上的应变时，其压缩模量显著增加，说明该第一支架能够承受更多的机械力。力学性能测试证明，本发明制备的支架具备良好的机械性能，植入缺损部位后可承受生理活动带来的压力。
118.试验例5骨软骨支架促进骨软骨再生性能评价
119.选用本发明实施例4制备的骨软骨支架、对比例1制备的骨软骨支架进行实验，具体方法如下：
120.(1)膝部骨软骨缺损模型的构建
121.取健康成年新西兰兔，以3％戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉，全麻成功后，剔除膝部毛发，清洁表面皮肤，从中线小心依次切开左右双侧膝部皮肤及皮下组织，剥离骨膜，于膝部高速旋转骨钻制造直径4mm、深4mm的骨缺损模型。
122.(2)膝部骨软骨缺损修复手术
123.在骨软骨缺损处分别植入实施例4的骨软骨支架(试验例)、对比例1的骨软骨支架(对照例)以及不做处理(空白例)，缝合，术毕清洁并用碘伏消毒创口部位。术后定时观察记录其生理状况。自手术起14个周时将各批次中兔子麻醉放血处死，取修兔膝部，生理盐水清洗周围血液，4％多聚甲醛固定48h，对取得的软骨组织样品进行组织学观察和免疫组化分析，判断骨组织工程支架材料对膝部骨软骨缺损修复的效果。
124.骨软骨缺损的再生效果评价
125.第14周后兔膝标本如图8～图10所示，从图中可见，试验例的再生效果最好，再生软骨样表面光滑，新生组织与相邻组织融合。在第14周观察到无边界的软骨，说明缺损导致的软骨退化得到抑制。根据国际软骨修复协会分级，基于肉眼观察，空白例严重异常(iv级)，对照例为异常(ii级)，试验例在14周时正(i级)。
126.第14周后周骨软骨结构的he染色结果如图11～13所示。由图中可以看出，试验例的支架植入后新生骨、软骨明显更多，骨软骨组织修复状态明显好于对照例和空白例。
127.以上所述是发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本
发明的保护范围。