尿液蛋白在诊断代谢性肝病中的应用的制作方法

1.本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及尿液蛋白在诊断代谢性肝病中的应用。


背景技术：

2.非酒精性脂肪性肝病(nafld)是一种与胰岛素抵抗和遗传易感密切相关的代谢应激性肝损伤，其疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪肝(nafl)和非酒精性脂肪性肝炎(nash)、肝硬化和肝细胞癌。nafld的全球发病率高达25％，已成为全球和中国第一大慢性肝脏疾病，也是美国肝移植的首位病因。2020年国际专家共识建议将nafld更名为“代谢相关脂肪性肝病(mafld)”。mafld的诊断不再依赖于肝脏穿刺，而通过影像学或血清标记物，并合并肥胖和2型糖尿病即可直接诊断mafld。
3.肝脏脂肪变是胰岛素抵抗和心血管事件发生的独立预测因素，也是mafld的第一步诊断。肝脏穿刺仍然是诊断肝脏脂肪变的金标准。然而，潜在的肝脏穿刺活检的出血风险和有创性限制了肝脏穿刺在临床的应用。所以，血液及尿液标记物，以及影像学诊断被很多研究推荐用于区分“轻度”和“重度”脂肪变，并用于诊断mafld。
4.磁共振成像质子密度脂肪含量测定(mri-pdff)是一种新型影像诊断肝脏脂肪变的手段。轻度肝脏脂肪变被定义于mri-pdff 5-10％，重度肝脏脂肪变被定义mri-pdff》10％。mri-pdff已经被广泛认可作为临床药物试验和临床观察研究的金标准。但是，潜在辐射暴露风险、操作技术要求高和高耗时(30-60min/病人)限制了mri-pdff用于mafld和肝脏脂肪变的临床应用。因而，开发有效的尿液和血液标记物用于诊断mafld的肝脏脂肪变有待深入研究。
5.尿液是最方便获得的诊断标记物，比血液更稳定且更易获取。尿液可以反应身体疾病的程度，并能更好的做到诊断和筛查。本研究首次利用尿液中α1酸性糖蛋白、铜蓝蛋白和巯基丙酮酸硫转移酶的表达高低区分正常、轻度脂肪肝和重度脂肪肝。


技术实现要素：

6.本技术为了解决上述技术问题提供尿液中α1酸性糖蛋白、铜蓝蛋白和巯基丙酮酸硫转移酶在诊断代谢性肝病中的应用。
7.本技术通过下述技术方案实现：
8.尿液蛋白在诊断代谢性肝病中的应用，所述尿液蛋白包括α1酸性糖蛋白，和/或铜蓝蛋白，和/或巯基丙酮酸硫转移酶。
9.进一步的，所述诊断中的应用包括区分轻度肝脏脂肪变和重度肝脏脂肪变。
10.进一步的，体液样本中α1酸性糖蛋白、铜蓝蛋白和巯基丙酮酸硫转移酶的表达量与肝脏脂肪变的严重程度正相关。
11.优选地，所述体液样本为人体尿液。
12.进一步的，所述α1酸性糖蛋白、铜蓝蛋白和巯基丙酮酸硫转移酶表达量的检测方法为蛋白质免疫印迹法(western blot)。
13.进一步的，所述α1酸性糖蛋白、铜蓝蛋白和巯基丙酮酸硫转移酶表达量的检测方法为酶联免疫吸附剂测定(elisa)。
14.检测α1酸性糖蛋白、铜蓝蛋白和巯基丙酮酸硫转移酶表达量的产品在制备诊断代谢性肝病的产品中的应用。
15.进一步的，所述产品包括试剂盒。
16.优选地，所述试剂盒检测尿液样本中的α1酸性糖蛋白、铜蓝蛋白和巯基丙酮酸硫转移酶。
17.与现有技术相比，本技术具有以下有益效果：
18.本发明通过尿液蛋白组学测定，发现14个蛋白可能可以用于诊断肝脏脂肪变，进一步通过spss统计学软件利用线性回归分析，结果显示α1酸性糖蛋白(orm1)、铜蓝蛋白(ceruloplasmin)和巯基丙酮酸硫转移酶(mpst)与肝脏损伤指标中的谷丙转氨酶(alt)、纤维化(fibrosis)、谷草转氨酶(ast)、谷酰转肽酶(ggt)、甘油三酯(tg)、空腹血糖(glu)、胰岛素抵抗稳态模型评价(homa-ir)和c-反应蛋白(crp)相关性最高(p值＜0.05)，最能揭示临床mafld患者的疾病状态，从而帮助临床诊断mafld病人并判断疾病严重程度。另外，通过蛋白质免疫印迹法(western blot)和酶联免疫吸附剂测定(elisa)验证了尿液α1酸性糖蛋白、铜蓝蛋白和巯基丙酮酸硫转移酶诊断mafld患者肝脏脂肪变的准确率。
附图说明
19.此处所说明的附图用来提供对本技术实施方式的进一步理解，构成本技术的一部分，并不构成对本发明实施方式的限定。
20.图1是本发明的研究流程示意图；
21.图2中a是elisa试验中不同组别尿液α1酸性糖蛋白的含量对比图；b是westernblot试验中不同组别尿液α1酸性糖蛋白的蛋白免疫印记光密度图；c是western blot试验中不同组别尿液α1酸性糖蛋白的蛋白免疫印记光密度的灰度值除以尿肌酐的相对比值图；d是elisa试验中不同组别尿液铜蓝蛋白的含量对比图；e是western blot试验中不同组别尿液铜蓝蛋白的蛋白免疫印记光密度图；f是western blot试验中不同组别尿液铜蓝蛋白的蛋白免疫印记光密度的灰度值除以尿肌酐的相对比值图；g是elisa试验中不同组别尿液巯基丙酮酸硫转移酶的含量对比图；h是western blot试验中不同组别尿液巯基丙酮酸硫转移酶的蛋白免疫印记光密度图；i是western blot试验中不同组别尿液巯基丙酮酸硫转移酶的蛋白免疫印记光密度的灰度值除以尿肌酐的相对比值图。
22.图3是根据尿液中三个蛋白的表达浓度，通过spss的曲线下面积(roc)分析判定诊断效率的方法，其中a是α1酸性糖蛋白用于区分诊断轻度脂肪肝与正常的诊断效率，其曲线下面积(roc)为0.911；b是α1酸性糖蛋白用于区分诊断重度脂肪肝与轻度脂肪肝的诊断效率，其曲线下面积(roc)为0.625；c是尿液铜蓝蛋白用于区分诊断轻度脂肪肝与正常的诊断效率，其曲线下面积(roc)为0.964；d是尿液铜蓝蛋白用于区分诊断重度脂肪肝与轻度脂肪肝的诊断效率，其曲线下面积(roc)为0.708；e是尿液巯基丙酮酸硫转移酶用于区分诊断轻度脂肪肝与正常的诊断效率，其曲线下面积(roc)为0.775；f是尿液巯基丙酮酸硫转移酶用于区分诊断重度脂肪肝与轻度脂肪肝的诊断效率，其曲线下面积(roc)为0.700。
具体实施方式
23.为使本技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将结合实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施方式的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
24.实施例一
25.(1)临床样本采集
26.搜集蛋白组学队列共27人，利用mri-pdff对患者肝脏脂肪变定量并分组，其中健康对照组7人，轻度肝脏脂肪变组(mri-pdff为5-10％)8人，中重度肝脏脂肪变组(mri-pdff＞10％)12人。三组患者人群的临床数据见下表，alt为谷丙转氨酶，ast为谷草转氨酶，ggt为谷氨酰转肽酶，hba1c为糖化血红蛋白a1c，ins为胰岛素抵抗，homa-ir为胰岛素抵抗稳态模型评价。
27.表1健康对照组、轻度肝脏脂肪变组和重度肝脏脂肪变组三组人群的临床数据
[0028][0029]
(2)尿液蛋白组学测定
[0030]
尿液蛋白组学测定步骤如下：
[0031]
1.收集1ml人尿蛋白组学样本，2000
×
g离心4min，清除细胞碎片。
[0032]
2.上清转入10-kda超滤管，用200μl ua缓冲液(8m尿素，0.1m tris，ph 8.5)洗涤两次。用含20mm二硫苏糖醇(dtt)的200μlua缓冲液重悬尿蛋白，37℃孵育4h。
[0033]
3.用50mm碘乙酰胺(iaa)在室温黑暗下烷基化30min。
[0034]
4.样本用200μl 50mm碳酸氢铵(nh4hco3)洗涤3次，室温下13000
×
g离心15min。
[0035]
5.每个样本加1μg胰蛋白酶和lys-c，37℃孵育14h。
[0036]
6.超滤管用100μl蒸馏水洗涤2次，在室温下13000g离心15min。
[0037]
7.收集下层蛋白多肽，由定量比色肽测定试剂盒测定浓度，消化后的蛋白多肽在真空下干燥，用20μl的负载缓冲液(0.1％甲酸in h2o，fa)溶解。6μl样品在orbitrapexploris 480、faims和easy-nlc1200联用仪上进行lc-ms/ms分析。
[0038]
(3)尿液蛋白组学测定结果
[0039]
通过尿液蛋白组学测定，发现14个蛋白可能可以用于诊断肝脏脂肪变，进一步通过spss统计学软件利用线性回归分析14个蛋白与各肝脏临床指标的相关性，分析结果见表2。结果显示α1酸性糖蛋白(orm1)、铜蓝蛋白(ceruloplasmin)和巯基丙酮酸硫转移酶(mpst)与临床指标中的谷丙转氨酶(alt)、纤维化(fibrosis)、谷草转氨酶(ast)、谷酰转肽酶(ggt)、甘油三酯(tg)、空腹血糖(glu)、胰岛素抵抗稳态模型评价(homa-ir)和c-反应蛋白(crp)相关性最高(p值《0.05)，最能揭示临床mafld病人的疾病状态，从而帮助临床诊断mafld病人并判断疾病严重程度。
[0040]
表2尿液蛋白与各临床指标的线性回归分析结果(数值表示：相关性，p值，p值《0.05为统计学有意义)
[0041][0042]
实施例二
[0043]
为进一步验证α1酸性糖蛋白(orm1)、铜蓝蛋白(ceruloplasmin)和巯基丙酮酸硫转移酶(mpst)诊断代谢性肝病的准确率，分别开展了蛋白质免疫印迹法(western blot)和酶联免疫吸附剂测定(elisa)。搜集验证队列共30人，利用mri-pdff对患者肝脏脂肪变定量并分组，其中健康对照组10人，轻度肝脏脂肪变组(mri-pdff为5-10％)10人，重度肝脏脂肪变组(mri-pdff＞10％)10人。
[0044]
(一)蛋白免疫印迹法检测尿液α1酸性糖蛋白、铜蓝蛋白和巯基丙酮酸硫转移酶水平
[0045]
(1)试验步骤
[0046]
1.制备sds-聚丙烯胺蛋白凝胶
[0047]
2.蛋白样本的制备
[0048]
1)、尿液处理：-20℃预冷丙酮，与尿液样本体积4:1(在冰上进行，缓慢加入丙酮，以免造成局部蛋白丙酮过高，导致蛋白变性)。-20℃过夜，12000
×
g，4℃，离心20min，弃掉上清，沉淀在通风橱干燥，然后用蛋白裂解液对蛋白沉淀复融。
[0049]
2)、取出已提取的细胞蛋白样品，采用bca法并根据实验操作说明加入待测样品和bca混合试剂，置于37℃敷箱内孵育30min后，立即使用酶标仪读数，取波长570nm，读取各孔od值。根据bca标准曲线方程计算各蛋白样品浓度。选用合适的上样量(30～40μg)，将蛋白样品与等体积的2
×
上样缓冲液loading buffer充分混合后置于恒温金属浴100℃煮3～5min；待冷却后置于离心机中瞬时离心，直接用于sds-page电泳。
[0050]
3.蛋白电泳
[0051]
将制备好的凝胶安装于电泳装置中，配制1
×
甘氨酸电泳缓冲液，倒入电泳槽中。将制备好的蛋白样品依次缓慢完全加入凝胶孔中。上样完成后采用80v恒压电泳，直至溴酚蓝条带清晰可见跑出浓缩胶后，升压至120v继续电泳。待溴酚蓝见底后停止电泳，取出凝胶，切除浓缩胶和多余的分离胶，置于预冷的转膜工作液中备用。
[0052]
4.转膜
[0053]
提前裁剪准备与凝胶大小相匹配的pvdf膜和滤纸。先将pvdf膜置于甲醇中浸泡并活化，约30s，再将pvdf膜浸泡于双蒸水中去除多余的甲醇；最后将pvdf膜和滤纸置于预冷的转膜工作液。按照一定顺序(黑色夹板-海绵-6张滤纸-凝胶-pvdf膜-6张滤纸-海绵-白色夹板)和正确的正负极方向安装转膜装置，加满转膜工作液，400ma恒电流转膜，转膜时间根据目的蛋白大小而定。
[0054]
5.封闭
[0055]
转膜结束后，将pvdf膜放入5％脱脂牛奶(用tbst配制)，室温封闭约1h。
[0056]
6.一抗孵育
[0057]
根据抗体说明书，封闭液配制合适浓度的一抗，加入1ml稀释后的抗体，4℃冰箱孵育过夜。
[0058]
7.二抗孵育
[0059]
tbst洗膜，10min
×
3次。封闭液配制合适浓度的二抗，加入5ml稀释后的二抗，封袋室温孵育60min。
[0060]
8.曝光显影
[0061]
tbst洗膜，10min
×
3次。将等体积ecl的a和b两种试剂等体积混合，配制ecl工作液；pvdf膜置于干净保鲜膜内，均匀滴加ecl工作液1ml。置于曝光显影器96 sw 1.1中采集并分析条带信息。
[0062]
(2)试验结果
[0063]
westernblot试验结果如图2所示，其中图2b、图2e和图2h分别表示在正常组、轻度脂肪肝组和重度脂肪肝组的相同体积尿液中α1酸性糖蛋白、铜蓝蛋白和巯基丙酮酸硫转移
酶的蛋白印迹。然后，以尿肌酐表达量为参数，矫正每一个样本的蛋白总量在相同水平，以每一个样本的蛋白印迹灰度值除以该样本的尿肌酐水平，得出尿液中α1酸性糖蛋白(图2c)、铜蓝蛋白(图2f)和巯基丙酮酸硫转移酶(图2i)相对表达高低。结果显示，在正常组、轻度脂肪肝组和重度脂肪肝组中，α1酸性糖蛋白、铜蓝蛋白和巯基丙酮酸硫转移酶表达水平逐渐增加，且p值均小于0.05，差异有统计学意义。
[0064]
(二)酶联免疫法检测尿液α1酸性糖蛋白、铜蓝蛋白和巯基丙酮酸硫转移酶水平
[0065]
(1)试验步骤
[0066]
1.准备所有试剂、样品和标准品。
[0067]
2.每孔加入100μl标准品或样品，37℃孵育2h。
[0068]
3.取100μl，加入制备的检测试剂a，37℃孵育1h。
[0069]
4.抽吸洗3次。
[0070]
5.加入100μl制备的检测试剂b，37℃孵育30min。
[0071]
6.抽吸、清洗5次。
[0072]
7.加入90μl底物溶液，37℃孵育15～25min。
[0073]
8.加入50μl停止液，在450nm处立即读取。
[0074]
(2)试验结果
[0075]
elisa试验结果如图2所示，α1酸性糖蛋白(图2a)、铜蓝蛋白(图2d)和巯基丙酮酸硫转移酶(图2g)的含量在正常组到轻度脂肪肝和重度脂肪肝的尿液中也呈现上升的趋势。其中，正常组人群中α1酸性糖蛋白含量为1.19
±
1.085ng/ml，尿液铜蓝蛋白含量为3.02
±
1.43mg/ml，尿液巯基丙酮酸硫转移酶含量为5.22
±
0.66ngml；轻度脂肪肝组人群中尿液α1酸性糖蛋白含量为3.41
±
2.61ng/ml，尿液铜蓝蛋白含量为4.27
±
1.18mg/ml，尿液巯基丙酮酸硫转移酶含量为5.79
±
0.50ng/ml；重度脂肪肝组人群中尿液α1酸性糖蛋白含量为4.68
±
3.15ng(p＜0.001)，尿液铜蓝蛋白含量为5.61
±
1.31mg/ml，尿液巯基丙酮酸硫转移酶含量为6.45
±
0.97ng/ml(p《0.001)。
[0076]
(三)利用elisa试验结果，通过spss的曲线下面积(roc)分析判定诊断效率的方法，发现α1酸性糖蛋白诊断轻度肝脏脂肪变的诊断效率为roc 0.911(图3a)，诊断重度肝脏脂肪变的诊断效率为roc 0.625(图3b)；尿液铜蓝蛋白诊断轻度肝脏脂肪变的诊断效率为roc 0.964(图3c)，诊断重度肝脏脂肪变的诊断效率为roc0.708(图3d)；尿液巯基丙酮酸硫转移酶诊断轻度肝脏脂肪变的诊断效率为roc 0.775(图3e)，诊断重度肝脏脂肪变的诊断效率为roc0.700(图3f)。
[0077]
综上所述，尿液中α1酸性糖蛋白、铜蓝蛋白和巯基丙酮酸硫转移酶可用于诊断mafld患者肝脏脂肪变以及区分轻度肝脏脂肪变和重度肝脏脂肪变。
[0078]
以上的具体实施方式，对本技术的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。