一种同时检测蔗糖和葡萄糖双组分溶液浓度的方法与流程

1.本发明属于葡萄糖和蔗糖在线检测技术领域，涉及一种同时检测蔗糖和葡萄糖双组分溶液浓度的方法。


背景技术：

2.葡萄糖是自然界分布最广且最为重要的一种单糖，它是一种多羟基醛，在生物学领域中具有重要地位，是活细胞的能量来源和新陈代谢中间产物，即生物的主要供能物质。葡萄糖在糖果制造业、发酵行业和医药领域有着广泛应用。在糖果制造业中，葡萄糖作为最终产品的重要组分，含量过高会引起糖尿病以及肥胖等问题；在发酵领域，葡萄糖常常用于酶供能或者作为发酵底物，葡萄糖含量影响着发酵产品的品质及产量；在医药行业，葡萄糖溶液可用于人体输入，不同浓度的葡萄糖具有不同的药理作用。
3.蔗糖是食糖的主要成分，双糖的一种，由一分子葡萄糖的半缩醛羟基与一分子果糖的半缩醛羟基彼此缩合脱水而成。蔗糖几乎普遍存在于植物界的叶、花、茎、种子及果实中。在甘蔗、甜菜及槭树汁中含量尤为丰富。蔗糖味甜，是重要的食品和甜味调味品。蔗糖被人食用后，在胃肠中由转化酶转化成葡萄糖和果糖，一部分葡萄糖随着血液循环运往全身各处，在细胞中氧化分解，最后生成二氧化碳和水并产生能量，为脑组织功能、人体的肌肉活动等提供能量并维持体温。但是大量使用蔗糖会引起身体的血糖浓度升高，从而导致疾病。
4.由此可见，葡萄糖和蔗糖的检测对于不同领域都是十分重要。目前，针对葡萄糖和蔗糖的检测方法有氧化还原滴定法、分光光度计法、高效液相色谱法以及酶法等。其中在通过构建酶生物传感器来进行蔗糖检测的过程中由于负载了葡萄糖氧化酶，导致最终的电流信号来自于葡萄糖和蔗糖的总信号，会导致检测结果出现误差。目前针对葡萄糖和蔗糖单独检测的电极虽然都有涉及，但是针对蔗糖检测过程中，葡萄糖对蔗糖浓度影响误差有效消除的研究还未见报道。


技术实现要素：

5.本发明针对传统葡萄糖和蔗糖检测过程中存在的问题提出一种新型的同时检测蔗糖和葡萄糖双组分溶液浓度的方法。
6.为了达到上述目的，本发明是采用下述的技术方案实现的：
7.本发明通过设定校准方法完成对葡萄糖和蔗糖的各自定标，最终通过电流的差分计算完成各自浓度的检测。实现葡萄糖和蔗糖的同时检测对于人类健康、糖果制造业、发酵行业以及医药行业具有重要意义。
8.本发明的技术方案为：一种用于同时检测蔗糖和葡萄糖双组分溶液浓度的方法，具体步骤如下：
9.(1)蔗糖酶电极的制备：取蔗糖水解酶10-100u、葡萄糖变旋酶10-100u和葡萄糖氧化酶10-180u溶于100μl缓冲溶液中，配制蔗糖水解酶、葡萄糖变旋酶和葡萄糖氧化酶的混
合酶溶液，向酶溶液加入10％-25％的交联剂1μl，混匀；取1-5μl酶溶液滴加到工作电极区域，静置2h，待酶溶液完全固化，进行冷冻干燥；其中用于酶溶液配制的溶剂为含有氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾的缓冲溶液,缓冲溶液的ph为4-10。
10.(2)葡萄糖酶电极的制备：取葡萄糖氧化酶10-180u溶于100μl缓冲溶液中，配制葡萄糖氧化酶的酶溶液，向酶溶液加入10％-25％的交联剂1μl，混匀；取1-5μl酶溶液滴加到工作电极区域，静置2h，待酶溶液完全固化，进行冷冻干燥；其中用于酶溶液配制的溶剂为含有氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾的缓冲溶液,缓冲溶液的ph为4-10。
11.蔗糖酶电极、葡萄糖酶电极、参比电极、对电极、检测池1、检测池2和信号采集计算系统构成生物传感器。
12.混合酶溶液中蔗糖水解酶的浓度为0.1-1u/μl，混合酶溶液中葡萄糖变旋酶的浓度为0.1-1u/μl，混合酶溶液中葡萄糖氧化酶的浓度为0.1-1.8u/μl，酶混合溶液中的交联剂含量为0.1-0.25％，交联剂可为戊二醛、丹宁酸、壳聚糖、聚赖氨酸以及其他一系列可用于酶固定的交联剂。
13.步骤(1)中所取酶溶液的量为1-5μl；步骤(2)中用于配制酶的缓冲溶液的ph为4-10；步骤(2)中酶溶液中葡萄糖氧化酶的浓度为0.1-1.8u/μl；步骤(1)中混合酶溶液中葡萄糖氧化酶的浓度和步骤(2)中酶溶液中葡萄糖氧化酶的浓度保持一致；所取混合酶溶液的量和步骤(2)中所取酶溶液的量保持一致。
14.对电极可选用碳电极、铂丝电极、石墨电极以及可用于导电的材料；中参比电极可为氢电极、ag/agcl电极、甘汞电极以及其他一切具备稳定电位的可用于作为参比电极的电极。
15.信号采集计算系统现在技术已经很成熟，本发明不再赘述。采用上述生物传感器进行蔗糖和葡萄糖双组分溶液检测的方法，具体步骤如下：
16.(1)葡萄糖酶电极葡萄糖标准溶液定标：
17.开机清洗生物传感器，循环清洗3次，通过进液泵向检测池1加入3-5ml缓冲液；开启搅拌，待葡萄糖酶电极的底电流数值稳定，记录该底电流数值i
底葡
1；葡萄糖标准溶液测定：运行传感器检测程序，向检测池1中注入1-50μl葡萄糖标准溶液，记录电流数值i
标葡
1；循环清洗3次，通过进液泵项检测池1中加入3-5ml缓冲液；待传感器底电流数值稳定，向检测池中再次注入1-50μl葡萄糖标准溶液，记录电流数值i
标葡1-n
，其中向检测池1中注入的缓冲液、葡萄糖标准溶液的量和向检测池1中再次注入的缓冲液、葡萄糖标准溶液的量保持一致；按照下述公式计算检测误差：
18.η＝(i
标葡1-n-i
标葡1
)/i
标葡1
19.当η的绝对值小于2％时，生物传感器葡萄糖酶电极定标通过；
20.通过点(0，i
底葡1
)和点(c
标葡
，i
标葡1
)拟合一条线性曲线，该条线性曲线是葡萄糖浓度与电流的关系：
[0021][0022]
(2)蔗糖酶电极葡萄糖标准溶液定标：
[0023]
清洗生物传感器，循环清洗3次，通过进液泵向检测池2加入3-5ml缓冲液；开启搅
拌，待蔗糖酶芯片的低电流数值稳定，记录该底电流数值i
标葡2
；葡萄糖标准溶液测定：运行传感器检测程序，向检测池2中注入1-50μl葡萄糖标准溶液，记录电流数值i
标葡2
；循环清洗3次，通过进液泵项检测池2中加入3-5ml缓冲液；待传感器底电流数值稳定，向检测池2中再次注入1-50μl葡萄糖标准溶液，记录电流数值i
标葡1-n
，其中向检测池2中注入的缓冲液、葡萄糖标准溶液的量和向检测池2中再次注入的缓冲液、葡萄糖标准溶液的量保持一致；计算
[0024]
η＝(i
标葡2-n-i
标葡2
)/i
标葡2
的值，当η的绝对值小于2％时，生物传感器蔗糖酶电极定标通过；通过点(0，i
底葡2
)和点(c
标葡
，i
标葡2
)拟合一条线性曲线，该条线性曲线是葡萄糖浓度与电流的关系：
[0025]
(3)蔗糖酶电极蔗糖标准溶液定标：
[0026]
清洗生物传感器，循环清洗3次，通过进液泵向检测池2加入3-5ml缓冲液；开启搅拌，待蔗糖酶芯片的低电流数值稳定，记录该底电流数值i
底蔗
；蔗糖标准溶液测定：运行传感器检测程序，向检测池2中注入1-50μl蔗糖标准溶液，记录电流数值i
标蔗1
；循环清洗3次，通过进液泵项检测池2中加入3-5ml缓冲液；待传感器底电流数值稳定，向检测池中再次注入1-50μl蔗糖标准溶液，记录电流数值i
标蔗1-n
，其中向检测池2中注入的缓冲液、蔗糖糖标准溶液的量和向检测池2中再次注入的缓冲液、蔗糖标准溶液的量保持一致；计算η＝(i
标蔗1-n-i
标蔗1
)/i
标蔗1
[0027]
的值，当η的绝对值小于2％时，生物传感器蔗糖酶电极定标通过；
[0028]
通过点(0，i
底蔗
)和点(c
标蔗
，i
标蔗1
)拟合一条线性曲线，该条线性曲线是蔗糖浓度与电流的关系：
[0029][0030]
(4)双组分溶液中葡萄糖含量测定：
[0031]
重复步骤(1)中生物传感器的清洗、稳定步骤；运行传感器检测程序，向检测池1中注入1-50μl双组分溶液，记录电流数值i
样葡1
；通过步骤(1)中拟合曲线，计算得到双组分溶液中葡萄糖的浓度c
样葡
。
[0032]
(5)通过步骤(2)中拟合曲线和步骤(4)中计算得到的葡萄糖的浓度c
样葡
，计算得到双组分溶液在检测池2中的葡萄糖的理论电流值i
样葡2
。
[0033]
(6)双组分溶液中蔗糖含量的测定：
[0034]
重复步骤(2)中生物传感器的清洗、稳定步骤；
[0035]
运行传感器检测程序，向检测池2中注入1-50μl双组分溶液，记录电流数值i
样混
；双组分溶液的电流数值i
样混
减去步骤(5)中计算得到的双组分溶液中葡萄糖的理论电流数值i
样葡2
得到双组分溶液中蔗糖在检测池2中的实际电流数值i
样蔗
。通过步骤(3)中拟合曲线和蔗糖的实际电流数值i
样蔗
，计算得到双组分溶液中蔗糖的浓度c
样蔗
。
[0036]
作为优选，步骤(1)和步骤(2)中向检测池中注入的葡萄糖标准溶液的量和向检测池中再次注入的葡萄糖标准溶液的量保持一致。
[0037]
作为优选，步骤(1)中再次注入葡萄糖标准溶液所得到的电流数值i
标葡1-n
和步骤
(2)再次注入葡萄糖标准溶液所得到的电流数值i
标葡2-n
，其中n为再次注入葡萄糖标准溶液的次数，当注入次数n≤3且η的绝对值满足条件，则进行下一步骤，否则，重新开始步骤(1)和(2)。
[0038]
需要说明的是，步骤(3)中蔗糖标准溶液的浓度可为摩尔浓度或者质量浓度，摩尔浓度0.01-0.5m,质量浓度1-10g/l。向检测池中注入的蔗糖标准溶液的量为1-50μl，加入量的大小根据蔗糖标准溶液的浓度大小来调节。步骤(3)中再次注入蔗糖标准溶液所得到的电流数值i
标蔗1-n
，其中n为再次注入蔗糖标准溶液的次数，当注入次数n≤3且η的绝对值满足条件，则进行下一步骤，否则，重新开始步骤(3)。
[0039]
双组分溶液样品可为液体样、固体溶解样和气体溶解样。
[0040]
步骤(4)-(6)中向检测池1中注入的双组分溶液的量为1-50μl，具体量的大小可根据样品的浓度来进行调节。
[0041]
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
[0042]
本发明提供的用于蔗糖和葡萄糖双组分溶液检测的酶生物传感器具备制备方法简单、成本低的优点；该酶生物传感器在实现葡萄糖和蔗糖同时检测的前提下，能够消除葡萄糖对蔗糖检测结果的干扰，提高检测结果的准确性。适用于食品、医药分析及其发酵工程中葡萄糖以及蔗糖的检测，实用性强。
具体实施方式
[0043]
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0044]
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。
[0045]
实施例1
[0046]
(1)蔗糖酶电极的制备：取蔗糖水解酶50u、葡萄糖变旋酶50u和葡萄糖氧化酶180u溶于100μl缓冲溶液中，配制蔗糖水解酶、葡萄糖变旋酶和葡萄糖氧化酶的混合酶溶液，向酶溶液加入25％的戊二醛交联剂1μl，混匀；取5μl酶溶液滴加到工作电极区域，静置2h，待酶溶液完全固化，进行冷冻干燥；其中用于酶溶液配制的溶剂为含有氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾的缓冲溶液,缓冲溶液的ph为7。
[0047]
(2)葡萄糖酶电极的制备：取葡萄糖氧化酶180u溶于100μl缓冲溶液中，配制葡萄糖氧化酶的酶溶液，向酶溶液加入25％的戊二醛交联剂1μl，混匀；取1-5μl酶溶液滴加到工作电极区域，静置2h，待酶溶液完全固化，进行冷冻干燥；其中用于酶溶液配制的溶剂为含有氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾的缓冲溶液,缓冲溶液的ph为7。
[0048]
(3)选用印刷碳电极作为对电极，agcl浆料印刷电极作为参比电极，印刷碳浆电极作为工作电极。
[0049]
(4)配制浓度分别为10g/l的葡萄糖标准溶液和2g/l的蔗糖标准溶液进行定标。配制含10g/l葡萄糖及10g/l蔗糖的混合溶液用于同时浓度检测。
[0050]
(5)使用单枚蔗糖酶电极进行混合组分检测，对蔗糖的检测误差为23.36％。将所
制备的葡萄糖和蔗糖酶电极安装于生物传感器上，应用本发明提供的同时检测蔗糖和葡萄糖双组分溶液浓度的方法获得生物传感器对葡萄糖的检测误差为1.12％；对蔗糖的检测误差为2.32％。由此得出，使用提出的双组分检测方法能得到更好的准确率。
[0051]
实施例2
[0052]
(1)蔗糖酶电极的制备：取蔗糖水解酶50u、葡萄糖变旋酶50u和葡萄糖氧化酶180u溶于100μl缓冲溶液中，配制蔗糖水解酶、葡萄糖变旋酶和葡萄糖氧化酶的混合酶溶液，向酶溶液加入25％的戊二醛交联剂1μl，混匀；取5μl酶溶液滴加到工作电极区域，静置2h，待酶溶液完全固化，进行冷冻干燥；其中用于酶溶液配制的溶剂为含有氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾的缓冲溶液,缓冲溶液的ph为7。
[0053]
(2)葡萄糖酶电极的制备：取葡萄糖氧化酶180u溶于100μl缓冲溶液中，配制葡萄糖氧化酶的酶溶液，向酶溶液加入25％的戊二醛交联剂1μl，混匀；取1-5μl酶溶液滴加到工作电极区域，静置2h，待酶溶液完全固化，进行冷冻干燥；其中用于酶溶液配制的溶剂为含有氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾的缓冲溶液,缓冲溶液的ph为7。
[0054]
(3)选用印刷碳电极作为对电极，agcl浆料印刷电极作为参比电极，印刷碳浆电极作为工作电极。
[0055]
(4)配制浓度分别为20g/l的葡萄糖标准溶液和4g/l的蔗糖标准溶液进行定标。配制含20g/l葡萄糖及10g/l蔗糖的混合溶液用于同时浓度检测。
[0056]
(5)使用单枚蔗糖酶电极进行混合组分检测，对蔗糖的检测误差为40.21％。将所制备的葡萄糖和蔗糖酶电极安装于生物传感器上，应用一种用于同时检测蔗糖和葡萄糖双组分溶液浓度的方法获得生物传感器对葡萄糖的检测误差为1.58％；对蔗糖的检测误差为3.32％。由此得出，使用提出的双组分检测方法能得到更好的准确率。
[0057]
实施例3
[0058]
(1)蔗糖酶电极的制备：取蔗糖水解酶50u、葡萄糖变旋酶50u和葡萄糖氧化酶180u溶于100μl缓冲溶液中，配制蔗糖水解酶、葡萄糖变旋酶和葡萄糖氧化酶的混合酶溶液，向酶溶液加入25％的戊二醛交联剂1μl，混匀；取5μl酶溶液滴加到工作电极区域，静置2h，待酶溶液完全固化，进行冷冻干燥；其中用于酶溶液配制的溶剂为含有氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾的缓冲溶液,缓冲溶液的ph为7。
[0059]
(2)葡萄糖酶电极的制备：取葡萄糖氧化酶180u溶于100μl缓冲溶液中，配制葡萄糖氧化酶的酶溶液，向酶溶液加入25％的戊二醛交联剂1μl，混匀；取1-5μl酶溶液滴加到工作电极区域，静置2h，待酶溶液完全固化，进行冷冻干燥；其中用于酶溶液配制的溶剂为含有氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾的缓冲溶液,缓冲溶液的ph为7。
[0060]
(3)选用印刷碳电极作为对电极，agcl浆料印刷电极作为参比电极，印刷碳浆电极作为工作电极。
[0061]
(4)配制浓度分别为30g/l的葡萄糖标准溶液和6g/l的蔗糖标准溶液进行定标。配制含15g/l葡萄糖及30g/l蔗糖的混合溶液用于同时浓度检测。
[0062]
(5)使用单枚蔗糖酶电极进行混合组分检测，对蔗糖的检测误差为15.63％。将所制备的葡萄糖和蔗糖酶电极安装于生物传感器上，应用一种用于同时检测蔗糖和葡萄糖双组分溶液浓度的方法获得生物传感器对葡萄糖的检测误差为2.12％；对蔗糖的检测误差为3.64％。由此得出，使用提出的双组分检测方法能得到更好的准确率。
[0063]
实施例4
[0064]
(1)蔗糖酶电极的制备：取蔗糖水解酶50u、葡萄糖变旋酶50u和葡萄糖氧化酶180u溶于100μl缓冲溶液中，配制蔗糖水解酶、葡萄糖变旋酶和葡萄糖氧化酶的混合酶溶液，向酶溶液加入25％的戊二醛交联剂1μl，混匀；取5μl酶溶液滴加到工作电极区域，静置2h，待酶溶液完全固化，进行冷冻干燥；其中用于酶溶液配制的溶剂为含有氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾的缓冲溶液,缓冲溶液的ph为7。
[0065]
(2)葡萄糖酶电极的制备：取葡萄糖氧化酶180u溶于100μl缓冲溶液中，配制葡萄糖氧化酶的酶溶液，向酶溶液加入25％的戊二醛交联剂1μl，混匀；取1-5μl酶溶液滴加到工作电极区域，静置2h，待酶溶液完全固化，进行冷冻干燥；其中用于酶溶液配制的溶剂为含有氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾的缓冲溶液,缓冲溶液的ph为7。
[0066]
(3)选用印刷碳电极作为对电极，agcl浆料印刷电极作为参比电极，印刷碳浆电极作为工作电极。
[0067]
(4)配制浓度分别为40g/l的葡萄糖标准溶液和8g/l的蔗糖标准溶液进行定标。配制含30g/l葡萄糖及45g/l蔗糖的混合溶液用于同时浓度检测。
[0068]
(5)使用单枚蔗糖酶电极进行混合组分检测，对蔗糖的检测误差为19.32％。将所制备的葡萄糖和蔗糖酶电极安装于生物传感器上，应用一种用于同时检测蔗糖和葡萄糖双组分溶液浓度的方法获得生物传感器对葡萄糖的检测误差为3.12％；对蔗糖的检测误差为3.85％。由此得出，使用提出的双组分检测方法能得到更好的准确率。
[0069]
实施例5
[0070]
(1)蔗糖酶电极的制备：取蔗糖水解酶50u、葡萄糖变旋酶50u和葡萄糖氧化酶180u溶于100μl缓冲溶液中，配制蔗糖水解酶、葡萄糖变旋酶和葡萄糖氧化酶的混合酶溶液，向酶溶液加入25％的戊二醛交联剂1μl，混匀；取5μl酶溶液滴加到工作电极区域，静置2h，待酶溶液完全固化，进行冷冻干燥；其中用于酶溶液配制的溶剂为含有氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾的缓冲溶液,缓冲溶液的ph为7。
[0071]
(2)葡萄糖酶电极的制备：取葡萄糖氧化酶180u溶于100μl缓冲溶液中，配制葡萄糖氧化酶的酶溶液，向酶溶液加入25％的戊二醛交联剂1μl，混匀；取1-5μl酶溶液滴加到工作电极区域，静置2h，待酶溶液完全固化，进行冷冻干燥；其中用于酶溶液配制的溶剂为含有氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾的缓冲溶液,缓冲溶液的ph为7。
[0072]
(3)选用印刷碳电极作为对电极，agcl浆料印刷电极作为参比电极，印刷碳浆电极作为工作电极。
[0073]
(4)配制浓度分别为60g/l的葡萄糖标准溶液和10g/l的蔗糖标准溶液进行定标。配制含15g/l葡萄糖及45g/l蔗糖的混合溶液用于同时浓度检测。
[0074]
(5)使用单枚蔗糖酶电极进行混合组分检测，对蔗糖的检测误差为60.51％。将所制备的葡萄糖和蔗糖酶电极安装于生物传感器上，应用一种用于同时检测蔗糖和葡萄糖双组分溶液浓度的方法获得生物传感器对葡萄糖的检测误差为2.86％；对蔗糖的检测误差为3.42％。由此得出，使用提出的双组分检测方法能得到更好的准确率。
[0075]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质
对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。