一种纳豆激酶包埋物的制备方法与流程

1.本发明涉及蛋白质的包埋及缓释技术领域，具体是一种纳豆激酶包埋物的制备方法。


背景技术：

2.纳豆激酶是一种能有效溶解人工血栓的碱性丝氨酸蛋白酶，在合适的条件下具有强大的纤维蛋白溶解活性,和目前临床上用于治疗血栓的药物尿激酶等相比，这种酶溶栓效果更加明显，且没有毒副作用。近年来，纳豆激酶由于其强大的溶栓作用受到了广泛的关注。根据研究发现，纳豆激酶的溶栓作用主要是通过自身可直接将纤维蛋白溶解成小分子肽、氨基酸等，刺激血管内皮细胞产生组织型纤溶酶原激活剂(t-ap)，激活体内尿激酶原转变为尿激酶，使纤溶酶原激活剂的抑制剂(pai-1)降解和失活，从而调控纤溶作用这四个方面直接或间接来达到目的。纳豆激酶除了有溶解血栓这一功效，还具有抗高血压、降血脂、抗血小板、改善血液循环的作用，在维持甲状腺健康方面也起着重要作用，并被证明可以作为一种哮喘替代治疗方案。因此，将纳豆激酶作为一种新型溶栓药物或特殊膳食开发是很有前景的。但纳豆激酶在应用过程中会有一定限制。纳豆激酶的稳定性容易受到温度、ph、金属离子、小分子化合物以及有机物等的影响。纳豆激酶在ph为5.0～12.0之间时比较稳定，ph低于3时会迅速失活。而在正常情况下，人体胃酸ph值在0.9～1.8之间，胃液在饭后被稀释，ph值会上升到3.5左右，纳豆激酶若直接经过口服食用，会遭到胃部强酸的影响，导致其空间结构破坏，从而暴露出更多的胃蛋白酶结合位点，丧失溶栓活性。另外人体胃部消化一般需要两个小时，这就要求对纳豆激酶采取一定措施来保护其在胃部免受强酸的影响。


技术实现要素：

3.针对上述现有技术的不足，本发明提供一种纳豆激酶包埋物的制备方法，工艺简单，耗时短，损耗低，能较大程度提高原料的利用率，减少纳豆激酶在制备过程中的损耗，且得到的纳豆激酶微胶囊具有高包埋率和和保存率。
4.本发明提供的技术方案：一种纳豆激酶包埋物的制备方法，包括如下步骤：
5.(1)纳豆激酶液的制备：将纳豆芽孢杆菌置于液态lb培养基中进行液态发酵，发酵液冷冻离心后，上清液即纳豆激酶粗酶液，将纳豆激酶粗酶液通过超滤膜超滤后，得到纳豆激酶液；
6.(2)低膨化度谷物原料的制备：取谷物原料按物料含水量为10～20％，调整谷物中的水量，搅拌均匀后倒入双螺旋挤压膨化机中进行挤压膨化，膨化后的谷物干燥后粉碎备用；
7.(3)膨化谷物负载纳豆激酶：按照粉碎后的膨化谷物与纳豆激酶液质量比为0.1～2:1，将纳豆激酶液加到粉碎后的膨化谷物中，搅拌均匀，得到负载纳豆激酶的膨化谷物混合物；
8.(4)微胶囊制备：采用二次包被，第一层包被材料采用质量浓度为0.1％～5％的复
合海藻酸钠胶类溶液，按照第一层包被材料与步骤(3)得到的混合物的质量比为1:1～5将上述包被材料加入步骤(3)中的混合物中，搅拌均匀，干燥粉碎；随后与玉米醇溶蛋白乙醇溶液按质量比1～10:1进行第二层包被，干燥后得到纳豆激酶微胶囊。
9.进一步的，所述步骤(1)中纳豆激酶液的制备方法如下：将纳豆芽孢杆菌置于液态lb培养基中进行液态发酵，将发酵液于4～15℃条件下，6000～12000r/min冷冻离心10～30min，上清液即纳豆激酶粗酶液，然后将纳豆激酶粗酶液先通过1万的超滤膜，将截留液再通过3万的超滤膜，此时的透过液即为待包被的纳豆激酶液。
10.进一步的，所述步骤(1)中得到的纳豆激酶液的纳豆激酶分子量为27000～28000。
11.进一步的，所述步骤(2)中低膨化度谷物原料的制备方法如下：采用谷物原料，按物料含水量为10～20％加水调整谷物中的水量，搅拌均匀后倒入双螺旋挤压膨化机中进行挤压膨化，设置挤压机喂料速度14～18r/min，螺旋转速100～120r/min，加工温度150℃～180℃，将膨化谷物干燥后粉碎备用。
12.进一步的，所述谷物原料选择大米、玉米、小米等谷物原料中的一种或者两种按质量配比1～10：1～10或者三种按质量比1～10：1～10：1～10混合。
13.进一步的，所述步骤(4)中复合海藻酸钠胶类物质是采用海藻酸钠与果胶、黄原胶、蜂胶、结冷胶中任意一种或者两种或者三种进行配比制得的；海藻酸钠与果胶、黄原胶、蜂胶、结冷胶中的任意一种物质按质量配比1～10:1～10或者海藻酸钠与其中任意两种物质按质量配比1～10:1～10:1～10混合或者海藻酸钠与其中任意三种物质按质量比1～10:1～10:1～10:1～10，配制成0.1％～5％的复合海藻酸钠胶类溶液。
14.进一步的，所述步骤(4)中进行第二次包被时，将玉米醇溶蛋白乙醇溶液加入到第一次包被后的混合物中混合均匀，或者将玉米醇溶蛋白乙醇溶液喷涂到上第一次包被后的混合物中，喷涂均匀。
15.进一步的，所述玉米醇溶蛋白乙醇溶液是将玉米醇溶蛋白按照质量浓度0.1％～5％的比例溶于体积分数为60％～95％乙醇的溶剂中得到的。
16.本发明先采用膨化后的谷物负载纳豆激酶，然后再用海藻酸钠与果胶、黄原胶、结冷胶、蜂胶等几种材料复合作为第一层包被壁材，玉米醇溶蛋白作为第二层包被壁材进行双层包埋得到纳豆激酶微胶囊。膨化后的谷物疏松多孔，具有较高的负载量，能较大程度的吸附纳豆激酶液。海藻酸钠可以在负载纳豆激酶的膨化谷物外形成一层保护膜，对纳豆激酶有一定的保护作用。由于海藻酸钠具有多孔特性，且单用某种胶类物质进行包被对纳豆激酶的保护作用有限，并不能完全有效地限制胃液的渗透作用，因此采用其他材料对其进行二次包被。玉米醇溶蛋白具有很好的成膜性，不溶于水但易溶于60％～95％乙醇溶液中，且不溶于酸性溶液。因此采用玉米醇溶蛋白对纳豆激酶进行第二层包被，得到了一种具有高包埋率和保存率的纳豆激酶微胶囊。该微胶囊经过模拟胃部消化处理2h后，纳豆激酶仍能保持90％及以上的酶活性。
具体实施方式
17.下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
18.实施例1
19.将纳豆芽孢杆菌置于液态lb培养基中进行液态发酵，将发酵液于4℃条件下，
6000r/min冷冻离心20min，上清液即纳豆激酶粗酶液，然后将纳豆激酶粗酶液先通过1万的超滤膜，将截留液再通过3万的超滤膜，此时的透过液即为待包被的纳豆激酶液。
20.选取玉米作为膨化原料，按照以下公式加入一定量水，将含水量调整至16％后，投入双螺旋挤压膨化机中进行挤压膨化，设置挤压机喂料速度为14r/min，螺旋转速100r/min，加工温度150℃，将膨化谷物干燥后粉碎备用。
[0021][0022]m‑‑‑
加入的玉米、大米、小米总质量(g)；
[0023]
a0‑‑‑
最终物料含水量(％)；
[0024]
a1、a2、a3‑‑‑
玉米、大米、小米原始水分含量(％)；
[0025]
c1、c2、c3‑‑‑
玉米、大米、小米配比比例(％)
[0026]
按照粉碎后的膨化谷物与纳豆激酶液质量比为1:1，将纳豆激酶液加到粉碎后的膨化谷物中，搅拌均匀，得到负载纳豆激酶的膨化谷物混合物；将上述混合物与质量浓度为0.5％的复合海藻酸钠胶类溶液按质量比1:1混合，其中复合海藻酸钠胶类溶液按照海藻酸钠:黄原胶的质量配比为7:3的比例配制得到，搅拌均匀；随后与玉米醇溶蛋白乙醇溶液按质量比1:1混合，搅拌均匀，其中玉米醇溶蛋白乙醇溶液为玉米醇溶蛋白按质量浓度为2.5％溶于体积分数为60％的乙醇中，经过真空冷冻干燥后粉碎，得到纳豆激酶微胶囊。
[0027]
实施例2
[0028]
将纳豆芽孢杆菌置于液态lb培养基中进行液态发酵，将发酵液于15℃条件下，10000r/min冷冻离心15min，上清液即纳豆激酶粗酶液，然后将纳豆激酶粗酶液先通过1万的超滤膜，将截留液再通过3万的超滤膜，此时的透过液即为待包被的纳豆激酶液。
[0029]
选取玉米与小米作为膨化原料，按物料配比为8:1，按照公式加入一定量水，将含水量调整至16％后，投入双螺旋挤压膨化机中进行挤压膨化，设置挤压机喂料速度为16r/min，螺旋转速110r/min，加工温度160℃，将膨化谷物干燥后粉碎备用。
[0030]
按照粉碎后的膨化谷物与纳豆激酶液质量比为1.5:1，将纳豆激酶液加到粉碎后的膨化谷物中，搅拌均匀，得到负载纳豆激酶的膨化谷物混合物；将上述混合物与质量浓度为1％的复合海藻酸钠胶类溶液按质量比1:2混合，其中复合海藻酸钠胶类溶液中复合海藻酸钠胶类物质的质量配比为海藻酸钠:结冷胶:蜂胶为5:2:3，搅拌均匀；随后与玉米醇溶蛋白乙醇溶液按质量比1:3，将玉米醇溶蛋白乙醇溶液喷涂在不断搅拌中的纳豆激酶-膨化谷物-复合海藻酸钠胶类物质上，其中玉米醇溶蛋白乙醇溶液为玉米醇溶蛋白按质量浓度为2％溶于体积分数为60％的乙醇中，经过预脱湿冷风干燥，筛分，得到纳豆激酶微胶囊。
[0031]
实施例3
[0032]
将纳豆芽孢杆菌置于液态lb培养基中进行液态发酵，将发酵液于4℃条件下，8000r/min冷冻离心20min，上清液即纳豆激酶粗酶液，然后将纳豆激酶粗酶液先通过1万的超滤膜，将截留液再通过3万的超滤膜，此时的透过液即为待包被的纳豆激酶液。
[0033]
选取玉米、小米、大米作为膨化原料，按物料配比为6:2:2，按照以上公式加入一定量水，将含水量调整至16％后，投入双螺旋挤压膨化机中进行挤压膨化，设置挤压机喂料速度为18r/min，螺旋转速120r/min，加工温度180℃，将膨化谷物干燥后粉碎备用。
[0034]
按照粉碎后的膨化谷物与纳豆激酶液质量比为1.5:1，将纳豆激酶液加到粉碎后
的膨化谷物中，搅拌均匀，得到负载纳豆激酶的膨化谷物混合物；将上述混合物与质量浓度为2％的复合海藻酸钠胶类溶液按质量比1:1.5混合，其中复合海藻酸钠胶类溶液中复合海藻酸钠胶类物质的质量配比为海藻酸钠:果胶:黄原胶为6:2:2，搅拌均匀；随后与玉米醇溶蛋白乙醇溶液按质量比1:2.5，将玉米醇溶蛋白乙醇溶液喷涂在不断搅拌中的纳豆激酶-膨化谷物-复合海藻酸钠胶类物质上，其中玉米醇溶蛋白乙醇溶液为玉米醇溶蛋白按质量浓度为3％溶于体积分数为65％的乙醇中，经过流化床干燥，筛分，得到纳豆激酶微胶囊。
[0035]
将实施例中制得的纳豆激酶微胶囊作为样品，模拟胃部消化检测纳豆激酶包埋处理对纳豆激酶活性的保护作用：配置模拟胃部电解质(含胃蛋白酶)，将ph调至2，取样品0.5g，加入2ml配置好的胃液，在37℃、120r/min的摇床中避光2h后，采用纤维蛋白平板法测定微胶囊中保存的纳豆激酶酶活。
[0036]
结果：该微胶囊在经过胃部模拟消化1h后，其中的纳豆激酶还能保持90％及以上的酶活性。与其他纳豆激酶微胶囊相比，具有明显的优势。
[0037]
以上所述仅为本发明的具体实施方案的详细描述，并不以此限制本发明，凡在本发明的设计思路上所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。