一种可注射抗菌高分子水凝胶及其制备方法和用途与流程

1.本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种可注射抗菌高分子水凝胶及其制备方法和用途。


背景技术：

2.可注射抗菌水凝胶系统因其操作简单、微创/无创、毒副作用小、有效抗菌药物浓度维持时间长等优点，已成为局部注射抗菌治疗的研究热点。
3.近年来，藻酸盐(alg)、透明质酸(ha)等天然高分子有机化合物因其生物相容性好、可降解、成本低廉等优势，及通过金属-配体相互作用，与特定金属离子反应可快速形成超分子水凝胶的特性，成为合成水凝胶的热门候选者。然而，这类基于高分子化合物的超分子水凝胶通常缺乏剪切稀化性能，临床可注射性不易实现。
4.此外，这类水凝胶自身常不具备抗菌性能，需要通过封装抗菌药物实现抗菌性，存在制备步骤复杂耗时、药物包裹效率低、包裹后药物失活、药物泄漏以及对局部细胞组织产生毒副作用等问题。
5.因此，基于天然高分子化合物构建兼具有剪切稀化特性和抗菌性能的超分子水凝胶具有潜在的研究价值及临床应用前景。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种可注射抗菌高分子水凝胶及其制备方法和用途。
7.本发明提供了一种可注射抗菌高分子水凝胶，它是由海藻酸盐、透明质酸盐、含铁离子的化合物和乙二胺四乙酸二钠为原料制备而成。
8.进一步地，前述的水凝胶是将海藻酸盐和透明质酸盐混合溶液与含铁离子的化合物和乙二胺四乙酸二钠混合溶液混合后而得。
9.进一步地，所述海藻酸盐和透明质酸盐混合溶液与含铁离子的化合物和乙二胺四乙酸二钠混合溶液的体积比为(1～50)：1。
10.进一步地，所述海藻酸盐和透明质酸盐混合溶液与含铁离子的化合物和乙二胺四乙酸二钠混合溶液的体积比为(1～10)：1；
11.优选地，所述海藻酸盐和透明质酸盐混合溶液与含铁离子的化合物和乙二胺四乙酸二钠混合溶液的体积比为5：1。
12.进一步地，所述海藻酸盐和透明质酸盐混合溶液中海藻酸盐的浓度为1～5％(w/v)，透明质酸盐的浓度为0.1～1％(w/v)；
13.优选地，所述海藻酸盐和透明质酸盐混合溶液中海藻酸盐的浓度为3％(w/v)，透明质酸盐的浓度为0.75％(w/v)。
14.进一步地，所述含铁离子的化合物和乙二胺四乙酸二钠混合溶液中铁离子的浓度为0.1mol/l～1mol/l，乙二胺四乙酸二钠的浓度为0.01mol/l～0.1mol/l；
15.优选地，所述含铁离子的化合物和乙二胺四乙酸二钠混合溶液中铁离子的浓度为
0.1mol/l，乙二胺四乙酸二钠的浓度为0.05mol/l。
16.进一步地，所述海藻酸盐为海藻酸钠；和/或，所述透明质酸盐为透明质酸钠；和/或，所述含铁离子的化合物为含fe
3
的化合物；
17.优选地，所述含fe
3
的化合物为硫酸铁。
18.本发明还提供了一种制备前述的水凝胶的制备方法，它包括如下步骤：
19.(1)将海藻酸盐和透明质酸盐溶于水中，得到混合溶液a；
20.(2)将含铁离子的化合物和乙二胺四乙酸二钠溶于水中，得到混合溶液b；
21.(3)将混合溶液b加入混合溶液a中，即得；
22.优选地，所述将混合溶液b加入混合溶液a中时搅拌。
23.本发明还提供了前述的水凝胶在制备可注射抗菌药物载体中的用途。
24.本发明还提供了前述的水凝胶在制备组织修复材料中的用途。
25.本发明中，w/v表示g/ml。
26.本发明alg-ha水凝胶均一、稳定，具有优良的自修复性能、剪切稀化性能和可注射性，并且还具有优良的抗菌性能。其可作为可注射载体使用，可适应于不同大小和形状的组织缺损的局部注射治疗。并且，该水凝胶原料简单，成型快，制备简单方便且绿色环保，具有良好的应用前景。
27.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
28.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
29.图1为本发明alg-ha水凝胶形成的结果：a为小瓶倒置实验确定各组凝胶形成的结果；b为通过流变学测试时间扫描，确认实施例1制备的水凝胶形成的结果。
30.图2为实施例1制备的水凝胶的流变学特性：a为alg-ha水凝胶的振幅扫描结果；b为alg-ha水凝胶的频率扫描结果。
31.图3为通过流变学循环应变时间扫描表征各组水凝胶的自修复性能结果：a为实施例1制备的alg-ha水凝胶；b为对比例2制备的ha水凝胶；c为对比例1制得alg水凝胶。
32.图4为本发明alg-ha水凝胶的剪切稀化和可注射性结果：a为实施例1制备的水凝胶的剪切速率测试结果；b为实施例1制备的水凝胶的注射倒置实验结果；c为实施例1制备的水凝胶的注射实验结果，其中a的注射器规格为10ml，b的注射器规格为5ml，c的注射器规格为1ml；d为实施例1制备的水凝胶的书写能力。
33.图5为本发明alg-ha水凝胶的抗菌结果：a为s.aureus和e.coli的菌落培养宏观图；b为s.aureus和e.coli的菌落培养的计数结果；图中，control代表空白对照组，gel代表alg-ha水凝胶组。
具体实施方式
34.除另有说明外，本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买
市售产品获得。
35.实施例1、本发明可注射抗菌高分子水凝胶的制备
36.分别精确称量海藻酸钠(alg)和透明质酸钠(ha)，在室温下使其溶解于超纯水中，制备海藻酸钠-透明质酸钠混合溶液(alg-ha溶液)，混合溶液中，alg的浓度为3％(w/v)，ha的浓度为0.75％(w/v)。
37.分别精确称量硫酸铁与乙二胺四乙酸二钠(edta)，在室温下使其溶解于超纯水中，制备fe
3 -edta络合物溶液，络合物溶液中，fe
3
的浓度为0.1mol/l，edta的浓度为0.05mol/l，即fe
3
与edta的摩尔比为2：1。
38.取2ml alg-ha溶液，置于小瓶中，在机械搅拌下，滴加总体积为400μl的fe
3 -edta络合物溶液。在充分反应后(室温下反应0.5～1min)，即得本发明可注射抗菌高分子水凝胶(alg-ha水凝胶)。
39.对比例1、海藻酸钠水凝胶的制备
40.精确称量海藻酸钠(alg)，在室温下使其溶解于超纯水中，制备海藻酸钠溶液(alg溶液)，溶液中，alg的浓度为3％(w/v)。
41.分别精确称量硫酸铁与乙二胺四乙酸二钠(edta)，在室温下使其溶解于超纯水中，制备fe
3 -edta络合物溶液，络合物溶液中，fe
3
的浓度为0.1mol/l，edta的浓度为0.05mol/l，即fe
3
与edta的摩尔比为2：1。
42.取2ml alg溶液，置于小瓶中，在机械搅拌下，滴加总体积为400μl的fe
3 -edta络合物溶液。在充分反应后(室温下反应0.5～1min)，即得海藻酸钠水凝胶(alg水凝胶)。
43.对比例2、透明质酸钠水凝胶的制备
44.精确称量透明质酸钠(ha)，在室温下使其溶解于超纯水中，制备透明质酸钠溶液(ha溶液)，溶液中，ha的浓度为0.75％(w/v)。
45.分别精确称量硫酸铁与乙二胺四乙酸二钠(edta)，在室温下使其溶解于超纯水中，制备fe
3 -edta络合物溶液，络合物溶液中，fe
3
的浓度为0.1mol/l，edta的浓度为0.05mol/l，即fe
3
与edta的摩尔比为2：1。
46.取2ml ha溶液，置于小瓶中，在机械搅拌下，滴加总体积为400μl的fe
3 -edta络合物溶液。在充分反应后(室温下反应0.5～1min)，即得透明质酸钠水凝胶(ha水凝胶)。
47.以下通过具体的试验例证明本发明的有益效果。
48.试验例1、本发明水凝胶的基本流变学表征
49.1、试验方法
50.按照实施例1、对比例1和对比例2所述方法在小瓶中制备水凝胶，通过倒置小瓶确认水凝胶的形成情况，观察并拍照记录。
51.流变测试通过anton paar模块化智能型旋转流变仪(mcr302)进行。在预设为25℃的测试板上进行水凝胶的加样，加样后在周围加一层的硅油，防止测试过程中水分蒸发。在25℃下，通过频率扫描、时间扫描、振幅扫描来分析各水凝胶的流变学性质。
52.2、试验结果
53.由图1a可知：将alg-ha溶液与fe
3 -edta络合物溶液混合后，在小瓶中可观察到棕黄色的alg-ha水凝胶(图1a中为alg-ha-fe-edta)形成，倒置小瓶后，水凝胶仍保持稳定的状态，不会流动或崩塌，表明了alg-ha水凝胶制备成功；而在相同浓度和比例下，分别将ha
溶液或alg溶液与fe
3 -edta络合物溶液混合后，可观察到ha溶液与f
e3 -edta络合物溶液形成具有流动性的黄色澄清液体(图1a中为ha-fe-edta)，alg溶液与fe
3 -edta络合物溶液形成不均匀的黄色类固体/液体混合物(图1a中为alg-fe-edta)。说明：在相同浓度和比例下，只有将alg和ha形成的混合溶液与f
e3 -edta络合物溶液混合反应，才能成功制备得到水凝胶。
54.在alg-ha溶液与fe
3 -edta络合物溶液反应后，立刻通过流变学表征进一步确认了水凝胶的形成。时间扫描(图1b)显示，自反应发生后，储能模量g’大于损耗模量g”，证明了alg-ha与fe
3 -edta之间发生反应，形成了具有类固体物理性能的水凝胶；在测试的30分钟内，g’与g”的数值几乎没有变化，表明alg-ha与fe
3 -edta之间的反应是即刻完成的，且形成的水凝胶具有一定的均质性和稳定性。
55.振幅扫描的实验结果如图2a显示，当应变(γ)小于10％时，g’》g”，样品具有类固体的物理性质，为凝胶状态，当应变大于10％时，g’《g”，样品具有类液体的物理性质，即从凝胶态转变为溶胶态。该结果表明，alg-ha水凝胶在0.01％-10％的应变内均保持凝胶状态，且在0.01％-1％的应变内，g’与g”几乎无变化，说明在此范围内水凝胶保持稳定的机械性能。
56.在应变为1％的前提下，对水凝胶施加1-100rad/s范围的频率扫描，结果(图2b)显示g’和g”随频率(ω)增加轻微变大，g’始终大于g”，表明在此范围内，alg-ha水凝胶均可维持凝胶状态。
57.上述试验结果说明将alg和ha混合溶液与fe
3 -edta络合物溶液混合后可快速形成性能均一、稳定的alg-ha水凝胶。
58.试验例2、本发明水凝胶的剪切稀化可注射性研究
59.1、试验方法
60.(1)循环应变时间扫描
61.自修复性能通过anton paar模块化智能型旋转流变仪(mcr302)进行，加样方法同试验例1。在ω＝1rad/s的设定下进行循环应变时间扫描，应变设定为0.1％以使样品处于稳定的凝胶状，随后，迅速将应变从0.1％增加到100％，待一定时间后，样品已被破坏为溶胶状，将应变从100％降至0.1％，用于观察alg-ha水凝胶(实施例1制备的水凝胶)和对照样品(对比例1和对比例2制备的水凝胶)的自修复。所有测试至少重复三次。
62.(2)剪切速率扫描
63.剪切稀化性能通过anton paar模块化智能型旋转流变仪(mcr302)进行，加样方法同试验例1。设置剪切速率从0-100s-1
的剪切速率扫描，对样品(实施例1制备的水凝胶)粘度进行检测，测试至少重复三次。
64.(3)体外注射实验
65.10ml注射器中装载实施例1制备的alg-ha水凝胶，并在室温(25℃)下手动注射至玻璃小瓶，注射后立即倒置小瓶观察并记录现象。使用甲基蓝对实施例1制备的alg-ha水凝胶进行染色，使用10ml、5ml和1ml规格的注射器装载甲基蓝染色的alg-ha水凝胶，在室温(25℃)下手动注射至装有dh2o的玻璃小瓶中，观察并记录现象。10ml注射器中装载甲基蓝染色的实施例1制备的alg-ha水凝胶，在室温(25℃)下手动注射在玻璃板表面，目视观察水凝胶的可书写能力。
66.2、试验结果
67.水凝胶的自修复结果如图3所示，alg-ha水凝胶(图3a)在0.1％的应变下表现为凝胶状，当应变在快速从0.1％增加至100％时，g’和g”迅速下降且g’《g”，表明凝胶网络被破坏，从凝胶转变为溶胶。当应变再次降低到0.1％时，水凝胶在短时间(约0.8min)内完成溶胶到凝胶的转变，恢复凝胶状态，且g’和g”完全恢复到与初始值相等；在4个循环应变周期之后，g’和g”仍与初始值相等。该结果表明alg-ha水凝胶具有快速的自修复能力，且机械强度几乎无损耗，可达到100％自修复。
68.与之相对的，宏观状态为液体的ha水凝胶(ha-fe-edta，图3b)始终表现为g”》g’，即流体性质；而alg水凝胶(alg-fe-edta，图3c)虽然g’》g”，但在循环应变时间扫描中，受到高应力的破坏后，g’和g”明显下降，g”》g’，而在高应力去除后，虽然g’和g”有一定的升高且表现出g’》g”，但与初始模量值相差大，且g’与g”数值非常接近，可认为不具备自修复性能。
69.剪切速率扫描实验(图4a)显示，随着剪切速率的增加，alg-ha水凝胶的粘度降低，说明该水凝胶具有剪切稀化性。体外注射实验进一步明确了alg-ha水凝胶的可注射性能。如图4b所示，使用注射器将alg-ha水凝胶在室温下注入玻璃小瓶中，注射后立即倒置小瓶，水凝胶保持为不掉落的固体性质，即alg-ha水凝胶的溶胶-凝胶转变在数秒内快速发生。图4c显示alg-ha水凝胶可通过不同尺寸的注射器注射入水，且在此过程中保持连续不断裂、不散开，说明其可适应于不同大小和形状的组织缺损的局部注射治疗。最后，测试了alg-ha水凝胶的可书写能力，在室温下，alg-ha水凝胶注射于玻璃表面，在无任何外力干扰的条件下具有自修复能力，且可以形成任意的三维形状(图4d)。这些发现表明本发明alg-ha水凝胶具有优良的自修复、剪切稀化和可注射性，进一步证实该水凝胶具有作为可注射载体应用的可能。
70.试验例3、本发明水凝胶的抗菌性能研究
71.1、试验方法
72.在15ml离心管中加入1.5ml实施例1制备的alg-ha水凝胶，超净台内紫外线灭菌40min后加入3ml菌液(105cfu/ml)，以等体积的灭菌dh2o作为空白对照组(n＝3)。在37℃下共培养24h后，取菌液进行梯度稀释后接种在琼脂固体肉汤培养基上。通过细菌菌落计数来确定水凝胶体外抗菌活性。细菌选择大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。
73.2、统计学分析
74.各组数据均采用平均数及标准差表示。使用spss 16.0软件，运用t检验对相关实验数据进行分析，当p《0.05时，差别具有统计学意义。使用*，p《0.05；**，p《0.01；***，p《0.01，表示显著性差异。
75.3、试验结果
76.细菌菌落计数统计结果(图5)显示：与对照组相比，本发明alg-ha水凝胶组的细菌菌落数明显减少，说明本发明alg-ha水凝胶对e.coli和s.aureus均具有明显的抗菌作用。
77.综上，本发明alg-ha水凝胶均一、稳定，具有优良的自修复性能、剪切稀化性能和可注射性，并且还具有优良的抗菌性能。其可作为可注射载体使用，可适应于不同大小和形状的组织缺损的局部注射治疗。并且，该水凝胶原料简单，成型快，制备简单方便且绿色环保，具有良好的应用前景。