用于确定色谱系统的驻留体积的方法与流程

用于确定色谱系统的驻留体积的方法
1.相关申请
2.本技术要求2019年8月21日提交的名称为“method for determining a dwell volume of a chromatographic system”的美国临时专利申请序列号62/889,820的在先申请日的权益，该申请的全部内容以引用的方式并入本文。
技术领域
3.本技术整体涉及色谱系统。更具体地，本技术涉及一种基于对组成梯度的系统压力响应来确定液相色谱系统的驻留体积的方法。


背景技术：

4.色谱系统的驻留体积通常被定义为在混合溶剂的位置(即，形成溶剂梯度的位置)与色谱柱的入口(头)之间延伸的流动路径的体积。在到达柱入口的梯度开始之前，入口处的溶剂流是等度的。梯度延迟是在混合位置处溶剂梯度的开始时间与溶剂梯度首先到达柱入口的时间之间的时间差。梯度延迟可根据对驻留体积和溶剂流速的了解来确定。
5.驻留体积影响梯度分离的通量并影响梯度方法从一个色谱系统到另一个色谱系统的转移。系统之间的驻留体积的差异可导致柱处的溶剂梯度中的差异。因此，当在不同色谱系统之间转移方法时，尤其是当驻留体积存在系统间差异且因为差异未知而不能被补偿时，可能出现问题。例如，转移的方法可能导致色谱图中的峰的选择性和间距存在变化。对于较长的梯度延迟，即较大的驻留体积，在梯度到达色谱柱之前，可发生较长时间的等度分离。因此，与具有小驻留体积的系统相比，等度分离可以是显著的并且可能导致显著不同的色谱图。
6.用于确定液相色谱系统的驻留体积的一种常规技术基于使用相同溶剂的两个源测量驻留体积。由一个源供应的溶剂包含通过色谱检测器易于感测的另外化合物。例如，对于采用紫外(uv)光检测器的系统，可在溶剂源中的一个溶剂源处将uv示踪剂化合物添加到溶剂中。通过混合由两个源供应的溶剂来产生溶剂梯度。因此，需要用户花费时间来制备溶剂并安装溶剂源。另外，可能需要在驻留体积测量之后清洁液相色谱系统的流动路径的过程，以防止系统被外来化合物污染及系统性能劣化。如果某些系统部件被修改，则可能遇到另外的问题。例如，管材和/或混合器的变化可导致驻留体积的变化，因此较早确定的驻留体积可能不再准确并且可能需要重新测量驻留体积。


技术实现要素：

7.本公开的示例包括一种用于确定液相色谱系统的驻留体积的方法和一种可确定其自身的驻留体积的液相色谱系统。
8.在一个示例中，一种用于确定液相色谱系统的驻留体积的方法包括在混合位置处混合第一溶剂的流和第二溶剂的流，以在液相色谱系统的系统流中产生溶剂混合物。在梯度持续时间期间，第一溶剂的流减小并且第二溶剂的流增大以生成溶剂混合物的梯度组
成。测量液相色谱系统的系统压力以确定压力迹线，该压力迹线被定义为作为时间的函数的所测量的系统压力。液相色谱系统的驻留体积由在混合位置处的梯度组成与压力迹线之间确定的时间延迟确定。
9.溶剂混合物可具有响应于梯度组成而变化的粘度。粘度的变化可与根据梯度组成的溶剂混合物的变化基本上成线性比例。
10.第一溶剂的粘度可不同于第二溶剂的粘度。
11.梯度组成可以是线性梯度组成或阶跃梯度。梯度组成可以是被确定为响应于梯度组成而提供压力迹线的至少一部分的基本上线性压力变化的非线性梯度组成。
12.液相色谱系统可包括色谱柱，并且驻留体积的确定可包括确定时间延迟与溶剂混合物的流速的乘积，然后从乘积中减去色谱柱的一半体积。
13.液相色谱系统可包括被配置成为系统流提供系统压降的流量限制器，并且确定驻留体积可包括确定时间延迟与溶剂混合物的流速的乘积。
14.在另一个示例中，一种用于确定液相色谱系统的驻留体积的计算机程序产品包括计算机可读存储介质，该计算机可读存储介质具有与其一起体现的计算机可读程序代码。该计算机可读程序代码包括：
15.被配置成在混合位置处混合第一溶剂和第二溶剂以在液相色谱系统的系统流中产生溶剂混合物的计算机可读程序代码；
16.被配置成在梯度持续时间内减小第一溶剂的流并增大第二溶剂的流以产生溶剂混合物的梯度组成的计算机可读程序代码；
17.被配置成测量系统压力并根据系统压力确定压力迹线的计算机可读程序代码，压力迹线被定义为作为时间的函数的所测量的系统压力；以及
18.被配置成根据混合位置处的梯度组成与压力迹线之间的时间延迟来确定液相色谱系统的驻留体积的计算机可读程序代码。
19.液相色谱系统可包括色谱柱和被配置成确定驻留体积的计算机可读程序代码、被配置成确定时间延迟与溶剂混合物的流速的乘积的计算机可读程序代码，以及被配置成从乘积中减去色谱柱的体积的一半的计算机可读程序代码。
20.在另一个示例中，液相色谱系统包括第一溶剂的源、第二溶剂的源、泵、流量限制器、压力传感器和处理器。混合器具有用于接收第一溶剂和第二溶剂的混合器入口以及提供溶剂混合物的混合器出口。泵具有与混合器出口流体连通的泵入口并且具有泵出口。泵在泵入口处接收溶剂混合物并且在从泵出口分配的系统流中提供处于系统压力下的溶剂混合物。流量限制器具有与泵出口流体连通的限制器入口并且具有限制器出口。压力传感器设置在系统流中且位于泵出口之后并且生成指示所测量的系统压力的压力信号。处理器与第一溶剂和第二溶剂的源以及压力传感器连通。处理器被配置成通过控制第一溶剂对混合器的贡献和第二溶剂对混合器的贡献来生成系统流中的梯度组成并且根据压力信号来确定压力迹线。压力迹线被定义为作为时间的函数的所测量的系统压力。处理器还被配置成确定混合位置处的梯度组成与压力迹线之间的时间延迟并且根据时间延迟来确定液相色谱系统的驻留体积。
21.液相色谱系统还可包括设置在混合器与第一溶剂和第二溶剂的源之间的梯度比例阀。
22.处理器可将驻留体积确定为时间延迟与溶剂混合物的流速的乘积。
23.流量限制器可为色谱柱，并且驻留体积的确定包括确定时间延迟与溶剂混合物的流速的乘积，然后从乘积中减去色谱柱的体积的一半。
24.在另一个示例中，液相色谱系统包括第一溶剂的源、第二溶剂的源、第一泵、第二泵、混合器、流量限制器、压力传感器和处理器。第一泵具有与第一溶剂的源流体连通的第一泵入口并且具有第一泵出口。第二泵具有与第二溶剂的源流体连通的第二泵入口并且具有第二泵出口。混合器具有分别与第一泵出口和第二泵出口流体连通的第一混合器入口和第二混合器入口以及用以提供溶剂混合物的混合器出口。流量限制器具有与泵出口流体连通的限制器入口并且具有限制器出口。压力传感器设置在系统流中且位于混合器出口之后并且生成指示所测量的系统压力的压力信号。处理器与第一泵和第二泵以及压力传感器连通。处理器被配置成通过控制第一溶剂对混合器的贡献和第二溶剂对混合器的贡献来生成系统流中的梯度组成并且根据压力信号来确定压力迹线。压力迹线被定义为作为时间的函数的所测量的系统压力。处理器还被配置成确定混合位置处的梯度组成与压力迹线之间的时间延迟并且根据时间延迟来确定液相色谱系统的驻留体积。
25.处理器可将驻留体积确定为时间延迟与溶剂混合物的流速的乘积。
26.流量限制器可为色谱柱，并且确定驻留体积可包括确定时间延迟与溶剂混合物的流速的乘积，然后从乘积中减去色谱柱的体积的一半。
附图说明
27.通过结合附图参考下面的描述，可以更好地理解本发明的上述优点和其他优点，附图中相同的附图标号是指各个附图中相同的元件和特征。字母可附加到附图标号以与类似特征的附图标号区分开，并且指示与附图中的其他特征的对应关系。为清楚起见，并非每个元件都在每个附图中标记。附图不一定按比例绘制，而重点在于示出本发明的原理。
28.图1是可用于运行梯度分离的液相色谱系统的示例的框图。
29.图2是描绘溶剂混合物如何行进穿过图1的液相色谱系统从梯度比例阀穿过检测器的示意性框图。
30.图3是使用紫外示踪剂溶剂以确定液相色谱系统的驻留时间和驻留体积的技术的图形描绘。
31.图4是粘度的相依性随水和乙腈混合物中的水含量而变化的图形表示。
32.图5是粘度的相依性随水和甲醇混合物中的水含量而变化的图形表示。
33.图6是用于执行用于确定液相色谱系统的驻留体积的方法的液相色谱系统的编程梯度和所得压力迹线的图形描绘。
34.图7a示出了具有两个色谱柱的柱管理器，其中可选择将一个色谱柱包括在系统流动路径中。
35.图7b示出了被相对于常规液相色谱系统具有可忽略体积的限制器占据的图7a的柱管理器。
36.图8是用于确定液相色谱系统的驻留体积的方法的示例性具体实施的编程梯度组成和所得压力迹线的图形表示。
37.图9是用于确定液相色谱系统的驻留体积的方法的另一个示例性具体实施的编程
梯度组成和所得压力迹线的图形表示。
38.图10是用于确定液相色谱系统的驻留体积的方法的另一个示例性具体实施的编程梯度组成和所得压力迹线的图形表示。
39.图11是用于确定液相色谱系统的驻留体积的方法的示例的流程图表示。
具体实施方式
40.在本说明书中提到“示例”或“具体实施”表示结合示例或具体实施描述的特定特征、结构或特性包括在本教导的至少一个示例或具体实施中。对本说明书内的特定示例或具体实施的引用不一定都指代相同的示例或具体实施。
41.现在将参考如附图所示的示例和具体实施更详细地描述本教导。虽然结合各种示例描述了本教导，但并非旨在将本教导限于此类示例。相比之下，本教导涵盖各种替代、修改和等同物，如本领域的技术人员将理解。能够使用本文教导的普通技术人员将认识到在本公开的范围内的附加实施方式、修改和示例，以及其他使用领域。
42.简而言之，下文公开了一种用于确定液相色谱系统的驻留体积的方法的示例。该方法包括混合溶剂以产生梯度流动相。随时间推移测量液相色谱系统的系统压力以确定“压力迹线”。将压力迹线与溶剂混合位置处的梯度组成(其为时间的函数)进行比较，以确定时间延迟。该时间延迟随后允许基于溶剂混合物的流速来计算驻留体积。有利地，不需要uv示踪剂或其他另外的化合物。因此，减少了驻留体积测量的准备时间并且避免了被另外的化合物污染的风险。另外，液相色谱系统不需要物理重新配置。例如，可在不需要移除色谱柱并用另外的管材重新整理流动路径的情况下执行该方法。此外，用于执行测量的操作员动作的减少降低了可能导致错误的驻留体积确定的人为错误的可能性。另外，执行该方法所需的时间和所得的准确度可减少在不同色谱系统与配置之间转移方法时可能出现的问题。
43.图1是液相色谱系统10的框图，该系统包括与用户界面装置16连通的系统处理器14(例如，微处理器和控制器)，用户界面装置用于接收输入参数并向操作者显示系统信息。系统处理器14与梯度比例阀(gpv)18连通，梯度比例阀用于分别控制溶剂源(例如，贮存器)22a和22b中容纳的两种溶剂a和b对溶剂流的贡献。系统处理器14还与泵驱动模块20连通，泵驱动模块控制系统泵24和用于将样品进样到溶剂流中的进样阀32。混合器26在混合器入口处接收来自gpv 18的溶剂流。所接收的溶剂流包括每种溶剂的交替贡献。混合器26将溶剂流的组成匀化并且在混合器出口处提供溶剂混合物。溶剂混合物流到系统泵24的泵入口，其中溶剂混合物被加压至系统压力。泵24可包括可以多种方式构造的泵头。例如，泵24可包括与累积器泵头串联连通的主泵头。
44.在分离运行期间，来自样品贮存器或样品容器30的样品被进样器阀32进样到流动到色谱柱28的流动相中。柱28联接到向系统处理器14提供检测器信号的检测器34。检测器信号响应于从柱28洗脱的样品中的组分。
45.在具有梯度流动相的液相色谱系统10的操作期间，溶剂a和b汲取自溶剂源22。混合流动相中存在的溶剂的相对贡献取决于gpv 18提供的每种溶剂的离散贡献。这些贡献根据流动相的期望(预定)梯度组成在梯度形成期间随时间推移而变化。
46.在用于确定系统10的驻留体积的一种常规技术中，溶剂源22a和22b分别保持溶剂
a和溶剂b。在一些具体实施中，溶剂a和b相同。将少量吸收紫外(uv)光的有机化合物(即，uv示踪剂)添加到溶剂源22b中的溶剂中。随后，系统10执行梯度分离运行，其中梯度包含来自溶剂源22a的100％溶剂a，并且在梯度转变时间内转变成包含来自包括uv示踪剂的溶剂源22b的100％溶剂b的溶剂。随后，在溶剂流动返回到100％溶剂a之前，流经系统的梯度保持为100％溶剂b。如下文更详细地描述，移除色谱柱以实施此技术。移除色谱柱的原因是柱增大了体积并且由于可能保留uv活性分析物而导致情况变得复杂。
47.图2是描绘溶剂混合物如何行进穿过液相色谱系统从gpv 18穿过检测器34的示意性框图。系统压力在泵24的出口处最高。液相色谱系统中的压降中的大部分压降发生在色谱柱28上。对于在gpv 18处第一次定义的梯度组成，存在要在柱28的入口处实现的延迟时间δt。此延迟时间δt被定义为梯度第一次到达柱28的入口的时间与梯度在gpv 18处第一次开始(即，等度流动停止)的时间之间的时间差。
48.也参见图3，示出了使用uv示踪剂溶剂来确定驻留时间和驻留体积的上述技术的图形描绘。该图包括曲线40，该曲线描绘了在gpv 18处的系统流中作为时间的函数的溶剂a的百分比。该图包括曲线42，该曲线描绘了在柱28的头部处作为时间的函数的溶剂a的百分比。
49.液相色谱系统在等度模式下运行，其中溶剂a对系统流具有100％贡献。随后，当在gpv 18处第一次形成梯度时(此时溶剂a的贡献第一次开始降低)，存在时间t1。由于液体横穿限定在混合位置(即，梯度形成位置)与柱入口之间的驻留体积具有传播时间，因此当梯度第一次到达柱28的头部的时刻t2从gpv 18处开始梯度的时刻延迟时间δt＝t
2-t1。梯度结束时间t
g1
对应于gpv 18处的溶剂完全由溶剂b构成的时刻。类似地，梯度的结束第一次到达柱28的头部的时间t
g2
从在gpv 18处发生梯度的结束的时刻延迟相同的时间δt。
50.一般来讲，柱28的头部处的梯度组成大致是在gpv 18处定义的相同梯度组成，但延迟时间δt(流动路径中没有柱)。因此，曲线42类似于曲线40，除了由于时间延迟δt而具有水平偏移之外。
51.用于确定驻留体积的上述常规技术对系统操作员有一定要求。操作员必须制备溶剂a、制备具有所需uv示踪剂的溶剂b并且运行分离。对于曲线40和42中的每一者上的为最大值与最小值之间的中间(即，50％水平)的量值，确定时间偏移(即，两个曲线40和42的分离)。所确定的时间偏移δt乘以系统流的流速以确定驻留体积。一旦完成测量，通常冲洗系统以确保在预引发系统以进行正常操作之前没有uv示踪剂保留在系统中。此技术通常需要若干小时或更长时间，具体取决于执行测量的操作员的专业知识。此外，该技术可能受到操作员错误的影响。例如，过量的uv示踪剂可能导致uv检测器的非线性响应，从而导致不准确。
52.为了执行上述测量，操作员移除色谱柱28并用具有小内径的管材替换系统流动路径的该部分。执行这种改变，因为色谱柱28的体积表示整个系统流动路径的大部分，并且因此梯度延迟的uv检测器的测量结果将不表示在柱28的头部处发生的延迟。相比之下，替换管材的体积仅向系统流动路径添加小总体积(例如，几微升或更少)。因此，这种另外的管材体积足够小，使得其对所测量的梯度延迟时间的贡献一般来讲是可忽略的。然而，在使用常规uv示踪剂技术时，移除色谱柱并用另外的管材重新整理流动路径的需要代表另外的时间负担。
53.尽管在准确了解柱体积的情况下用户可将色谱柱28留在系统中的适当位置，但需要仔细注意以确保uv示踪剂不保留在柱28上，从而导致不正确的测量结果。第二个问题是任何保留的uv示踪剂可能导致稍后分离运行的污染。
54.下面描述的是使用系统压力响应(即，作为时间函数的系统压力，在本文中也称为“压力迹线”)来确定液相色谱系统的驻留时间的示例。该系统压力迹线可通过设置在由色谱柱(或如果不存在色谱柱则为限制器)引起的主系统压降上游的流动路径中的压力传感器来测量。例如，系统压力迹线可通过由压力传感器产生的压力信号确定，该压力信号指示系统压力随时间的变化。在一些具体实施中，压力传感器是位于泵出口处的压力换能器。管材(或柱，如果存在的话)上的压降与动态粘度成正比(poiseuille定律)。在某些条件下，压力迹线具有与线性二元相梯度的斜率成比例的斜率。为了实现这种状况，溶剂混合物的粘度变化相对于溶剂组成中的变化是基本上线性的。换句话说，溶剂混合物的粘度变化与有限的溶剂组成范围内对总溶剂流有贡献的溶剂的变化基本上成线性比例。例如，对于溶剂中的线性降低，一种溶剂(例如，溶剂a)的贡献可导致系统压力的线性降低；然而，在梯度持续时间内，在从100％到0％的溶剂a的整个转变期间，通常不存在这种线性。
55.溶剂混合物的粘度通常随溶剂混合物中特定溶剂的百分比而变化。例如，图4以图形方式描绘了粘度的相依性随存在于水和乙腈混合物中的水而变化，并且图5以图形方式描绘了粘度的相依性随存在于水和甲醇混合物中的水而变化。每条曲线指示不同温度下的粘度，其中较高温度曲线对应于较低粘度。在图4中，对于介于约10％至约40％之间的水组合物，粘度以大致线性方式变化，并且在图5中，对于介于约0％至约20％之间和约70％至约100％之间的水组合物，粘度以大致线性方式变化。
56.通过了解溶剂混合物中的粘度线性范围，操作员可对梯度组成进行编程(限定)以实现在线性粘度范围内保持的时间中的梯度变化。例如，操作员可对在几分钟内跨越线性范围中的一个线性范围的乙腈和水混合物进行编程。
57.如上所述，用于确定梯度延迟的常规uv示踪剂技术通常涉及移除色谱柱并替换为具有小内径的管材。执行这种改变，因为色谱柱的体积表示整个系统流动路径的大部分，并且因此梯度延迟的uv检测器的测量结果将不表示柱的头部处的延迟。相比之下，替换管材的体积仅向系统流动路径添加小总体积(例如，几微升或更少)。因此，这种另外的管材体积足够小，使得其对所测量的梯度延迟时间的贡献一般来讲是可忽略的。然而，在使用常规uv示踪剂技术时，移除色谱柱并用另外的管材重新整理流动路径的需要代表另外的时间负担。
58.在本文所述的用于确定驻留体积的方法的各种示例中，在液相色谱系统上的压降中的大部分压降发生在色谱柱上。色谱柱的存在是有利的，因为柱上的压降确保所得压力迹线不包括显著的压力噪声分量并且不需要安装替换管材。该方法的另一个优点是，可使用标准流动相溶剂，诸如水、乙腈和/或甲醇，而不需要利用特殊溶剂(例如，具有uv示踪剂的溶剂)并且不产生任何污染风险。
59.图6是液相色谱系统的编程梯度50和所得压力迹线52的简化图形描绘。还示出了基于柱体积编程梯度的偏移到对应于色谱柱出口的稍后时间的曲线54。曲线55类似于曲线54，除了曲线55表示在系统中没有柱的相同位置处的编程梯度之外。因此，从曲线54和55可以看出，可从测量压力迹线52与编程梯度50之间的差δt中减去曲线54和55之间的时间差
的一半(对应于柱体积的一半)，以确定梯度延迟t
延迟
。
60.更具体地，相对于举例说明的示例，编程梯度50示出了从第一溶剂(溶剂a)的最大值到第一溶剂的最小值的四分钟内的转变，其中选择最大值和最小值以在压力迹线52中实现线性响应，如上所述。压力迹线52从最大压力值减小，直至其达到最小压力值。由于来自在其中混合溶剂的混合器的效应，压力迹线52中的线性的一些变形在其转变的开始附近和结束附近是明显的。由于驻留体积和柱体积，压力迹线52从编程梯度50开始在时间上偏移时间δt。为了适当地确定色谱柱的头部处的梯度延迟，编程梯度50与压力迹线52之间的时间偏移δt减少对应于柱体积的一半乘以流速的时间。例如，如果柱具有与其全体积和流速相关联的延迟时间t0，则梯度延迟为δt-t0/2。可从产品规格信息中获知柱体积。另选地，对于一些柱，可利用柱的其他参数(诸如柱尺寸和粒度)来计算柱体积。因此，可容易地利用测量值δt和已知柱体积t0确定柱的头部处的梯度延迟。
61.图7a示出了具有两个色谱柱62a和62b的柱管理器60。可由阀64a和64b来选择用于分离的特定柱。可使用用于任一柱62的流动路径来确定驻留体积。在图7b所示的另选配置中，柱管理器60可包括限制器66，诸如管线的具有与驻留体积相比可忽略体积并且充当色谱系统上的主压降的长度。此另选配置的一个优点是不必知道柱体积。梯度延迟时间被直接确定为δt，无需减去柱延迟时间t0的一半。在一个非限制性数值示例中，管材具有100μm或更小的内径，并且管材长度上的压降为约13.8mpa(2,000psi)。
62.针对三种不同配置评估了用于确定液相色谱系统的驻留体积的方法。梯度基于含乙腈的水性混合物，其中混合物中乙腈的百分比限制为60％至90％(即40％至10％的水)，使得粘度变化限于基本上线性区域(参见图4)。该方法的方案包括实现约6.9mpa(1,000psi)的系统压力的变化，并且根据可变流速将最大系统压力限制为27.6mpa(4,000psi)或更小。选择根据该方案的参数以减小由于压力和温度变化引起的粘度的非线性变化的影响并解决溶剂压缩性问题。
63.针对每种配置选择编程梯度为60％乙腈，并且乙腈的变化在10％与30％之间的范围内。将初始保持体积选择为柱体积的约两倍，将梯度持续时间选择为柱延迟时间的至少两倍，并且将最终保持体积选择为柱体积的约两倍。在约30℃的温度下执行评估。
64.图8以图形方式描绘了用于确定液相色谱系统的驻留体积的方法的示例性具体实施。在此示例中，色谱系统是可购自马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(waters corporation,milford,massachusetts)的uplc h级系统。色谱柱是具有2.5μm的粒径和0.172ml的柱体积的2.1mm
×
75mm柱。梯度是流速为0.5ml/min的水性溶剂混合物，其在四分钟内从60％乙腈转变为75％乙腈。曲线70描绘了编程梯度，并且曲线72是最大值为31.83mpa(4,617psi)并且最小值为25.45mpa(3,691psi)的测量压力迹线。
65.测量压力迹线72显示在对应于0.49ml的驻留体积的0.98分钟的最小压力与最大压力之间的50％(中程)压力值下的δt。在减去为柱体积的一半的0.086ml之后，确定驻留体积为0.404ml。这类似于通过上述uv示踪剂方法确定的0.384ml体积。
66.在7.0分钟处的梯度到期之后，将溶剂组成保持恒定，直至编程梯度组成在阶跃变化中返回到60％乙腈时的10.0分钟。可以看出，可通过压力迹线72中的上升确定第二δt。在此示例中，第二δt为0.90分钟。因此，该方法实际上执行两次，其中在第一种情况下，水流减小而乙腈流增大，并且在第二种情况下，乙腈流减小而水流增大。换句话说，第二溶剂
的流减小，而第一溶剂的流增大。针对增大压力斜坡的δt的第二值应类似于通过减小压力斜坡获得的第一值，并且因此用作对第一值的检查。另选地，可将两个值取平均值用于确定驻留体积，尽管通常优选的是使用针对线性梯度而不是组成的阶跃变化确定的δt，因为线性梯度技术一般来讲更准确。
67.图9描绘了方法的另一个示例性具体实施。在此示例中，色谱系统是alliance hplc系统，并且色谱柱是具有2.5μm的粒度和0.7ml的柱体积的3.0mm
×
150mm柱。梯度是流速为0.3ml/min的水性溶剂混合物，其在四分钟内从60％乙腈转变为85％乙腈。曲线74描绘了编程梯度，并且曲线76是最大值为20.48mpa(2,970psi)并且最小值为11.49mpa(1,667psi)的测量压力迹线。
68.测量压力迹线76在对应于1.446ml的驻留体积的中程压力值下表现出4.82分钟的δt。(测量压力迹线76还基于返回初始溶剂组成的阶跃变化提供4.87分钟的第二δt。)在减去为柱体积的一半的0.35ml之后，确定驻留体积为1.096ml。这类似于通过上述uv示踪剂方法确定的1.14ml体积。
69.图10描绘了方法的另一个示例性具体实施。在此示例中，色谱系统是可购自马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(waters corporation,milford,massachusetts)的arc系统。色谱柱是具有5μm的粒径和2.32ml的柱体积的4.6mm
×
250mm柱。梯度是流速为1.0ml/min的水性溶剂混合物，其在十分钟内从60％乙腈转变为90％乙腈。曲线78描绘了编程梯度，并且曲线80是最大值为15.81mpa(2,293psi)并且最小值为9.45mpa(1,370psi)的测量压力迹线。
70.测量压力迹线80在对应于1.99ml的驻留体积的中程压力值下表现出1.16分钟的第一δt。根据从22.0分钟开始的反向线性梯度所得的压力迹线80中的上升所确定的第二δt也是1.16分钟。在减去为柱体积的一半的1.16ml之后，确定驻留体积为0.83ml。这类似于通过上述uv示踪剂方法确定的0.81ml体积。
71.在上述示例中，线性梯度用于产生压力迹线。在该方法的另选具体实施中，线性梯度被替换为溶剂混合物组成的阶跃变化。换句话说，溶剂混合物组成突然从一个值变为不同值。两种组成优选地对应于作为组成的函数的粘度的线性区域(图4和图5)。所得压力迹线包括更快速的最大值与最小值之间的转变；然而，与测量时间延迟和柱体积调整相关的原理保持相同。
72.在该方法的另一个另选具体实施中，可将编程梯度有意选择为非线性梯度。可对非线性梯度进行定义以补偿粘度变化的非线性，使得压力迹线可具有改进的线性。因此，梯度组成改变的线性中的这种有意“变形”使得能够在更宽泛的粘度值范围内操作，从而提供线性压力响应并且能够容易地确定编程梯度与测量压力迹线之间的偏移以用于驻留体积估计。
73.尽管描述的以上示例是针对其中溶剂在较低(例如，大气压)压力下混合的液相色谱系统，但在该方法的其他具体实施中，可使用具有用于每种溶剂的单独泵(高压梯度产生)的液相色谱系统。在此类具体实施中，从每个泵的出口递送的溶剂被提供给混合器的相应入口，混合器随后向进样器阀和色谱柱提供高压溶剂混合物。泵的流速得到及时控制，以维持具有变化的溶剂组成的恒定溶剂混合物流速。在混合器出口处或下游的位置处测量系统压力，并且如上文针对低压混合示例所述执行梯度延迟和驻留体积的计算。
74.图11是用于确定液相色谱系统的驻留体积的方法100的一般性示例的流程图表示。方法100包括在混合位置(例如，gpv)处混合(110)第一溶剂的流和第二溶剂的流以在系统流中产生溶剂混合物。在梯度持续时间期间，第一溶剂的流减小并且第二溶剂的流增大(120)以生成溶剂混合物的梯度组成。尽管在一些具体实施中，梯度组成是线性梯度，但在另选的具体实施中，梯度是非线性梯度或阶跃梯度。测量(130)液相色谱系统的系统压力以确定压力迹线，压力迹线被定义为作为时间的函数的所测量的系统压力。在一些具体实施中，在系统泵的输出处测量系统压力。在另选的具体实施中，可在色谱柱或系统流量限制器(如果不存在色谱柱)的上游的不同位置处测量系统压力。在确定压力迹线之后，利用混合位置处的梯度组成与压力迹线之间的时间延迟来确定(140)液相色谱系统的驻留体积。
75.方法100可以自动化方式执行，并且如果色谱柱处于系统流中，则该方法考虑柱体积。在一些具体实施中，使用柱的预定信息(例如，柱尺寸、粒度等)来计算柱体积。例如，查找表可存储多个柱的预定信息。然后通过检索与所用的柱相关联的查找表中的存储信息并且使用检索到的信息来计算柱体积，由此确定特定柱的柱体积。另选地，查找表可存储不同柱类型的柱体积的先前确定值，并且可通过从查找表中检索来直接确定使用中的柱的柱体积。
76.该方法及其变型可以是软件具体实施的形式(包括固件、驻留软件、微代码等)或被实施为软件方面和硬件方面的组合。此外，该方法可以计算机程序产品的形式实施，计算机程序产品体现在具有在其上体现的计算机可读程序代码的一个或多个计算机可读介质中。
77.可利用一个或多个计算机可读存储介质的任何组合。计算机可读介质可以是计算机可读信号介质或计算机可读存储介质。计算机可读存储介质可以是(例如)但不限于电子、磁性、光学、电磁、红外或半导体系统、设备或装置，或者前述项的任何合适的组合。计算机可读存储介质的更特定示例(非详尽性列表)将包括以下各项：具有一个或多个导线的电连接、便携式计算机磁盘、硬盘、随机存取存储器(ram)、只读存储器(rom)、可擦除可编程只读存储器(eprom或闪速存储器)、光纤、便携式压缩盘只读存储器(cd-rom)、光学存储装置、磁性存储装置或前述项的任何合适的组合。计算机可读存储介质可以是任何有形介质，所述有形介质可包含或存储供指令执行系统、设备或装置使用或结合指令执行系统、设备或装置使用的程序。
78.计算机可读信号介质可包括具有在其上体现的计算机可读程序代码的传播数据信号，例如在基带中或作为载波的一部分。此类传播信号可采用各种形式中的任一种，包括但不限于电磁、光学或其任何合适的组合。计算机可读信号介质可以是不是计算机可读存储介质并且可连通、传播或传送供指令执行系统、设备或装置使用或结合指令执行系统、设备或装置使用的程序的任何计算机可读介质。体现在计算机可读介质上的程序代码可使用任何适当的介质进行传输，任何适当的介质包括但不限于无线、有线线路、光纤电缆、rf等，或前述项的任何合适的组合。
79.用于执行本发明的各方面的操作的计算机程序代码可用一种或多种编程语言的任何组合来编写，所述编程语言包括面向对象的编程语言和常规过程编程语言。程序代码可完全地在用户计算机上、部分地在用户计算机上、作为独立软件包、部分地在用户计算机上并且部分地在远程计算机上或完全地在远程计算机或服务器上执行。在后一种情况下，
远程计算机可通过任何类型的网络(包括局域网(lan)或广域网(wan))连接到用户计算机，或者可连接到外部计算机(例如通过使用互联网服务提供商的互联网)。
80.这些计算机程序指令可提供给通用计算机、专用计算机或其他可编程数据处理设备的处理器以生产机器，使得经由计算机或其他可编程数据处理设备的处理器执行的指令形成用于实施各种所述方法的功能/动作的手段。例如，计算机程序指令可提供给图1的系统处理器14。这些计算机程序指令还可存储在计算机可读介质中，计算机可读介质可指示计算机、其他可编程数据处理设备或其他装置以特定方式运行，使得存储在计算机可读介质中的指令生产包括实施该方法的功能/动作的指令的制品。计算机程序指令还可加载到计算机、其他可编程数据处理设备或其他装置上，以使一系列的操作步骤在计算机、其他可编程设备或其他装置上执行来产生计算机实施的过程，使得在计算机或其他可编程设备上执行的指令提供用于实施功能/动作的过程。
81.在上文描述的确定液相色谱系统的驻留体积的方法的示例中，实现了各种优点。不利用另外的化合物，诸如uv示踪剂，从而减少操作员的制备时间并消除被供稍后分离用的化合物交叉污染的风险。另外，液相色谱系统不需要物理重新配置。例如，可在不需要移除色谱柱并用另外的管材重新整理流动路径的情况下执行该方法。有利地，该方法允许有效确定色谱系统的驻留体积，从而减少操作员交互并因此降低人为错误的可能性。另外，该方法所需的时间和所得的准确度可减少在不同色谱系统与配置之间转移方法时遇到的困难。
82.虽然已经参考特定实施方案示出和描述了本发明，但是本领域的技术人员应理解，在不脱离如所附权利要求中叙述的本发明的范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。