基于活化B细胞表达的结肠癌预后诊断用标记物及其用途的制作方法

基于活化b细胞表达的结肠癌预后诊断用标记物及其用途
技术领域
1.本发明涉及分子生物学、临床预后判断领域，具体涉及基于活化b细胞表达的结肠癌预后诊断用标记物及其用途。


背景技术：

2.结肠癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，由于生活方式和饮食结构的改变，近年来结肠癌在我国的发病率逐渐增高，严重影响国民的生命健康，其中肝转移为结肠癌最常见的转移部位之一，预后较差，目前对结肠癌及结肠癌肝转移的预后评估仍较为缺乏。
3.既往研究表明肿瘤组织的免疫细胞浸润可能与肿瘤的预后密切相关，，但是对肿瘤组织浸润的免疫细胞研究多聚焦于t细胞、巨噬细胞等，很少有关注b细胞的研究，活化b细胞是b细胞的亚群之一，可能在抗肿瘤免疫中发挥重要的功能，但是目前尚未有研究活化b细胞的表达与肠癌及肠癌肝转移预后的相关性报道。另外，研究显示肿瘤免疫微环境在肿瘤转移和预后中可能发挥着重要的作用，如调节性t细胞、细胞毒性t细胞等，但是目前研究较多的这些免疫细胞种类的作用有局限性。结肠肿瘤免疫微环境的构成较为复杂，不同的微环境组成可能导致患者生存差异较大，寻找结肠癌肿瘤免疫微环境中可能发挥重要作用的免疫细胞，并据此分析、评估结肠癌以及结肠癌肝转移患者预后的方法亟需解决。
4.活化b细胞是b细胞由bcr(b cell receptor)与特异性抗原结合后分化而来，表达cd69等表面标志发挥抗原提呈、辅助t细胞等作用，前期研究发现活化b细胞能有效抑制结肠癌的肝转移，改善结肠癌的免疫微环境，推测活化b细胞的表达可能与结肠癌的预后相关，免疫组织化学染色是现今较为成熟的评估肿瘤组织多种分子表达的实验方法，通过其检测cd19及cd69的表达可以反映活化b细胞的表达水平，目前国内外尚未有关于活化b细胞与肠癌预后相关性的报道。


技术实现要素：

5.针对现有技术中结肠癌预后的不足，本发明的第一目的是提供一种cd19和cd69蛋白表达水平的检测试剂在制备用于结肠癌预后预测的诊断产品中的用途，通过检测cd19和cd69蛋白的表达水平反映结肠癌患者活化b细胞的表达水平，用于对结肠癌和结肠癌肝转移患者预后预测进行诊断。
6.本发明的第二目的是提供一种结肠癌预后预测的诊断产品。
7.本发明的第三目的是提供一种结肠癌预后预测的诊断模型。
8.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
9.本发明提供一种cd19和cd69蛋白表达水平的检测试剂在制备用于结肠癌预后预测的诊断产品中的用途，所述结肠癌包括结肠癌无转移和结肠癌肝转移。
10.作为优选的技术方案，所述cd19和cd69蛋白表达水平的检测试剂包括分别与cd19和cd69蛋白特异性结合的抗体，或还包括检测缓冲液。
11.进一步地，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
12.作为优选的技术方案，所述cd19和cd69蛋白表达水平的检测试剂通过免疫组化方法对组织样本中cd19和cd69蛋白分别进行检测来确定表达水平；其中：cd19和cd69蛋白表达水平均高反映所述组织样本中活化b细胞的表达水平高，代表结肠癌患者预后好；cd19和cd69蛋白表达水平均低反映所述组织样本中活化b细胞的表达水平低，代表结肠癌患者预后差。
13.进一步地，通过免疫组化方法对组织样本中cd19和cd69蛋白进行检测的方法，包括下列步骤：
14.(1)取离体的结肠癌组织样品，进行石蜡包埋并制成组织切片；
15.(2)对所述组织切片中结肠癌细胞进行he染色，并根据细胞染色的百分比和强度对cd19和cd69蛋白进行免疫组化表达评分即h评分，通过所述h评分与cd19和cd69蛋白表达的最佳阈值进行比较，判断cd19和cd69蛋白在结肠癌组织中的表达水平。
16.进一步地，所述h评分的范围为0到300，h评分＝∑(pi
×
i)＝(弱染色细胞百分比
×
1) (中等强度染色细胞百分比
×
2) (强染色细胞百分比
×
3)，式中：
17.pi表示阳性细胞数量占所述组织切片中所有细胞数量的百分数；
18.i代表着色强度；
19.采用x-tile软件分别计算cd19和cd69蛋白表达的最佳阈值，当h值均高于cd19和cd69蛋白表达的最佳阈值时，判断活化b细胞在结肠癌组织中的表达水平高；当h值均低于cd19和cd69蛋白表达的最佳阈值时，判断活化b细胞在结肠癌组织中的表达水平低。
20.进一步地，所述cd19蛋白表达的最佳阈值为58.2，所述cd69蛋白表达的最佳阈值为53.6。
21.本发明还提供一种结肠癌预后预测的诊断产品，包括cd19和cd69蛋白表达水平的检测试剂和产品说明书，所述产品说明书记载内容包括：通过所述cd19和cd69蛋白表达水平的检测试剂分别检测cd19和cd69蛋白表达水平的步骤以及结肠癌患者预后的判断标准，所述判断标准为：cd19和cd69蛋白表达水平均高反映所述组织样本中活化b细胞的表达水平高，代表结肠癌患者预后好；cd19和cd69蛋白表达水平均低反映所述组织样本中活化b细胞的表达水平低，代表结肠癌患者预后差；其中所述结肠癌包括结肠癌无转移和结肠癌肝转移。
22.作为优选的技术方案，所述cd19和cd69蛋白表达水平的检测试剂包括分别与cd19和cd69蛋白特异性结合的抗体，或还包括检测缓冲液，通过免疫组化方法对组织样本中cd19和cd69蛋白分别进行检测来确定cd19和cd69蛋白的表达水平。
23.进一步地，所述诊断产品包括试剂盒、芯片和试纸。
24.本发明还提供一种结肠癌预后预测的诊断模型，包括所述结肠癌预后预测的诊断产品。
25.本发明涉及的术语“预后”表示提供对结肠癌可能的进程和结果的预测，既包括判断疾病的特定后果(如康复，某种症状、体征和并发症等其它异常的出现或消失及死亡)，也包括提供时间线索，如预测某段时间内发生某种结局的可能性，预后可包括癌症并发症、转移、扩散的可能性、癌症的可能的结果、恢复的可能性、总存活率和/或总死亡率。优选地，预后是患者恢复或具有癌症的复发/再发的概率，例如“预后较好”是指癌症不易发生复发转移，“预后较差”是指癌症更易发生复发转移，这个信息不仅对于患者有用，对于医生确定最
有效的疗程也有用，确定癌症复发的可能性或转移的可能性能帮助医生确定是否应采取更保守或更激进的治疗方法。预后可供用于对预测为从给定治疗方案获益的患者进行选择和分类，也可用于设计结肠癌治疗的合适疗法，例如通过显示结肠癌是否仍处于良性阶段或者结肠癌是否已发展到需要介入性治疗的阶段来实现。
26.本发明涉及的术语“高表达”或“低表达”是指来自检测对象的离体组织样品中cd19和cd69蛋白的表达水平高于或低于某一参考值，该参考值是本领域技术人员通过常规技术手段从特定群体，例如结肠癌预后较好的群体中获得的具有统计学意义的平均值或中位值。
27.本发明的cd19和cd69蛋白高低表达是依据cd19和cd69蛋白染色评分进行，随后由专业人员进行评定，分组为高、低表达。
28.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
29.本发明首次通过检测cd19和cd69蛋白表达水平反映结肠癌患者活化b细胞的表达水平，并将其用于对结肠癌患者预后预测进行诊断，据此得到一种结肠癌预后预测的诊断产品或诊断模型，评判结肠癌患者预后情况结果精准客观且方便快速，为临床治疗结肠癌提供新的参考依据。
附图说明
30.图1是实施例中免疫组化检测cd19和cd69蛋白表达的he染色照片。
31.图2是实施例中结肠癌患者生存分析情况；其中：(a)cd19和cd69蛋白均是低表达；(b)cd19和cd69蛋白均是高表达。
32.图3是实施例中结肠癌患者生存分析情况；其中：(1)结肠癌无转移患者；(2)结肠癌肝转移患者；(3)结肠癌仅有肝转移患者；(a)cd19和cd69蛋白均是低表达；(b)cd19和cd69蛋白均是高表达。
具体实施方式
33.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
34.以下实施例中通过免疫组化方法对组织样本中cd19和cd69蛋白分别进行检测的方法，包括下列步骤：
①
获取新鲜结肠癌组织标本，制作组织芯片；
②
组织芯片包埋、脱蜡、水化；
③
灭活内源性酶，抗原修复液浸泡后封闭；
④
分别用cd19的一抗或cd69的一抗孵育过夜；
⑤
二抗孵育；
⑥
dba显色；
⑦
苏木精染色；
⑧
树胶封片、拍照；
⑨
cd19和cd69的免疫组化表达评分(h评分)；
⑩
使用spss 22.0和graphpad prism 7.0进行统计分析，使用kaplan-meier法绘制生存曲线，生存分析的组间比较采用log-rank检验获得p值和hr值，p值＜0.05被认为具有显著的统计学差异。
35.实施例1
36.1、病例选择
37.本实施例共纳入复旦大学附属中山医院普外科2008年6月至2012年11月401名结
肠癌患者，其中无转移患者281例，结肠癌肝转移患者120例(其中仅有肝转移患者98例)，记录患者的临床信息并随访，所有患者的随访截止至2018年6月。本实验已通过复旦大学附属中山医院伦理委员会的批准，所有患者均提供书面知情同意书。
38.2、制备组织芯片
39.(1)取新鲜结肠癌组织标本，于10％甲醛中浸泡24至48小时使之固定，取出后于通风橱内用手术刀仔细修剪，将其置于包埋盒内并编号。
40.(2)将包埋盒置于脱水机中用不同浓度乙醇和醇苯、二甲苯脱水，并浸蜡。
41.(3)将组织置于包埋机中，加入融化的蜡包埋并标记，-20℃中冷却凝固，完全凝固后将蜡块取出并进行修整、切片。
42.(4)将修剪后的蜡块置于切片机中切片，设置切片厚度为4微米，切片后将切片转移至摊片机中，用载玻片轻轻捞起摊平的切片，标记后存于切片盒内。
43.(5)对石蜡切片行he染色，通过显微镜观察明确所需组织并标记，设计阵列，使用组织芯片阵列制作仪打孔，将供体蜡块中标记的组织转移至受体蜡块孔中，完成后取受体蜡块置于温箱中使组织与受体蜡块融合，融合后置于4℃冰箱保存，用上述方法切取组织芯片于载玻片上行后续实验。
44.3、免疫组织化学染色
45.(1)取切片置于烘箱60℃烘烤30分钟。
46.(2)取出烘烤后的切片，3次二甲苯和3次乙醇浸泡脱蜡水化。
47.(3)3％过氧化氢室温处理5-10分钟灭火内源性酶，ddh2o洗涤3次.
48.(4)使用抗原修复液浸泡，微波炉中高火加热5分钟，断电5-10分钟后，中高火加热5分钟，取出置于室温冷却。
49.(5)pbs洗2次后滴加bsa封闭液，室温中孵育20分钟。
50.(6)cd19或cd69的一抗均按照1：100进行稀释获得一抗工作液，加入一抗工作液，湿盒中4℃孵育过夜。
51.(7)过夜后将湿盒于室温中平衡15分钟，pbs洗2次，将羊抗兔igg浓缩液1：100稀释为工作液，使其完全覆盖载玻片上的组织，37℃孵育30分钟。
52.(8)pbs洗2次，晾干后滴加sabc-pod工作液(1：100稀释)于组织上，37℃反应30分钟，pbs洗涤数次。
53.(9)晾干后加入dba工作液，显微镜下观察是否显色，显色后ddh2o洗涤终止反应。
54.(10)ddh2o洗3次，浸入苏木素染液中染色1分钟，流水冲洗30分钟。
55.(11)将晾干后的载玻片浸入乙醇和二甲苯中脱水透明，通风橱内自然晾干。晾干后用树胶封片，烘箱37℃过夜。
56.(12)显微镜下观察并拍照。
57.表1：实验试剂
[0058][0059][0060]
表2：实验仪器和耗材
[0061]
仪器/耗材名称生产厂商产地制冰机hoshizaki公司日本微量移液器eppendof公司德国正置显微镜奥林巴斯株式会社日本4℃冰箱伊莱克斯公司韩国超净工作台上海净护医疗器械有限公司中国石蜡包埋机金华市科迪仪器设备有限公司中国病理切片机上海隆拓仪器设备有限公司中国冷冻操作台上海逐海仪器设备有限公司中国脱水机上海精密仪器仪表有限公司中国纯水机millipore公司美国烘箱吴江正达有限公司中国湿盒金睛中国15/50ml离心管corning公司美国移液器吸头eppendof公司德国载玻片invitrogen公司美国
[0062]
4、统计方法
[0063]
(1)免疫组化的表达：基于阳性细胞染色的百分比和强度对cd19和cd69进行组织学评分(h评分)，评分范围为0到300，h评分＝∑(pi
×
i)＝(弱染色细胞百分比
×
1) (中等强度染色细胞百分比
×
2) (强染色细胞百分比
×
3)，式中pi表示阳性细胞数量占切片中所有细胞数量的百分数；i代表着色强度。使用x-tile软件计算最佳的阈值(cd19取阈值为
58.2，cd69的阈值为53.6)进行后续分析(图1)。若cd19及cd69均高于各自阈值则定义为cd19和cd69高表达组，即高表达活化b细胞组；若cd19及cd69均低于各自阈值则定义为cd19和cd69低表达组，即低表达活化b细胞组。根据上述定义，剔除仅有cd19以及仅有cd69高表达的人群，最终纳入后续生存分析的结肠癌患者总人数为300人，其中无转移患者为206人，有肝转移的患者为94人(其中仅有肝转移的为78人)。
[0064]
(2)使用spss22.0和graphpad prism 7.0进行统计分析。使用kaplan-meier法绘制生存曲线，生存分析的组间比较采用log-rank检验获得p值和hr值，p值＜0.05被认为具有显著的统计学差异，统计图中“*”表示p《0.05，“**”表示p《0.01，“***”表示p《0.001，“****”表示p《0.0001。
[0065]
5、实验结果
[0066]
如图2所示，对入组的所有结肠癌患者进行cd19和cd69免疫组化评分后，得到活化b细胞高表达和活化b细胞低表达的统计人群，对此符合条件的人群进行生存分析发现cd19和cd69均高表达即活化b细胞高表达的结肠癌患者预后显著更好(p＝0.012，hr：2.196，95％ci：1.340-3.597)。
[0067]
如图3所示，对结肠癌无转移患者和结肠癌肝转移患者分别进行生存分析，发现结肠癌无转移患者高表达活化b细胞预后有更好的趋势，但是没有统计学差异(p＝0.199，hr：2.532，95％ci：0.859-7.463)(图3-1)，而结肠癌肝转移患者高表达活化b细胞预后显著更好(p＝0.004，hr：2.702，95％ci：1.598-4.566)(图3-2)，在仅有肝转移的患者中也发现了同样的结果(p＝0.024，hr：2.289，95％ci：1.271-4.123)(图3-3),因为结肠癌无转移患者普遍生存情况更好，提示活化b细胞的表达水平可能更适用于结肠癌肝转移患者的生存评估。
[0068]
综上所述，本发明基于cd19和cd69共同标志的活化b细胞的表达情况用于评价结肠癌及结肠癌肝转移预后，首先制作结肠癌原发灶的组织切片，通过免疫组织化学染色，基于cd19和cd69的表达进行免疫评分反映活化b细胞的表达情况，根据免疫评分进行分组，高表达活化b细胞的结肠癌及结肠癌肝转移的患者具有更好的预后。