利伐沙班异构体含量的检测方法与流程

1.本发明涉及分析化学技术领域，特别是涉及一种利伐沙班异构体含量的检测方法。


背景技术：

2.抗凝药物在预防血栓中发挥重要作用，但传统的抗凝药物如肝素需胃肠道外给药,院外使用不便。口服抗凝药如华法林治疗窗窄,需经常监测凝血酶原时间,给患者使用带来不便。新型口服抗凝剂利伐沙班(rivaroxaban)是直接xa因子抑制剂，具有使用方便、无需监测的优点"。利伐沙班对xa因子具有高度的选择性，用于髋或膝关节置换术后静脉血栓栓塞症的预防,体内活性和生物利用度极好，具有良好的应用前景。
3.在合成利伐沙班的工艺中，杂质残留将影响到利伐沙班的纯度、收率及质量，因此对利伐沙班工艺杂质进行有效的控制就显得尤为重要。目前利伐沙班有关物质的测定多采用高效正向液相色谱法，而正向色谱检测利伐沙班药品时存在色谱柱耐用性差以及灵敏度低的问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的是克服现有技术中的不足之处，提供一种耐用性较好及准确性较高的利伐沙班异构体含量的检测方法。
5.本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
6.一种利伐沙班异构体含量的检测方法，包括如下步骤：
7.配制所述利伐沙班的供试品溶液；
8.配制所述利伐沙班的对照溶液；
9.采用高效液相色谱仪分别对所述供试品溶液及所述对照溶液进行检测分析操作，其中色谱柱为反相手性色谱柱，流动相为流动相为乙腈水溶液或甲醇水溶液，柱温为20℃～30℃，流速为0.8ml/min～1.2ml/min。
10.在其中一个实施例中，在配制所述利伐沙班的供试品溶液的步骤之前，所述利伐沙班异构体含量的检测方法还包括以下步骤：
11.配制所述利伐沙班的系统适用性试验溶液。
12.在其中一个实施例中，所述系统适用性试验溶液中，利伐沙班异构体和所述利伐沙班的分离度≥1.5。
13.在其中一个实施例中，在配制所述利伐沙班的对照溶液的步骤之后，以及在采用高效液相色谱仪分别对所述供试品溶液及所述对照溶液进行检测分析操作的步骤之前，所述利伐沙班异构体含量的检测方法还包括以下步骤：
14.配制所述利伐沙班的灵敏度溶液。
15.在其中一个实施例中，所述灵敏度溶液中，主峰的信噪比≥10。
16.在其中一个实施例中，所述反相手性色谱柱为chiral pak ic.250*4.6mm，5um。
17.在其中一个实施例中，所述检测分析操作中的进样体积为15μl～25μl。
18.在其中一个实施例中，所述高效液相色谱仪的检测器为紫外吸收检测器，检测波长为250nm。
19.在其中一个实施例中，所述反相手性色谱柱为chiral pak as-h，250*4.6mm.5um。
20.在其中一个实施例中，在配制所述利伐沙班的供试品溶液的步骤之后，以及在采用高效液相色谱仪分别对所述供试品溶液及所述对照溶液进行检测分析操作的步骤之前，所述利伐沙班异构体含量的检测方法还包括以下步骤：
21.对所述供试品溶液进行超声溶解操作。
22.与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：
23.1、本发明的利伐沙班异构体含量的检测方法中采用手性色谱柱，手性色谱柱具有光学活性的单体，固定在色谱中的硅胶或其它聚合物上形成手性固定相。通过引入手性环境能够使利伐沙班的对映异构体间呈现物理特征的差异，从而达到光学异构体拆分的目的，且分离效果较好。进一步地，采用反相手性色谱柱进行反相色谱法测定分析，不仅能够有效地提高利伐沙班和利伐沙班异构体的分离度，还能提高利伐沙班检测过程中的灵敏度，进而提高色谱峰的信噪比，提高利伐沙班测定结果的准确性和精密度。
24.2、本发明的利伐沙班异构体含量的检测方法利用反相手性色谱柱进行反相色谱法测定分析，由于利伐沙班药品中存在大量的辅料，辅料在有机溶剂存在溶解性问题，需要水参与来溶解片剂辅料，但正相系统不能兼容水，容易损坏正相色谱柱。而本发明采用反相色谱法能够解决利伐沙班药品的溶解性问题，同时能够兼容水，从而提高色谱柱的耐用性。
25.3、本发明的利伐沙班异构体含量的检测方法在色谱分析时柱温为20℃～30℃，流速为0.8ml/min～1.2ml/min，使待测样品中的利伐沙班和利伐沙班异构体依次充分分离，出现在不同的保留时间，且能够形成较好的峰形，从而提高利伐沙班测定结果的准确性。
附图说明
26.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
27.图1为本发明一实施方式的利伐沙班异构体含量的检测方法流程图。
具体实施方式
28.为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施方式。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容理解的更加透彻全面。
29.需要说明的是，当元件被称为“固定于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。本文所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的，并不表示是唯一的实施方式。
30.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
31.本技术提供一种利伐沙班异构体含量的检测方法。上述的利伐沙班异构体含量的检测方法包括如下步骤：配制所述利伐沙班的供试品溶液；配制所述利伐沙班的对照溶液；采用高效液相色谱仪分别对所述供试品溶液及所述对照溶液进行检测分析操作，其中色谱柱为反相手性色谱柱，流动相为乙腈，柱温为20℃～30℃，流速为0.8ml/min～1.2ml/min。
32.上述的利伐沙班异构体含量的检测方法中采用手性色谱柱，手性色谱柱具有光学活性的单体，固定在色谱中的硅胶或其它聚合物上形成手性固定相。通过引入手性环境能够使利伐沙班的对映异构体间呈现物理特征的差异，从而达到光学异构体拆分的目的，且分离效果较好。进一步地，采用反相手性色谱柱进行反相色谱法测定分析，不仅能够有效地提高利伐沙班和利伐沙班异构体的分离度，还能提高利伐沙班检测过程中的灵敏度，进而提高色谱峰的信噪比，提高利伐沙班测定结果的准确性和精密度。由于利伐沙班药品中存在大量的辅料，辅料在有机溶剂存在溶解性问题，需要水参与来溶解片剂辅料，但正相系统不能兼容水，容易损坏正相色谱柱。而本发明采用反相色谱法能够解决利伐沙班药品的溶解性问题，同时能够兼容水，从而提高色谱柱的耐用性；上述的利伐沙班异构体含量的检测方法耐用性也较好，系统适用性较稳定。更进一步地，本技术的利伐沙班异构体含量的检测方法在色谱分析时柱温为柱温为20℃～30℃，流速为0.8ml/min～1.2ml/min，使待测样品中的利伐沙班和利伐沙班异构体依次充分分离，出现在不同的保留时间，且能够形成较好的峰形，从而提高利伐沙班测定结果的准确性。
33.请参阅图1，为了更好地理解本技术的利伐沙班异构体含量的检测方法，以下对本技术的利伐沙班异构体含量的检测方法作进一步的解释说明，一实施方式的利伐沙班异构体含量的检测方法包括如下步骤：
34.s100、配制利伐沙班的供试品溶液。
35.在本实施例中，称取预设量的待检测样品，置于量瓶中，并加入稀释剂进行定容操作，得到供试品溶液。具体地，取利伐沙班片细粉640mg，即相当于利伐沙班75mg，其中利伐沙班片由扬子江药业集团广州海瑞药业有限公司提供，精密称定后置于50ml量瓶中，加入不超过50ml的稀释剂，并进行超声操作，然后用稀释剂将容量瓶内的溶液稀释至刻度线，其中稀释剂为乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈：水＝50:50；接着对容量瓶内的样品溶液进行摇匀操作，完成定容操作，得到每1ml中含利伐沙班1.5mg的供试品溶液。
36.s200、配制利伐沙班的对照溶液。
37.在本实施例中，量取预设量的供试品溶液，置于量瓶中，并加入稀释剂进行定容操作，得到对照溶液。具体地，精密量取供试品溶液5ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照储备液；精密量取对照储备液3ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至量瓶刻度线，其中稀释剂为乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈：水＝50:50；接着对容量瓶内的溶液进行摇匀操作，完成定容操作，得到利伐沙班的对照溶液。
38.s300、采用高效液相色谱仪分别对供试品溶液及对照溶液进行检测分析操作，其中色谱柱为反相手性色谱柱，流动相为流动相为乙腈水溶液或甲醇水溶液，柱温为20℃～
30℃，流速为0.8ml/min～1.2ml/min。
39.在本实施例中，采用反相手性色谱柱进行反相色谱法测定分析，不仅能够有效地提高利伐沙班和利伐沙班异构体的分离度，还能提高利伐沙班检测过程中的灵敏度，进而提高色谱峰的信噪比，提高利伐沙班测定结果的准确性和精密度。可以理解的是，由于利伐沙班药品中存在大量的辅料，辅料在有机溶剂存在溶解性问题，需要水参与来溶解片剂辅料，但正相系统不能兼容水，容易损坏正相色谱柱。而本发明采用反相色谱法能够解决利伐沙班药品的溶解性问题，同时能够兼容水，从而提高色谱柱的耐用性。进一步地，色谱分析时柱温为柱温为20℃～30℃，流速为0.8ml/min～1.2ml/min，使待测样品中的利伐沙班和利伐沙班异构体依次充分分离，出现在不同的保留时间，且能够形成较好的峰形，从而提高利伐沙班测定结果的准确性。
40.在其中一个实施例中，在配制利伐沙班的供试品溶液的步骤之前，利伐沙班异构体含量的检测方法还包括以下步骤：配制利伐沙班的系统适用性试验溶液。可以理解的是，通过系统适用性试验溶液对色谱分析做系统适用性试验，能够确定分析使用的色谱系统的有效性和适用性，同时通过系统适用性试验，确立一系列系统适用性参数，以确保不论何时使用，均可维持分析方法的稳定性，而系统适用性试验溶液对系统适用性试验具有较大的影响。为了提高系统适用性试验的准确性，在本实施例中，精密称取利伐沙班异构体对照品6mg，将称取好的利伐沙班对照品置于250ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，并进行摇匀操作，得到利伐沙班异构体储备液，其中稀释剂为乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈：水＝50:50；另精密称取利伐沙班对照品15mg，将称取好的利伐沙班对照品置于10ml量瓶中，精密加入利伐沙班异构体储备液1ml，用稀释剂溶解并稀释制成每1ml中含利伐沙班异构体2.4μg、利伐沙班1.5mg的混合溶液，作为系统适用性溶液，从而提高利伐沙班反相色谱分析系统适用性试验的准确性，进而确保利伐沙班反相色谱分析方法的稳定性。
41.进一步地，系统适用性试验溶液中，利伐沙班异构体和利伐沙班的分离度≥1.5。可以理解的是，分离度又称分辨率，为了判断分离物质对色谱柱在色谱柱中的分离情况，常用分离度作为柱的总分离效能指标，用r表示。r等于相邻色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比，表示相邻两峰的分离程度，r越大，表明相邻两组分分离越好。为了利伐沙班异构体及利伐沙班含量测定的准确性，在本实施例中，系统适用性试验溶液中，利伐沙班异构体和利伐沙班的分离度≥1.5，从而提高色谱分析过程中利伐沙班异构体色谱峰及利伐沙班色谱峰的分离程度，有利于提高利伐沙班异构体及利伐沙班含量测定的准确性。
42.在其中一个实施例中，在配制利伐沙班的对照溶液的步骤之后，以及在采用高效液相色谱仪分别对供试品溶液及对照溶液进行检测分析操作的步骤之前，利伐沙班异构体含量的检测方法还包括以下步骤：配制利伐沙班的灵敏度溶液。可以理解的是，液相色谱仪通过对灵敏度溶液进行测试分析，有利于及时调整利伐沙班检测分析系统，提高色谱峰主峰的信噪比，从而提高利伐沙班检测的准确性，因此，灵敏度溶液对利伐沙班的检测具有较大的影响。为了进一步提高利伐沙班检测的准确性，在本实施例中，配制利伐沙班的灵敏度溶液，并将灵敏度溶液进行上机测定分析。具体地，精密量取对照储备液1ml，将量取好的对照储备液置于100ml量瓶中，用稀释剂稀释至容量瓶刻度，并进行摇匀操作，得到灵敏度溶液。其中稀释剂为乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈：水＝50:50；上述灵敏度溶液能够有效地提高主峰信噪比，从而提高利伐沙班检测的准确性。
43.进一步地，灵敏度溶液中，主峰的信噪比≥10。可以理解的是，信噪比是信号和噪声之间的比值，例如：一针样品，然后观察基线噪声的数值，其噪声是0.1mau(或者0.1mv)，峰高可以读取为10mau。那么这个浓度就是信噪比的100倍。在本实施例中，灵敏度溶液中主峰的信噪比≥10，能够有效地减少基线噪声的影响，从而进一步提高利伐沙班检测的准确性。
44.在其中一个实施例中，反相手性色谱柱为chiral pak ic.250*4.6mm，5um。可以理解的是，手性色谱柱是由具有光学活性的单体，固定在硅胶或其它聚合物上制成手性固定相，通过引入手性环境使对映异构体间呈现物理特征的差异，从而达到光学异构体拆分的目的。反相柱填料主要以硅胶为基质，在其表面键合非极性的十八烷基官能团(ods)称为c18柱，其它常用的反相柱还有c8,c4,c2和苯基柱等。反相柱具有固定相稳定和应用广泛的优点，在本实施例中，反相手性色谱柱为chiral pak ic.250*4.6mm，5um，大赛璐药物手性技术上海有限公司。chiral pak ic.250*4.6mm，5um为键合型色谱柱，能够有效地提高对利伐沙班及利伐沙班异构体的拆分能力，即提高利伐沙班及利伐沙班异构体的分离效果，从而提高利伐沙班检测的准确性，同时能够提高固定相的稳定性，进而提高利伐沙班检测的稳定性。此外，色谱柱chiral pak ic.250*4.6mm，5um不仅能够用于反相色谱系统，也能用于正相色谱，从而提高了液相切换的的简便性。
45.在其中一个实施例中，检测分析操作中的进样体积为15μl～25μl。可以理解的是，在高效液相色谱检测分析中，进样体积对色谱图中各峰的保留值、塔板数或分离度具有较大的影响，如随着进样量的增加，最终会使谱峰展宽，塔板数/v下降，样品分离度变差；若进样量的体积过小，则容易造成峰形不明显或检测困难的问题。为了保证利伐沙班中各成分的分离度，提高检测的精确性，在本实施例中，检测分析操作中的进样体积为15μl～25μl，能够有效地保证利伐沙班在色谱分析过程中保留值及分离度的稳定性，提高检测的精确性。
46.在其中一个实施例中，高效液相色谱仪的检测器为紫外吸收检测器，检测波长为250nm。可以理解的是，检测波长的选择与测定时的吸光度及干扰性有关，利伐沙班在不同检测波长的吸收量不同，且不同波长下对利伐沙班测定的干扰性也不同。为了进一步提高利伐沙班及利伐沙班异构体检测的准确性，在本实施中，将检测波长设定为250nm，经实验测定，利伐沙班的最大吸收波长为250nm，且在250nm的波长下干扰较小，基本没有其它杂质的吸收。此外，色谱峰在检测波长为250nm的位置导数为零，由于测定光不一定是严格的单色光，所以也会引入一些误差。为了使得这部分的误差足够小，在本实施例中选择检测波长250nm，即吸收系数对波长的导数为零的位置进行测量，能够有效地减少测定误差，进一步提高利伐沙班及利伐沙班异构体检测的准确性。
47.在其中一个实施例中，反相手性色谱柱为chiral pak as-h，250*4.6mm.5um。在本实施例中，设定色谱柱柱温为20℃～30℃，流速为0.8ml/min～1.2ml/min，在该色谱条件下，选用chiral pak as-h，250*4.6mm.5um的反相手性色谱柱，能够进一步地提高利伐沙班和利伐沙班异构体的分离度，使待测样品中的利伐沙班和利伐沙班异构体依次充分分离，出现在不同的保留时间，且能够形成较好的峰形，从而进一步提高利伐沙班测定结果的准确性。
48.在其中一个实施例中，在配制利伐沙班的供试品溶液的步骤之后，以及在采用高
效液相色谱仪分别对供试品溶液及对照溶液进行检测分析操作的步骤之前，利伐沙班异构体含量的检测方法还包括以下步骤：对供试品溶液进行超声溶解操作。在本实施例中，取利伐沙班片细粉640mg，即相当于利伐沙班75mg，其中利伐沙班片由扬子江药业集团广州海瑞药业有限公司提供，精密称定后置于50ml量瓶中，加入不超过50ml的稀释剂，并进行超声操作，然后用稀释剂将容量瓶内的溶液稀释至刻度线，通过对配制好的供试品溶液在定容之前进行超声处理，能够有效提高供试品的溶解性，从而提高供试品溶液定容的精确性，即提高供试品溶液浓度的精确性，进而提高利伐沙班含量测定的精确性。
49.进一步地，超声溶解操作中的超声时间为25分钟～35分钟。可以理解的是，若超声时间过短，无法充分溶解溶液中的利伐沙班片细粉，容易造成后续样品的浓度误差；若超声时间过长，则容易使量瓶中的供试品溶液温度过高，从而破坏供试品溶液的稳定性，影响利伐沙班含量的测定，同时超声时间过长也容易影响利伐沙班检测分析的效率。为了提高利伐沙班待测样品的溶解度，同时提高检测效率，在本实施例中，超声溶解操作中的超声时间为25分钟～35分钟，经过25分钟～35分钟的超声操作，能够是利伐沙班细粉充分溶解于稀释剂中，有效地提高利伐沙班待测样品的溶解度，同时提高检测效率。
50.在其中一个实施例中，流动相为乙腈水溶液，乙腈水溶液还包括少量磷酸，其中乙腈：水：磷酸＝85:14.5:0.5。可以理解的是，流动相ph不仅会对色谱柱的稳定性产品影响，并且会对分离的选择性和色谱峰的对称性产生至关重要的作用，尤其是针对某些可以离子化的极性酸碱化合物来说。而在反相色谱系统中，固定相为非极性化合物，流动相为极性化合物，对于含有极性官能团的化合物来说，ph会影响化合物的存在状态，进而影响分离选择性及色谱峰的对称性。为了提高利伐沙班的色谱峰对称性及保留时间，在本实施例中，采用的流动相为乙腈：水：磷酸＝85:14.5:0.5，通过加入上述少量的磷酸，能够抑制乙腈水溶液的离子化作用，增强流动相与反相手性色谱柱固定相之间的相互作用，从而提高利伐沙班化合物的保留时间。此外，通过改变流动相的ph，抑制其解离，可改变极性可解离化合物的容量因子，改变利伐沙班化合物的出峰位置，提高分离的选择性，且提高色谱峰的对称性。
51.进一步地，对配制好的乙腈-水-磷酸流动相，在使用之前进行超声操作。可以理解的是，在色谱分析过程中，流动相的溶解度不均或粘稠度较大容易影响相关化合物的分离度，从而影响利伐沙班及其它物质的峰形，降低利伐沙班测定结果的准确性。为了提高乙腈-水-磷酸流动相的均匀性，同时降低乙腈-水-磷酸流动相的粘稠度，在本实施例中，通过对乙腈-水-磷酸流动相进行超声操作，能够有效地提高乙腈-水-磷酸流动相的溶解度，提高乙腈-水-磷酸流动相的均匀性，同时降低乙腈-水-磷酸流动相的粘稠度，进而提高利伐沙班测定结果的准确性。
52.以下列举一些具体实施例，若提到％，均表示按重量百分比计。需注意的是，下列实施例并没有穷举所有可能的情况，并且下述实施例中所用的材料如无特殊说明，均可从商业途径得到。
53.实施例1
54.配制利伐沙班的供试品溶液：取利伐沙班片细粉640mg，即相当于利伐沙班75mg，其中利伐沙班片由扬子江药业集团广州海瑞药业有限公司提供，精密称定后置于50ml量瓶中，加入不超过50ml的稀释剂，并进行超声操作25分钟，然后用稀释剂将容量瓶内的溶液稀释至刻度线，其中稀释剂为乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈：水＝50:50；接着对容量瓶内的
样品溶液进行摇匀操作，完成定容操作，得到每1ml中含利伐沙班1.5mg的供试品溶液。
55.配制利伐沙班的对照溶液：精密量取供试品溶液5ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照储备液；精密量取对照储备液3ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至量瓶刻度线，其中稀释剂为乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈：水＝50:50；接着对容量瓶内的溶液进行摇匀操作，完成定容操作，得到利伐沙班的对照溶液。
56.上机测定分析：采用高效液相色谱仪分别对供试品溶液及对照溶液进行检测分析操作，以chiral pak ic.250*4.6mm，5um为色谱柱，以乙腈为流动相，进样体积为15μl；检测波长为250nm，柱温为20℃，流速为0.8ml/min。
57.实施例2
58.配制利伐沙班的供试品溶液：取利伐沙班片细粉640mg，即相当于利伐沙班75mg，其中利伐沙班片由扬子江药业集团广州海瑞药业有限公司提供，精密称定后置于50ml量瓶中，加入不超过50ml的稀释剂，并进行超声操作25分钟，然后用稀释剂将容量瓶内的溶液稀释至刻度线，其中稀释剂为乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈：水＝50:50；接着对容量瓶内的样品溶液进行摇匀操作，完成定容操作，得到每1ml中含利伐沙班1.5mg的供试品溶液。
59.配制利伐沙班的对照溶液：精密量取供试品溶液5ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照储备液；精密量取对照储备液3ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至量瓶刻度线，其中稀释剂为乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈：水＝50:50；接着对容量瓶内的溶液进行摇匀操作，完成定容操作，得到利伐沙班的对照溶液。
60.上机测定分析：采用高效液相色谱仪分别对供试品溶液及对照溶液进行检测分析操作，以chiral pak ic.250*4.6mm，5um为色谱柱，以乙腈为流动相，进样体积为25μl；检测波长为250nm，柱温为30℃，流速为1.2ml/min。
61.实施例3
62.配制利伐沙班的供试品溶液：取利伐沙班片细粉640mg，即相当于利伐沙班75mg，其中利伐沙班片由扬子江药业集团广州海瑞药业有限公司提供，精密称定后置于50ml量瓶中，加入不超过50ml的稀释剂，并进行超声操作25分钟，然后用稀释剂将容量瓶内的溶液稀释至刻度线，其中稀释剂为乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈：水＝50:50；接着对容量瓶内的样品溶液进行摇匀操作，完成定容操作，得到每1ml中含利伐沙班1.5mg的供试品溶液。
63.配制利伐沙班的对照溶液：精密量取供试品溶液5ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照储备液；精密量取对照储备液3ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至量瓶刻度线，其中稀释剂为乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈：水＝50:50；接着对容量瓶内的溶液进行摇匀操作，完成定容操作，得到利伐沙班的对照溶液。
64.上机测定分析：采用高效液相色谱仪分别对供试品溶液及对照溶液进行检测分析操作，以chiral pak ic.250*4.6mm，5um为色谱柱，以乙腈为流动相，进样体积为20μl；检测波长为250nm，柱温为25℃，流速为1.0ml/min。
65.实施例4
66.配制利伐沙班的供试品溶液：取利伐沙班片细粉640mg，即相当于利伐沙班75mg，其中利伐沙班片由扬子江药业集团广州海瑞药业有限公司提供，精密称定后置于50ml量瓶中，加入不超过50ml的稀释剂，并进行超声操作25分钟，然后用稀释剂将容量瓶内的溶液稀释至刻度线，其中稀释剂为乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈：水＝50:50；接着对容量瓶内的
样品溶液进行摇匀操作，完成定容操作，得到每1ml中含利伐沙班1.5mg的供试品溶液。
67.配制利伐沙班的对照溶液：精密量取供试品溶液5ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照储备液；精密量取对照储备液3ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至量瓶刻度线，其中稀释剂为乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈：水＝50:50；接着对容量瓶内的溶液进行摇匀操作，完成定容操作，得到利伐沙班的对照溶液。
68.上机测定分析：采用高效液相色谱仪分别对供试品溶液及对照溶液进行检测分析操作，以chiral pak as-h，250*4.6mm.5um为色谱柱，以乙腈为流动相，进样体积为20μl；检测波长为250nm，柱温为25℃，流速为1.0ml/min。
69.1、测定本技术利伐沙班异构体含量的检测方法的准确度
70.按50％、100％、120％三个浓度水平，称取利伐沙班异构体加入到供试品溶液中，配制方法同上述供试品溶液配制方法，采用本方法进行检测，计算加样回收率，结果见表1：
[0071][0072]
表1
[0073]
由表1的结果可知，在50％、100％、120％三个浓度水平下，平均回收率为101.2％，rsd为0.6％(n＝9)，结果符合要求，说明本技术利伐沙班异构体含量的检测方法具有较好的准确性。
[0074]
2、测定本技术利伐沙班异构体含量的检测方法的重复性
[0075]
取同一批次，配制6份样品，分别进样检测，结果显示，6份样品的测定结果均在0.032％～0.035％之间，rsd为3.2％(n＝6)，说明本技术利伐沙班异构体含量的检测方法的重复性较好。
[0076]
3、测定本技术利伐沙班异构体含量的检测方法中的溶液稳定性
[0077]
取供试品溶液1份，分别于配样后4h、8h、12h、16h、20h、24h进样，统计异构体含量，结果如表2所示：
[0078][0079]
表2
[0080]
由表2的结果可知，本技术中的样品溶液在24h内具有较好的稳定性。
[0081]
与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：
[0082]
1、本发明的利伐沙班异构体含量的检测方法中采用手性色谱柱，手性色谱柱具有光学活性的单体，固定在色谱中的硅胶或其它聚合物上形成手性固定相。通过引入手性环境能够使利伐沙班的对映异构体间呈现物理特征的差异，从而达到光学异构体拆分的目的，且分离效果较好。进一步地，采用反相手性色谱柱进行反相色谱法测定分析，不仅能够有效地提高利伐沙班和利伐沙班异构体的分离度，还能提高利伐沙班检测过程中的灵敏度，进而提高色谱峰的信噪比，提高利伐沙班测定结果的准确性和精密度。
[0083]
2、本发明的利伐沙班异构体含量的检测方法利用反相手性色谱柱进行反相色谱法测定分析，由于利伐沙班药品中存在大量的辅料，辅料在有机溶剂存在溶解性问题，需要水参与来溶解片剂辅料，但正相系统不能兼容水，容易损坏正相色谱柱。而本发明采用反相色谱法能够解决利伐沙班药品的溶解性问题，同时能够兼容水，从而提高色谱柱的耐用性。
[0084]
3、本发明的利伐沙班异构体含量的检测方法在色谱分析时柱温为20℃～30℃，流速为0.8ml/min～1.2ml/min，使待测样品中的利伐沙班和利伐沙班异构体依次充分分离，出现在不同的保留时间，且能够形成较好的峰形，从而提高利伐沙班测定结果的准确性。
[0085]
以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。