一种甘薯花青素相关SNP分子标记、鉴定及其应用的制作方法

一种甘薯花青素相关snp分子标记、鉴定及其应用
技术领域
1.本发明属于甘薯育种领域，具体涉及一种甘薯花青素相关snp分子标记、鉴定及其应用。


背景技术：

2.花青素是一种天然水溶性的食用色素。甘薯（ipomoea batatas(l.)lam）种质资源中花青素的积累呈现丰富的多态性。甘薯中的花青素被广泛的应用于食品、药品等领域。单核苷酸多态性（snp）作为最新一代遗传分子标记，目前被广泛的应用于生物各研究领域。目前，甘薯各生长位点花青素积累性状之间还没有系统的关联性分析。选育紫甘薯品种需要将有性杂交获得的种子先在苗床发苗，然后移栽到大田里，待结薯之后才能知道是否是紫薯，该育种过程时间长，且需要消耗大量的人力物力。


技术实现要素：

3.针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种甘薯花青素相关snp分子标记。
4.本发明还提供了一种鉴定甘薯花青素的方法。
5.本发明还提供了一种甘薯花青素相关snp分子标记在甘薯育种中的应用。
6.本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：本发明提供了一种甘薯花青素相关snp分子标记，所述分子标记为snp位点（chr12.20497784），基因型为gg，ga，aa。
7.进一步的，所述基因型为gg时，薯块不含有花青素；所述基因型为ga或者aa，薯块含有花青素。
8.进一步的，所述snp位点基因分型检测中，涉及pcr扩增反应；pcr扩增反应中扩增引物p1、p2的核苷酸序列分别为seq id no.1 、seq id no.2所示；具体如下所示：seq id no.1：tcgcctactctgctcctctgseq id no.2：gggtgcgttggtaggtgttt进一步的，所述snp位点检测中，涉及单碱基延伸反应；单碱基延伸反应中延伸引物的核苷酸序列如seq id no.3所示；具体序列如下所示：seq id no.3：ttttttttttttttttcttttggtgttttgatacgc本发明还提供了一种利用上述snp位点鉴定甘薯的薯块中是否含有花青素的方法，所述方法包括检测snp位点chr12.20497784，以确定待检测甘薯该snp位点处的基因型为gg，ga或aa；所述基因型为gg时，薯块不含有花青素；所述基因型为ga或者aa，薯块含有花青素。
9.本发明所提供的鉴定方法，具体包括以下步骤：（1）将提取的dna样品稀释至20ng/μl后作为pcr模板，进行单一扩增；（2）将扩增好的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，300v电压下12分钟，获取鉴定胶图，通过胶图确定目的条带大小，将pcr产物进行纯化；
（3）纯化好的单一pcr产物待用，单碱基延伸引物稀释到10μm，进行snapshot pcr；（4）纯化好的混合pcr产物待用，单碱基延伸引物稀释到10μm，将各位点的等体积单碱基延伸引物混合，得到pooled primers，进行snapshot pcr，（5）进行毛细管检测。
10.进一步的，步骤（1）中，所述扩增体系及各组分如下：。
11.进一步的，步骤（3）中，所述pcr体系及各组分如下：进一步的，步骤（4）中，所述pcr体系及各组分如下：本发明还提供了一种上述甘薯花青素相关snp分子标记在甘薯育种中的应用。
12.本发明对甘薯杂交群体中代表性个体（30个花青素株系 30个不含花青素株系）进行重测序分析；由于甘薯目前还没有可用于参考的基因组，目前甘薯的基因组重测序是基于其近缘种三浅裂野牵牛（ipomoeatrifida）的基因组序列（http://sweetpotato.uga.edu/gt4sp_download.shtml，ipomoeatrifida(nsp306)genomeassembly(v3)），其标记的位点信息是三浅裂野牵牛的基因组位点，实验发现三浅裂野牵
牛的基因组序列可以用于甘薯基因型分析。
13.本发明对上述1个snp位点在杂交群体其他株系中，通过snapshot技术平台对snp位点进行基因分型，验证这个snp位点在杂交群体中的可信度；对上述1个snp位点在自然群体中，通过snapshot技术平台对snp位点进行基因分型，验证这个snp位点在自然群体中的可信度。
14.本发明所指出的ga/aa基因型的株系薯块中含有花青素，是指其概率大于90%。
15.本发明提供的鉴定方法，在种子阶段通过提取胚的基因组dna或实生苗幼苗期通过提取叶片基因组dna，就能够预测将来发育的薯块是否是紫薯。同样，该方法也可以用来开发甘薯其他重要农艺性状的分子标记，这个方法较常规方法相比节省了费用和数据分析的时间。
16.本发明的有益效果为：（1）本发明提供的鉴定方法，与常规群体株系全部重测序分析snps相比具有数据量小，花费少等优点。
17.（2）本发明提供的方法，在种子阶段或实生苗幼苗期取叶片就可以通过snapshot技术平台对snp位点进行基因分型验证植株薯块中是否含有花青素，与常规的在结薯之后才能知道植株薯块是否含有花青素相比，节省了育种时间。
具体实施方式
18.下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
19.实施例1snapshot技术实验方法1、dna提取使用tsingke植物dna提取试剂盒（通用型），具体步骤如下：1.1将spincolumn置于collectiontube中，加入250μlbufferbl，12000rpm/min离心1min活化硅胶膜；1.2取样本干燥组织（不大于20mg），加入液氮充分研磨。研磨后置于1.5ml离心管中，加入400μlbuffergp1，涡旋振荡1min，65℃水浴10~30min，期间可取出颠倒混匀以充分裂解；1.3加入150μlbuffergp2，涡旋振荡1min，冰浴5min；1.412000rpm/min离心5min，将上清转移至新的离心管中；1.5加入上清等体积的无水乙醇，立即充分振荡混匀，液体全部转入spincolumn中，12,000rpm/min离心30s，弃废液；1.6向spincolumn中加入500μlbufferpw（使用前已加入无水乙醇），12000rpm/min离心30s，弃废液；1.7向spincolumn中加入500μlwashbuffer（使用前已加入无水乙醇），12000rpm/min离心30s，弃废液；1.8重复操作步骤4.1.7；1.9将spincolumn放回collectiontube中，12,000rpm/min离心2min，开盖晾干1min；
1.10取出spincolumn，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中央处加50~100μltebuffer（65℃预热tebuffer），20~25℃放置2min，12,000rpm/min离心2min。
20.2、引物设计原则2.1外围引物设计原则引物长度在15—30bp，其有效长度一般不大于38，否则pcr的最适延伸温度会超过taq酶的最佳作用温度，从而降低产物的特异性。gc含量应在40%一60%之间，最适tm值在58—60℃。引物自身不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。
21.2.2单碱基延伸引物设计原则引物长度在15—30bp，gc含量在40%一60%之间，最适tm值在58—60℃。为了能够分辨不同snp的不同基因型，可在引物的5'末端加上不同长度的polyc或polyt，使各条引物以长度区分。加尾后的引物最短设计为36bp，相邻两个snp位点引物的长度一般相差4-6个核苷酸。
22.3、外围扩增提取的dna样品稀释至20ng/μl后作为pcr模板，以擎科1.1
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t3superpcrmix进行扩增，进行单一扩增，按以下扩增体系和程序进行扩增，扩增体系及各组分如表1所示。
23.表1以上扩增体系按以下扩增程序扩增，扩增程序如表2所示。
24.表2
4、电泳检测将扩增好的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳（2μl样品 6μl溴酚蓝），300v电压下12分钟，获取鉴定胶图，通过胶图确定目的条带大小。
25.5、pcr产物纯化5.1单一pcr产物纯化5.1.1pcr产物取10μl加入1.2ml96孔平口板中，加入100μl的buffergl，盖上硅胶膜，65℃水浴7min；5.1.2揭开硅胶垫，用连续加液器每孔加入10μl已经混匀的磁珠，盖上硅胶垫，震荡1min，水平震荡仪800rpm震荡5min，将96孔板卡入磁力架中，磁吸1min；5.1.3弃废液，加入300μlw1，盖上硅胶垫，涡旋震荡30s，将96孔板卡入磁力架中，磁吸1min；5.1.4弃废液，加入500μlw2，盖上硅胶垫，涡旋震荡30s，将96孔板卡入磁力架中，磁吸1min；5.1.5弃废液，倒离心至500rpm，离心结束后取下磁力架，加入25μl的tebuffer，盖上封口膜，水平振荡10s，65℃水浴5min，水平振荡2min；5.1.6水平振荡后取下离心至1000rpm1min，即所得纯化后pcr产物。
26.5.2混合pcr产物纯化5.2.1所有样品各位点pcr产物各取10μl加入1.2ml96孔平口板中，加入混合pcr产物5倍体积的buffergl，盖上硅胶膜，65℃水浴7min；5.2.2揭开硅胶垫，用连续加液器每孔加入10μl已经混匀的磁珠，盖上硅胶垫，震荡1min，水平震荡仪800rpm震荡5min，将96孔板卡入磁力架中，磁吸1min；5.2.3弃废液，加入300μlw1，盖上硅胶垫，涡旋震荡30s，将96孔板卡入磁力架中，磁吸1min；5.2.4弃废液，加入500μlw2，盖上硅胶垫，涡旋震荡30s，将96孔板卡入磁力架中，磁吸1min；5.2.5弃废液，倒离心至500rpm，离心结束后取下磁力架，加入25μl的tebuffer，盖上封口膜，水平振荡10s，65℃水浴5min，水平振荡2min；5.2.6水平振荡后取下离心至1000rpm1min，即所得纯化后pcr产物。
27.6、snp位点单碱基延伸6.1单一snp位点单碱基延伸纯化好的单一pcr产物待用，单碱基延伸引物稀释到10μm，进行snapshotpcr，pcr体系及各组分如表3所示。
28.表3
6.2混合snp位点单碱基延伸纯化好的混合pcr产物待用，单碱基延伸引物稀释到10μm，将各位点的等体积单碱基延伸引物混合，得到pooledprimers，进行snapshotpcr，pcr体系及各组分如表4所示。
29.表4以上扩增体系均按以下扩增程序进行snapshot单碱基延伸反应，反应条件如表5所示。
30.表57、毛细管检测7.1将hidi与gs120liz按100：1混合，配成mix。
31.7.2用96孔pcr反应板分装mix，每个孔中加入10μlmix。
32.7.3 对应着在96孔板中加入1μl样品模板，离心到4000 rpm即停。
33.7.4 用金属浴加热器将混合板95℃加热预变性5分钟，拿出后立即放入-20℃。
34.7.5 冷却后拿出，4000 rpm离心，解冻、混匀。
35.7.6 上3730测序仪进行毛细管电泳。
36.效果实施例（一）利用本发明提供的鉴定方法，对现有的甘薯品种进行检验，具体结果见表6。
37.表6