一种抗体偶联胶乳微球的监控方法及其应用与流程

1.本发明属于免疫分析医学检测领域。具体而言，本发明涉及一种抗体偶联胶乳微球的监控方法及其应用。


背景技术：

2.胶乳免疫比浊法是一种稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法，有散射比浊和透射比浊两种检测方法。这两种方法的基本原理都是胶乳微球物理吸附抗体，当被吸附的抗体与抗原结合后，短时间迅速聚集，从而改变反应液的散光或透光性能。
3.胶乳增强免疫比浊法(particle-enhanced turbidimetric immunoassay，petia)则采用化学偶联的方式将微球与抗体连接形成复合物，进而再结合抗原并发生聚集。比之物理吸附，化学偶联可降低抗体与微球结合时的位阻效应，同时也有效保护了抗体的三维结构，尤其是生物活性区域。
4.如果偶联效率不高，当体系中待检测抗原不足时，胶乳微球表面在偶联后还空出许多反应基团，这些基团又可以与已偶联至其它微球的抗体发生反应，从而产生非检测性凝集反应，影响最终检测结果。因此，获得偶联效率最佳的条件十分必要，而偶联过程监控方法则为实现该目的提供了可能。


技术实现要素：

5.本发明目的之一在于提供一种抗体偶联胶乳微球的监控方法，该方法能够通过荧光强度值的变化趋势，实时反应抗体与胶乳微球的偶联情况，有利于寻找偶联效率最佳的反应条件。
6.为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
7.本发明提供一种抗体偶联胶乳微球的偶联过程监控方法：
8.1)提供一种胶乳微球，并进行活化；
9.2)提供一种抗体；
10.3)提供一种可与所述抗体结合的荧光染料；
11.4)将1)中经活化的所述胶乳微球与所述荧光染料混合，制得混合液；
12.5)向4)制得的混合液中加入2)中所得抗体，进行反应，选择不同的反应时间点获取反应形成的荧光标记抗体-胶乳微球复合物，重悬后测量荧光信号值。
13.在一些实施方案中，所述步骤1)—3)的顺序是可互换的，且步骤1)—3)还包括加入缓冲液，步骤1)还包括加入活化剂。
14.在一些实施方案中，步骤5)还包括通过离心方式获取反应形成的荧光标记抗体-胶乳微球复合物。
15.在一些实施方案中，步骤5)还包括通过紫外分光光度法测量重悬液的荧光信号值。
16.在一些实施方案中，所述抗体是脂联素单克隆抗体。
17.在一些实施方案中，所述脂联素单克隆抗体na1的浓度为2mg/ml。
18.本发明提供一种脂联素单克隆抗体偶联胶乳微球的偶联过程监控方法：
19.1)提供一种胶乳微球，并进行活化；
20.2)提供一种脂联素单克隆抗体；
21.3)提供一种可与所述抗体结合的荧光染料；
22.4)将1)中经活化的所述胶乳微球与所述荧光染料混合，制得混合液；
23.5)向4)制得的混合液中加入2)中所得抗体，进行反应，选择不同的反应时间点获取反应形成的荧光标记抗体-胶乳微球复合物，重悬后测量荧光信号值。
24.在一些实施方案中，所述活化剂包括但不限于edc、nhs、或其任意比例的组合。可以理解，本领域技术人员能根据选用的胶乳微球表面基团的种类选择对应的活化剂。
25.在一些实施方案中，所述胶乳微球为羧基型胶乳微球，活化剂选自edc、nhs、cdi、cmpi。在一些实施方案中，所述胶乳微球为氨基型或酰肼型胶乳微球，活化剂选自交联剂、硼氢化氰。在一些实施方案中，所述胶乳微球为醛基型胶乳微球，活化剂选自硼氢化氰、苯胺。在一些实施方案中，所述胶乳微球为巯基型胶乳微球，活化剂选自交联剂、四硫磺酸钠、4,4
’‑
联吡啶二硫醚。在一些实施方案中，所述胶乳微球为羟基型胶乳微球，活化剂选自cdi、对甲苯磺酰氯、羟基溴化氰、dsc、双环氧基化合物。在一些实施方案中，所述胶乳微球为金属基型胶乳微球，活化剂选自硫醇或二硫醇。在一些实施方案中，所述胶乳微球为硅羟基型胶乳微球，活化剂为硅烷。
26.在一些实施方案中，所述胶乳微球为羧基型胶乳微球，活化剂为edc。
27.在一些实施方案中，所述活化剂为1mg/ml的edc。
28.在一些实施方案中，所述荧光染料可通过物理吸附或化学偶联的方式与抗体结合，可选自异硫氰酸荧光素(fitc)、藻红蛋白(pe)、多甲藻黄素叶绿素蛋白(percp)、碘化丙啶(pi)、罗丹明、别藻青蛋白(apc)或其组合。
29.在一些实施方案中，所述荧光染料为异硫氰酸荧光素(fitc)。
30.在一些实施方案中，所述缓冲液可选自mes缓冲液、pbs缓冲液、hepes缓冲液、mops缓冲液、mopso缓冲液、goods缓冲液、柠檬酸钠缓冲液。缓冲液ph选自ph 5.00-8.00范围内。应当理解，本领域技术人员可以根据胶乳颗粒、抗体和荧光染料的类型自行确定缓冲液类型、缓冲液浓度及其ph范围。
31.在一些实施方案中，在步骤1)和3)中加入缓冲液r1，缓冲液r1为mes缓冲液；在步骤2)中加入缓冲液r2，所述缓冲液r2为hepes-柠檬酸钠缓冲液。
32.在一些实施方案中，在步骤1)和3)中加入缓冲液r1，所述缓冲液r1为mes缓冲液，浓度选自0.01～0.05mol/l，ph选自6.00～6.50；在步骤2)中加入缓冲液r2，所述缓冲液r2为hepes-柠檬酸钠缓冲液，所述hepes浓度为10mol/l，所述柠檬酸钠浓度为0.1mol/l，ph为3.50。
33.在一些实施方案中，所述mes缓冲液的浓度为0.03mol/l，ph为6.00。
34.在一些实施方案中，所述胶乳微球直径为60nm至400nm。本领域技术人员可以理解，本发明的实施并不依赖于微球的尺寸，只要其表面具有可用于与抗体蛋白偶联的化学修饰，就可以用于实施本发明。在petia领域中，常见微球的粒径为60nm至400nm。在一些实施方案中，所述胶乳微球直径为120nm至130nm。在一些实施方案中，所述胶乳微球直径为
123nm。
35.在一些实施方案中，所述胶乳微球粒径为123nm、固含量为5％。
36.本领域技术人员可以理解，本发明的实施并不依赖于特定的抗体，只要经处理可与活化胶乳微球进行偶联，就可以用于实施本发明。也可根据具体实验需求，自行确定用于反应的抗体浓度。
37.本发明的一个目的是提供一种抗体偶联胶乳微球的偶联过程监控方法在筛选抗体-胶乳微球偶联物生产条件中的应用。
38.本发明的有益效果：本发明利用荧光染料对抗体的吸附性进行抗体标记，再除去溶液中未偶联的抗体，通过荧光信号值的变化监控偶联过程中偶联效率的变化，以便于本领域技术人员筛选偶联效率最佳的反应条件。
具体实施方式
39.本发明通过荧光染料对抗体蛋白的吸附性，再通过离心方式去掉了溶液中未偶联的蛋白，通过单位时间内荧光信号值的强弱判断偶联过程中偶联效率的变化。为了使本发明易于理解，下面结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
40.本领域技术人员可以理解，以下实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，均为按照本领域内常规技术或条件，或按照产品说明书进行。所用材料、试剂或仪器未注明生产厂商者，均为市售产品。除非另有指明，“％”表示质量/体积。
41.以下提供了本发明实施方式中所使用的具体材料及其来源。但本领域技术人员可以理解，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。
42.以下实施例以脂联素(nadp)单克隆抗体na1为例进行了测试，但是本领域技术人员能够理解，其它可偶联至胶乳微球的抗体、多肽、蛋白质等分子同样可用来实施本发明。
43.以下实施例以粒径为123nm、固含量为5％的胶乳微球为例进行了测试，但是本领域技术人员能够理解，其它可与抗体偶联的微球同样可用来实施本发明。
44.在本发明上下文中，“胶乳微球”是一种人工合成的聚合物，常用的单体材料包括苯乙烯、苯胺、壳聚糖单体等；胶乳颗粒的大小，随聚合中各物质的比例不同而异，可根据不同用途进行合成，直径从几十纳米到几微米不等；常见的胶乳颗粒多为表面修饰的，因为此类颗粒可以广泛用于许多领域(如生物化学、医学、药学、色谱柱填料及临床检验等)，这些修饰基团例如羧基、羟基、氨基、乙烯基、偶氮基、酰阱、醛基、环氧基、巯基、金属基、硅羟基等。
45.在本发明上下文中，“抗体”包括单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、双特异性抗体、猿源化(simianized)抗体、人抗体和人源化抗体，以及其活性片段。结合已知抗原的分子的活性片段的实例包括分开的轻链和重链、fab、fab/c、fv、fab
′
和f(ab
′
)2片段，包括fab免疫球蛋白表达文库的产物和上述的任何抗体和片段的表位结合片段。
46.材料和仪器
47.胶乳微球
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jsr株式会社(日本)，货号p0016
48.脂联素单克隆抗体na1
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武汉华美生物工程有限公司，货号csb-da120mn
49.异硫氰酸荧光素(fitc)
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上海源叶生物科技有限公司，货号s19127
50.紫外分光光度计
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上海美谱达仪器有限公司，仪器型号uv-1800
51.实施例1：抗体-胶乳微球偶联复合物的制备
52.(1)配制0.02～0.05mol/l的mes缓冲液，用0.05mol/l的氢氧化钠溶液调节ph至6.00～6.50,充分混匀；
53.(2)称取hepes固体0.2383g，溶于100ml现配的0.1m、ph 3.5的柠檬酸钠水溶液中；
54.(3)取一定量的脂联素(nadp)单克隆抗体na1，用(2)中的缓冲液稀释至2mg/ml，待用；
55.(4)取粒径为123nm、固含量为5％的胶乳微球2ml，用(1)中溶液进行稀释至100ml，搅拌混匀，37℃恒温震荡30分钟；
56.(5)活化剂需要现配现用，称取edc固体0.2490g，用纯化水配置成1mg/ml，后加入到(4)的反应液中，放置摇床，37℃恒温震荡30分钟；
57.(6)取异硫氰酸荧光素(fitc)0.5ml，加入1ml(1)中的缓冲液，充分搅拌混匀后向反应溶液(5)中加入稀释后的异硫氰酸荧光素(fitc)；
58.(7)迅速向步骤(6)中所得的反应溶液中加入步骤(3)中获得的稀释后的抗体溶液，缓慢滴加搅拌混匀，放置摇床，37℃恒温震荡60分钟。
59.实施例2：抗体-胶乳微球偶联过程的监控
60.(1)当实施例1步骤(7)加入(3)中获得的稀释后的抗体溶液后，在反应不同时间点进行取样200ul，取样时间点为10min、20min、30min、40min、50min、60min。16000rpm、15min条件下，用离心机对每份样品进行离心，去上清后用纯化水重悬离心产物，用紫外分光光度计检测每个取样时间点的荧光信号值，紫外检测波长为565nm。
61.实施例3：不同ph的mes缓冲液条件下，抗体-胶乳微球偶联过程的监控
62.分别选用不同ph(ph分别为6.00、6.10、6.20、6.30、6.40、6.50)的0.05mol/l mes缓冲液，按照实施例1的方法制备抗体-胶乳微球偶联复合物，按照实施例2的方法测定反应10min、20min、30min、40min、50min、60min时重悬液的荧光信号值，从而对偶联效率进行评测。
63.实验结果(表1)表明，改变mes缓冲液的ph，会直接影响到偶联效率；但不管mes缓冲液的ph取值多少，在反应开始后60min内，荧光信号值随着反应时间的增长而增加，表明偶联效率与反应时间成正比。
64.根据表1，反应10min和20min时，偶联效率由高到低的样品排列顺序为：4、5、2、6、3、1；反应20min以上，偶联效率由高到低的样品排列顺序为：4、5、2、6、1、3。
65.表1不同ph的mes缓冲液不同反应时间下的荧光信号值
66.[0067][0068]
实施例4：不同浓度的mes缓冲液条件下，抗体-胶乳微球偶联过程的监控
[0069]
分别选用不同浓度(浓度分别为0.01mol/l、0.02mol/l、0.03mol/l、0.04mol/l、0.05mol/l)的mes缓冲液，其ph为6.00，按照实施例1的方法制备抗体-胶乳微球偶联复合物，按照实施例2的方法测定反应10min、20min、30min、40min、50min、60min时重悬液的荧光信号值，从而对偶联效率进行评测。
[0070]
实验结果(表2)表明，改变mes浓度，会影响到荧光信号值的强弱，即会影响到偶联效率的变化；但不管mes浓度取值多少，在反应开始后60min内，荧光信号值总是随着反应时间的增长而增加，表明偶联效率与反应时间成正比。
[0071]
根据表2，反应20分钟后，同一时间点下，偶联效率随mes浓度的增加而变高。对比不同的mes浓度组别，mes浓度越低，反应则越趋温和。
[0072]
表2不同浓度mes缓冲液不同反应时间下的荧光信号值
[0073][0074]
综上所述，不同实验条件下，改变单一因素会直接影响整体反应偶联效率的变化。而不同的反应时间段，偶联效率会存在明显差异，本领域技术人员可以根据实际需要，选择最适的实验条件和最适反应时间。例如，在一些偶联方案中，需在较短的反应时间内达到较大的偶联效率；在另一些偶联方案中，则需选择较为平缓的偶联过程，从而有利于过程点的控制。
[0075]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。