一种用于姜黄素经皮给药的壳聚糖微乳及其制备方法与流程

1.本发明涉及生物医用材料的技术领域，尤其是指一种用于姜黄素经皮给药的壳聚糖微乳及其制备方法。


背景技术：

2.常见的给药途径主要包括口服给药、肌肉注射、静脉注射、呼吸道给药以及经皮给药等。口服给药安全方便，但药物由于肝脏首过效应，生物利用率较低。而注射给药方式因为注射部位靠近神经以及瞬间高血药浓度，具有较高的确风险。呼吸道给药途径的缺点在于剂量不易控制、日常给药不够方便。经皮给药作为继口服、注射后的第三大给药系统，是指药物通过皮肤吸收进入人体血液循环并达到有效血药浓度，实现疾病治疗或预防的一类给药途径。经皮给药主要具有以下优势：
①
避免肝脏首过效应，减少药物代谢损失，提高药物生物利用率；
②
血药浓度持久可控，增强疗效的同时，降低药物毒性和不良反应，提高药物安全性；
③
药物可撤性良好，日常用药简单便捷；
④
为无法口服以及注射给药的患者提供了另一种给药治疗的方式。然而经皮给药的主要难点在于皮肤具有高屏障作用，药物难以透过皮肤角质层进入皮下血液循环。
3.微乳除了能为药物提供稳定的载药环境外，其纳米级别的尺寸还可以有效促进药物通过毛囊、汗腺等皮肤附属器途径透过皮肤。所以微乳成为经皮给药领域的重要载体。但是，传统微乳中大量表面活性剂会影响药物的稳定性，并具有较强皮肤刺激性，给皮肤带来不可逆的损伤。
4.姜黄素是一种从姜黄根茎中提取得到的黄色色素，具有降血脂、抗肿瘤、抗炎、利胆、抗氧化等功效，但是由于其化学不稳定性、难溶性、低生物利用度等缺点，具体应用受到限制。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提出了一种用于姜黄素经皮给药的壳聚糖微乳及其制备方法，该壳聚糖微乳拥有纳米尺寸，且粒径稳定，同时还可以提高姜黄素的溶解性及化学稳定性，并增强其透皮效果。
6.为实现上述目的，本发明所提供的技术方案为：一种用于姜黄素经皮给药的壳聚糖微乳的制备方法，包括以下步骤：
7.1)将长链烷基叔胺与环氧氯丙烷反应，制备得到环氧长链烷基季铵盐；
8.2)将水溶性壳聚糖衍生物溶于异丙醇与水的混合溶液中，在碱性条件下，加入步骤1)制备得到的环氧长链烷基季铵盐，反应得到两亲性壳聚糖衍生物；
9.3)将步骤2)反应得到的两亲性壳聚糖衍生物溶于水相，加入油相搅拌均匀后，加入助表面活性剂，制备得到壳聚糖微乳；
10.4)取0.1～3.5mg/ml的姜黄素加入到步骤3)制备的壳聚糖微乳中，超声至姜黄素完全溶解即可得到载药的壳聚糖微乳。
11.优选的，在步骤1)中，所述长链烷基叔胺为n,n-二甲基正十二胺、n,n-二甲基正十三胺、n,n-二甲基正十四胺、n,n-二甲基正十五胺、n,n-二甲基正十六胺、n,n-二甲基正十七胺、n,n-二甲基正十八胺中的一种。
12.优选的，在步骤1)中，所述长链烷基叔胺与环氧氯丙烷的质量比为1.62:1。
13.优选的，在步骤2)中，所述水溶性壳聚糖衍生物为羧甲基壳聚糖、磷酸酯化壳聚糖、硫酸酯化壳聚糖、壳聚糖-聚乙二醇共聚物、赖氨酸壳聚糖中的一种，浓度为0.05g/ml。
14.优选的，在步骤2)中，所述环氧长链烷基季铵盐与水溶性壳聚糖衍生物的质量比为1.20:1～2.25:1。
15.优选的，在步骤2)中，所述两亲性壳聚糖衍生物的具体制备过程如下：
16.取一份的水溶性壳聚糖衍生物溶于异丙醇溶液中，缓慢滴加1.20～2.25份步骤1)制备的环氧长链烷基季铵盐，待搅拌均匀后，置于50℃，一边搅拌一边缓慢滴加42％的氢氧化钠，滴加完成后继续搅拌反应24h。
17.优选的，在步骤3)中，所述两亲性壳聚糖衍生物浓度为0.323％～0.968％。
18.优选的，在步骤3)中，所述油相为肉豆蔻酸异丙酯ipm、油酸乙酯、油酸、棕榈酸乙基己酯、乙酸乙酯中的一种。
19.优选的，在步骤3)中，所述助表面活性剂为乙醇、丙三醇、丁二醇中的一种。
20.本发明也提供了一种由上述方法制备得到的载姜黄素的壳聚糖微乳，用于姜黄素经皮给药。
21.本发明与现有技术相比，具有如下优点与有益效果：
22.本发明通过对壳聚糖进行两亲修饰后结合微乳技术，制备了可以用于姜黄素经皮给药的壳聚糖微乳，能够高效包载姜黄素并促进姜黄素的皮肤渗透性。与传统经皮给药技术相比，该壳聚糖微乳具有以下优势：1、提高难溶药物的溶解性，实现难溶药物的负载；2、避免使用传统表面活性剂，可以减少对皮肤刺激，提高负载药物的稳定性；3、稳定且小的纳米尺寸，利于实际应用时的存放；4、高效的皮肤渗透性，可以明显地提高药物经皮渗透性。综上所述，本发明的壳聚糖微乳解决了姜黄素溶解度低、稳定性差、透皮能力弱的缺点，为经皮给药提供了新的参考方案，值得推广。
附图说明
23.图1为本发明壳聚糖微乳包载姜黄素后的离体透皮结果图。
24.图2为实施例1中所得到的两亲性壳聚糖衍生物的结构验证红外光谱图。
25.图3为实施例2中所得到的壳聚糖微乳伪三元相图。
26.图4为实施例2中所得到的壳聚糖微乳的形貌验证的透射电镜图。
27.图5为实施例3中所得到的壳聚糖微乳以及包载姜黄素的壳聚糖微乳的粒径分布以及光学照片。
28.图6、7为实施例3中所得到的壳聚糖微乳以及包载姜黄素的壳聚糖微乳的稳定性验证图。
29.图8为实施例3中姜黄素在壳聚糖微乳中的光稳定性验证图。
30.图9为实施例4中所得到包载姜黄素的壳聚糖微乳的离体透皮结果图。
31.图10为实施例4中所得到包载姜黄素的壳聚糖微乳离体透皮可视化结果。
具体实施方式
32.下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
33.实施例1
34.1)0.4ml的环氧氯丙烷和1ml的n，n-二甲基正十二胺放置在水浴锅中，升温至50℃，搅拌反应2h，制备得到环氧长链烷基季铵盐；
35.2)取5ml的异丙醇加入到15ml的去离子水中，搅拌均匀，得到异丙醇溶液。取1g羧甲基壳聚糖加入异丙醇溶液中，室温搅拌均匀得到壳聚糖溶液；
36.3)将步骤1)制备得到的环氧长链烷基季铵盐缓慢滴加至步骤2)的壳聚糖溶液中，边滴加边搅拌，直至混合物搅拌均匀；
37.4)取1.45g的氢氧化钠溶于2ml的去离子水，搅拌均匀，得到氢氧化钠溶液，将氢氧化钠溶液缓慢滴加至步骤3)的混合物中，边滴加边搅拌，滴加完成后，将混合物在50℃水浴锅中保持搅拌反应24h，产物用去离子水透析3天后，冻干即可得到两亲性壳聚糖衍生物；
38.5)取100mg的两亲性壳聚糖衍生物溶于15.5g的去离子水中，搅拌溶解均匀，得到两亲性壳聚糖衍生物溶液，取1.5g两亲性壳聚糖衍生物溶液于西林瓶中，加入1.5g的油酸搅拌均匀，滴加乙醇直至溶液由浑浊变澄清，即得粗微乳溶液；
39.6)将步骤5)制备粗微乳溶液超声10min后，用0.45μm的滤膜过滤，即得到壳聚糖微乳；
40.7)取1ml制备得到的壳聚糖微乳，加入1mg的姜黄素。室温搅拌至姜黄素完全溶解，即得到包载姜黄素的壳聚糖微乳。
41.本实例所制备的两亲性壳聚糖衍生物的红外光谱图如2所示。与羧甲基壳聚糖对比，两亲性壳聚糖衍生物在2919cm-1
、2850cm-1
、1467cm-1
、721cm-1
出现新的吸收峰，归因于季铵盐的甲基和长碳链。这证明长链疏水基团已成功引入壳聚糖骨架。同时，1590cm-1
和1420cm-1
附近的强吸收峰代表-coo-的不对称和对称拉伸，这表明壳聚糖骨架上存在亲水羧甲基基团。证明了两亲性壳聚糖衍生物的成功合成。
42.实施例2
43.1)0.4ml的环氧氯丙烷和1ml的n，n-二甲基正十八胺放置在水浴锅中，升温至50℃，搅拌反应2h，制备得到环氧长链烷基季铵盐；
44.2)取5ml的异丙醇加入到15ml的去离子水中，搅拌均匀，得到异丙醇溶液，取1g羧甲基壳聚糖加入异丙醇溶液中，室温搅拌均匀得到壳聚糖溶液；
45.3)将步骤1)制备得到的环氧长链烷基季铵盐缓慢滴加至步骤2)的壳聚糖溶液中，边滴加边搅拌，直至混合物搅拌均匀；
46.4)取1.45g的氢氧化钠溶于2ml的去离子水，搅拌均匀，得到氢氧化钠溶液，将氢氧化钠溶液缓慢滴加至步骤3)的混合物中，边滴加边搅拌。滴加完成后，将混合物在50℃水浴锅中保持搅拌反应24h。产物用去离子水透析3天后，冻干即可得到两亲性壳聚糖衍生物；
47.5)取50mg的两亲性壳聚糖衍生物溶于15.5g的去离子水中，搅拌溶解均匀，得到两亲性壳聚糖衍生物溶液，取1.5g两亲性壳聚糖衍生物溶液于西林瓶中，加入1.5g的油酸搅拌均匀，滴加乙醇直至溶液由浑浊变澄清，即得粗微乳溶液；
48.6)将步骤5)制备粗微乳溶液超声10min后，用0.45μm的滤膜过滤，即得到壳聚糖微
乳；
49.7)取1ml制备得到的壳聚糖微乳，加入1mg的姜黄素。室温搅拌至姜黄素完全溶解，即得到包载姜黄素的壳聚糖微乳。
50.本实例中制备微乳的伪三元相图如图3所示，阴影部分为多相区，非阴影部分为单相微乳区。该实例中，微乳区面积约占三相图总面积的69％。步骤4)所选择的各组分比例位于微乳区。所制备微乳经过磷钨酸负染色后，透射电镜观察结果如图4所示。
51.实施例3
52.1)0.4ml的环氧氯丙烷和1ml的n，n-二甲基正十八胺放置在水浴锅中，升温至50℃，搅拌反应2h，制备得到环氧长链烷基季铵盐；
53.2)取5ml的异丙醇加入到15ml的去离子水中，搅拌均匀，得到异丙醇溶液，取1g羧甲基壳聚糖加入异丙醇溶液中，室温搅拌均匀得到壳聚糖溶液；
54.3)将步骤1)制备得到的环氧长链烷基季铵盐缓慢滴加至步骤2)的壳聚糖溶液中，边滴加边搅拌，直至混合物搅拌均匀；
55.4)取1.45g的氢氧化钠溶于2ml的去离子水，搅拌均匀，得到氢氧化钠溶液。将氢氧化钠溶液缓慢滴加至步骤3)的混合物中，边滴加边搅拌。滴加完成后，将混合物在50℃水浴锅中保持搅拌反应24h。产物用去离子水透析3天后，冻干即可得到两亲性壳聚糖衍生物；
56.5)取150mg的两亲性壳聚糖衍生物溶于15.5g的去离子水中，搅拌溶解均匀，得到两亲性壳聚糖衍生物溶液。取1.5g两亲性壳聚糖衍生物溶液于西林瓶中，加入1.5g的油酸搅拌均匀，滴加乙醇直至溶液由浑浊变澄清，即得粗微乳溶液；
57.6)将步骤5)制备粗微乳溶液超声10min后，用0.45μm的滤膜过滤，即得到壳聚糖微乳；
58.7)取1ml制备得到的壳聚糖微乳，加入0.1mg的姜黄素。室温搅拌至姜黄素完全溶解，即得到包载姜黄素的壳聚糖微乳。
59.本实例中制备的壳聚糖微乳以及包载姜黄素的微乳的粒径分布以及光学照片如图5所示。载药前后，微乳均具有较小的粒径，约为12nm。这有利于微乳通过毛囊、汗腺等皮肤附属器的方式渗入到皮肤下层，实现经皮给药的应用。该微乳同样具有较好的稳定性。将微乳静置30天，并对微乳粒径以及多分散指数进行测量，结果如图6、7所示。放置30天后，微乳尺寸变化不大，依旧保持在较小尺寸。多分散指数经过3本天后，明显缩小，说明微乳尺寸更加均一。将此实施例制备得到的包载姜黄素的壳聚糖微乳暴露在光照下24h，通过紫外分光光度计验证姜黄素的光稳定性。其结果如图8所示，相比于对照例(姜黄素的乙醇溶液)，本实施例中姜黄素的稳定性得到明显提升。
60.实施例4
61.1)0.4ml的环氧氯丙烷和1ml的n，n-二甲基正十二胺放置在水浴锅中，升温至50℃，搅拌反应2h，制备得到环氧长链烷基季铵盐；
62.2)取5ml的异丙醇加入到15ml的去离子水中，搅拌均匀，得到异丙醇溶液。取1g羧甲基壳聚糖加入异丙醇溶液中，室温搅拌均匀得到壳聚糖溶液；
63.3)将步骤1)制备得到的环氧长链烷基季铵盐缓慢滴加至步骤2)的壳聚糖溶液中，边滴加边搅拌，直至混合物搅拌均匀；
64.4)取1.45g的氢氧化钠溶于2ml的去离子水，搅拌均匀，得到氢氧化钠溶液。将氢氧
化钠溶液缓慢滴加至步骤3)的混合物中，边滴加边搅拌。滴加完成后，将混合物在50℃水浴锅中保持搅拌反应24h。产物用去离子水透析3天后，冻干即可得到两亲性壳聚糖衍生物；
65.5)取100mg的两亲性壳聚糖衍生物溶于15.5g的去离子水中，搅拌溶解均匀，得到两亲性壳聚糖衍生物溶液。取1.5g两亲性壳聚糖衍生物溶液于西林瓶中，加入1.5g的油酸搅拌均匀，滴加乙醇直至溶液由浑浊变澄清，即得粗微乳溶液；
66.6)将步骤5)制备粗微乳溶液超声10min后，用0.45μm的滤膜过滤，即得到壳聚糖微乳；
67.7)取1ml制备得到的壳聚糖微乳，加入3.5mg的姜黄素。室温搅拌至姜黄素完全溶解，即得到包载姜黄素的壳聚糖微乳。
68.将步骤7)制备的包载姜黄素的壳聚糖微乳放置在franz扩散池的供体池，将含0.5％吐温-20的pbs溶液作为释放介质放置在受体池中。取sd大鼠腹部皮肤放置在供体池与受体池间进行离体透皮实验。通过测定释放介质中和大鼠皮肤内部姜黄素的含量，评估壳聚糖微乳的经皮给药前景。采用姜黄素的乙醇溶液作为对照组。
69.本实施例的离体透皮结果以及皮肤内部姜黄素残留量如图1、9所示，可以看出，本发明所制备的两亲性壳聚糖衍生物微乳可以有效促进姜黄素的透皮过程。累计透皮量相比于对照组有显著增加。24h后，施加微乳组的大鼠皮肤内部有大量姜黄素残留，这有利于后续持续给药。为了对姜黄素的透皮过程进行可视化，我们将透皮1h,3h后的大鼠皮肤经过冷冻切片后，用荧光显微镜观察姜黄素的分布，结果如图10所示。与对照例相比，本发明所制备的包载姜黄素的壳聚糖微乳荧光强度明显较强，说明本发明能够有效促进药物的透皮过程，在经皮给药领域具有非常广阔的应用前景。
70.本发明的实施例仅仅是为清楚地说明本发明所举的例子，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的专业人员而言，在上述实施例的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明权力要求的保护范围之内。