一种流式荧光定量检测冻干试剂及试剂盒的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种流式荧光定量检测冻干试剂及试剂盒。


背景技术：

2.目前，通常所使用的免疫学定量检测方法有：elisa(酶联免疫吸附剂测定)、化学发光、流式荧光法，以上方法均包含两个部分，即免疫反应系统和光学分析系统。免疫检测系统是通过特异结合目标分子的捕获抗体形成抗原-抗体复合物，被标记的抗原或抗体与抗原-抗体复合物进行竞争性结合或者形成标记抗体抗原-抗体三元复合物，通过标记物质自身的光学信号或者产生的化学反应信号来进行准确的定性和定量检测。
3.基于荧光编码微球的流式检测技术是将捕获抗体通过氨基、羧基、羟基等方式偶联到带有荧光的聚苯乙烯微球上，不同尺寸和荧光强度的聚苯乙烯微球偶联有不同的捕获分子，这些分子可特异的与目标分子进行结合，当带有荧光标记的报告分子与捕获微球和待测分子形成复合物后，通过特定波长的激发光激发就可以对一个样本中的多种目标物质进行准确的定量检测。
4.现有的检测试剂盒一般是将捕获微球、检测抗体独立保存在液态环境中，在使用的时候通过震荡混匀的方式定量的加入到检测孔中。但这种液态试剂存在如下缺点：1、需要冷链保存和运输，增加了使用成本；2、液体试剂在低温环境下容易结冰导致试剂出现反复冻融的情况，反复冻融试剂中的蛋白质成分有较大影响，影响试剂的质量；同时，由于捕获微球和检测抗体独立保存，使用时需要反复开瓶取样、加样，容易滋生细菌受到污染，并且每次加样操作带来的加样误差影响检测的准确性。
5.为了解决上述问题，目前已有对微球或偶联有配体的捕获微球进行冻干保存的研究。例如专利申请cn111110638a报道了一种偶联有蛋白的微球冻干制剂及其制备方法、保存方式，采用了特定组成的冻干保护剂与偶联有蛋白的捕获微球一起进行冻干，提高了微球的稳定性。但是，其同样只解决了免疫检测试剂中的微球这一个组分的保存问题，依然难以解决避免试剂加样过程中的污染、人为误差和效率问题。
6.将捕获微球、检测抗体实现混合保存无疑可以有效避免人为操作的污染和误差，但是，冻干过程可能导致检测抗体失活或者荧光基团不稳定，导致检测时荧光信号出现衰减，无法实现准确的检测。但目前对于检测抗体进行冻干和稳定性保护的技术目前还鲜有报道。
7.因此，研发可常温保存、稳定性好的免疫学定量检测冻干试剂具有重要的意义。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供一种可常温保存、稳定性好的免疫学定量检测冻干试剂，冻干的捕获微球和报告分子均可预先混合，避免了加样过程中的污染和误差，提高了检测效率。
9.本发明提供了一种冻干保护剂，它由如下组分组成：
10.海藻糖1％～30％w/v、甘露醇1％～25％w/v、动物血清白蛋白0.01％～1％w/v、表面活性剂0.01％～1％v/v、防腐剂0.01％～0.5％v/v，余量为缓冲液；
11.所述缓冲液为0.01～0.1mol/l的磷酸缓冲液、hepes缓冲液或tris缓冲液；所述缓冲液的ph为6.5～7.5。
12.进一步地，上述动物血清白蛋白是牛血清白蛋白、羊血清白蛋白、驴血清白蛋白、马血清白蛋白、兔血清白蛋白、猪血清白蛋白或鸡血清白蛋白，优选为牛血清白蛋白；
13.所述表面活性剂为吐温20；
14.所述防腐剂为叠氮钠或proclin 300，所述防腐剂的用量为叠氮钠0.01％～0.05％v/v或proclin 300 0.03％～0.5％v/v。
15.本发明还提供了一种用于免疫学定量检测的试剂，它由如下两种组分组成：
16.组分a：权利要求1或2所述的冻干保护剂；
17.组分b：检测微球和/或报告分子；
18.所述检测微球是：一种或多种偶联有捕获抗体的聚苯乙烯微球；所述聚苯乙烯微球为聚苯乙烯荧光微球、磁性聚苯乙烯微球或磁性聚苯乙烯荧光微球；
19.所述报告分子是：一种或多种与所述捕获抗体对应的荧光标记二抗；所述荧光标记是：荧光基团直接连接二抗标记，或荧光基团通过生物素-链霉亲和素复合物连接二抗标记；
20.优选地，所述聚苯乙烯荧光微球的荧光基团激发波长是633nm
±
10nm，所述荧光标记二抗的荧光基团的激发波长为488nm
±
10nm；
21.更优选地，所述荧光标记二抗的荧光基团是：r-藻红蛋白(r-pe)、r-藻红蛋白标记链霉亲和素(pe-sa)或异硫氰酸荧光素(fitc)。
22.进一步地，上述试剂中每种检测微球的个数为50～100000个/测试(50～100000个/ml)，和/或每种报告分子的浓度为0.01～10μg/ml。
23.进一步地，上述组分b为检测微球和报告分子。
24.进一步地，上述多种偶联有捕获抗体的聚苯乙烯微球等量混合。
25.本发明还提供一种免疫学定量检测冻干试剂，它是将上述的试剂冻干所得。
26.进一步地，上述冻干包括如下冻干程序：
27.预冷冻：温度-60～-50℃，真空压力0～10pa，时间60～300min；
28.升华干燥：温度-50～-10℃，真空压力0～20pa，时间600～1500min；
29.解析干燥：温度0～30℃，真空压力0～20pa，时间180～420min。
30.优选为：
31.预冷冻：温度-50℃，真空压力1pa，时间60～300min；
32.升华干燥：温度-45℃，真空压力5pa，时间600～1500min；
33.解析干燥：温度30℃，真空压力5pa，时间180～420min。
34.本发明还提供一种免疫学定量检测试剂盒，它包括上述的冻干试剂。
35.进一步地，它还包括冻干复溶液，所述冻干复溶液由如下组分组成：动物血清白蛋白0.01％～1％w/v，表面活性剂0.01％～1％v/v、防腐剂0.03～0.5％v/v，余量为0.01～0.1mol/l的磷酸缓冲液。
36.更进一步地，上述冻干复溶液中的动物血清白蛋白是牛血清白蛋白、羊血清白蛋
白、驴血清白蛋白、马血清白蛋白、兔血清白蛋白、猪血清白蛋白或鸡血清白蛋白，优选为牛血清白蛋白；
37.所述表面活性剂为吐温20；
38.所述防腐剂为叠氮钠或proclin 300，优选为proclin 300。
39.本发明还提供了上述冻干试剂的制备方法，包括将上述用于免疫学定量检测的试剂进行冻干的步骤。
40.进一步地，上述冻干包括如下冻干程序：
41.预冷冻：温度-60～-50℃，真空压力0～10pa，时间60～300min；
42.升华干燥：温度-50～-10℃，真空压力0～20pa，时间600～1500min；
43.解析干燥：温度0～30℃，真空压力0～20pa，时间180～420min。
44.优选为：
45.预冷冻：温度-50℃，真空压力1pa，时间60～300min；
46.升华干燥：温度-45℃，真空压力5pa，时间600～1500min；
47.解析干燥：温度30℃，真空压力5pa，时间180～420min。
48.本发明还提供了上述的冻干试剂或试剂盒在免疫学定量检测试剂中的应用。
49.进一步地，上述免疫学定量检测试剂是流式多因子检测试剂。
50.本发明还提供了上述检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
51.(1)取所述冻干试剂，加入待测生物样本得到待测体系，待测体系中每种捕获微球的数量为50～100000个，每种报告分子的浓度为0.01～10μg/ml；
52.(2)使用流式细胞仪检测，所述流式细胞仪配置有488nm激光器；
53.优选地，步骤(1)所述冻干试剂先加入冻干复溶液复溶后，再加入待测生物样本；和/或步骤(2)的流式细胞仪选配633nm
±
10nm激光器、405nm
±
10nm激光器、375nm
±
10nm激光器。更优选地，所述待测生物样本为血清、血浆等。
54.本发明的有益效果：本发明提供的冻干保护剂可以对捕获微球和报告分子两种组分实现冻干保护，因此，可以将捕获微球和报告分子预先混合后冻干，或者在本发明冻干保护剂的保护下分别冻干后混合，得到比例精确的捕获微球和报告分子的混合冻干制剂，在使用时，无需进行多次加样混合，减少了使用时操作的步骤，避免了混合不均匀、和人工加样带来的系统误差，节约了时间，提高了效率；而且，本发明冻干制剂以固态形式保存，试剂盒可以实现常温保存，避免低温和冷链保存运输过程中成本的增加和温度对试剂造成的影响。
55.说明：本发明所述的“组分b：检测微球和/或报告分子”是指：组分b可以是检测微球、报告分子或者是检测微球和报告分子的混合物。基于此，本发明的冻干试剂可以是一种或多种检测微球与冻干保护剂混合后冻干所得的试剂，或者是一种或多种报告分子与冻干保护剂混合后冻干所得的试剂，或者是一种或多种报告分子与对应的一种或多种检测微球混合，再与冻干保护剂混合后进行冻干所得的试剂。本发明的冻干试剂还可以是将冻干后的报告分子与冻干后的检测微球进行混合得到的。
56.本发明的试剂、冻干试剂或试剂盒中的检测微球只有一种时，对应的报告分子也只有一种，其只适用于一种因子的检测。当本发明的试剂、冻干试剂或试剂盒中的检测微球有多种时，对应的报告分子也有多种，其适用于多种因子的检测，例如流式多因子检测。
12p70、tnf-α、ifn-α、ifn-γ抗体的聚苯乙烯荧光微球。
78.报告分子：异硫氰酸荧光素-链霉素-生物素标记的il-1β、il-2、il-4、il-5、il-6、il-8、il-10、il-17a、il-17f、il-12p70、tnf-α、ifn-α、ifn-γ二抗。
79.制备方法：
80.等量取上述多种检测微球和一定量的上述多种报告分子，加上述冻干保护剂混合均匀，混匀后的体系中，每种报告分子的浓度为0.1μg/ml，每种检测目标物的捕获微球的数量为20000个/ml。将微球和报告分子的混合液在液氮中速冻成冰球，每个冰球50ul。
81.冰球进一步按照如下冻干程序进行冻干，即得。
82.冻干阶段温度(℃)持续时间(min)真空(pa)预冷冻-60～-50600.1升华干燥-50～-106000.1解析干燥0～301800.1
83.也可以取检测微球、报告分子分别加入冻干保护剂，按照上述顺序分别冻干后，将两种组分再混合到一起。
84.本实施例制得的冻干试剂可用于对il-1β、il-2、il-4、il-5、il-6、il-8、il-10、il-17a、il-17f、il-12p70、tnf-α、ifn-α、ifn-γ的流式多因子检测。
85.实施例3、本发明冻干试剂的制备
86.原料如下：
87.冻干保护剂：海藻糖30％w/v、甘露醇25％w/v、牛血清白蛋白1％w/v、吐温20 1％v/v、proclin300 0.5％v/v，余量为缓冲液，缓冲液为tris缓冲液，ph为6.5。
88.检测微球：偶联了il-1β、il-2、il-4、il-5、il-6、il-8、il-10、il-17a、il-17f、il-12p70、tnf-α、ifn-α、ifn-γ抗体的聚苯乙烯荧光微球。
89.报告分子：异硫氰酸荧光素-链霉素-生物素标记的il-1β、il-2、il-4、il-5、il-6、il-8、il-10、il-17a、il-17f、il-12p70、tnf-α、ifn-α、ifn-γ二抗。
90.制备方法：
91.等量取上述多种检测微球并且等量取上述多种报告分子，加上述冻干保护剂混合均匀，混匀后的体系中，报告分子的浓度10μg/ml，每种检测目标物的捕获微球的数量为100000个/ml。将微球和报告分子的混合液在液氮中速冻成冰球，每个冰球50ul。
92.混匀后的体系进一步按照如下冻干程序进行冻干，即得。
93.冻干阶段温度(℃)持续时间(min)真空(pa)预冷冻-60～-5030010升华干燥-50～-10150020解析干燥0～3042020
94.也可以取检测微球、报告分子分别加入冻干保护剂，按照上述顺序分别冻干后，再混合到一起。
95.本实施例制得的冻干试剂可用于对il-1β、il-2、il-4、il-5、il-6、il-8、il-10、il-17a、il-17f、il-12p70、tnf-α、ifn-α、ifn-γ的流式多因子检测。
96.实施例4、本发明冻干试剂的制备
97.原料如下：
98.冻干保护剂：海藻糖1％w/v、甘露醇1％w/v、牛血清白蛋白0.01％w/v、吐温20 0.01％v/v、叠氮钠0.01％v/v，余量为缓冲液，缓冲液为hepes缓冲液，ph为7.5。
99.检测微球：偶联了il-1β、il-2、il-4、il-5、il-6、il-8、il-10、il-17a、il-17f、il-12p70、tnf-α、ifn-α、ifn-γ抗体的聚苯乙烯荧光微球。
100.报告分子：r-藻红蛋白(r-pe)标记的il-1β、il-2、il-4、il-5、il-6、il-8、il-10、il-17a、il-17f、il-12p70、tnf-α、ifn-α、ifn-γ二抗。
101.制备方法：
102.等量取上述多种检测微球和一定量的上述多种报告分子，加上述冻干保护剂混合均匀，混匀后的体系中，每种报告分子的浓度为0.1μg/ml，每种检测微球的浓度为20000个/ml。将微球和报告分子的混合液在液氮中速冻成冰球，每个冰球50ul。
103.冰球进一步按照如下冻干程序进行冻干，即得。
104.冻干阶段温度(℃)持续时间(min)真空(pa)预冷冻-60～-50600.1升华干燥-50～-106000.1解析干燥0～301800.1
105.也可以取检测微球、报告分子分别加入冻干保护剂，按照上述顺序分别冻干后，再将两种组分混合到一起。
106.本实施例制得的冻干试剂可用于对il-1β、il-2、il-4、il-5、il-6、il-8、il-10、il-17a、il-17f、il-12p70、tnf-α、ifn-α、ifn-γ的流式多因子检测。
107.实施例5、本发明检测试剂盒
108.检测试剂盒有如下组分：
109.实施例1的冻干试剂和冻干复溶液。冻干复溶液组成为：0.15mol/l的磷酸缓冲液、牛血清白蛋白0.05％w/v、表面活性剂tween20 0.01％v/v、proclin300 0.05％v/v。
110.使用时，直接向冻干试剂中加入血清、血浆或其他生物样本，实现一次加样完成检测，无需将微球和检测抗体分开加样。也可以使用定量的冻干复溶液(10～100μl)溶解冻干试剂后再加入样本进行反应。
111.本试剂盒所使用的流式细胞仪为必须配置有488nm激光器(
±
10nm)选配633nm激光器(
±
10nm)、405nm激光器(
±
10nm)、375nm激光器(
±
10nm)。
112.对比例1、
113.原料如下：
114.冻干保护剂：海藻糖0.5％w/v、甘露醇0.5％w/v、牛血清白蛋白2％w/v、吐温20 0.5％v/v、proclin300 0.01％v/v，余量为缓冲液，缓冲液为0.15mol/l的磷酸盐缓冲液，ph为7.0。
115.检测微球：偶联了il-1β、il-2、il-4、il-5、il-6、il-8、il-10、il-17a、il-17f、il-12p70、tnf-α、ifn-α、ifn-γ抗体的聚苯乙烯荧光微球，
116.报告分子：异硫氰酸荧光素-链霉素-生物素标记的il-1β、il-2、il-4、il-5、il-6、il-8、il-10、il-17a、il-17f、il-12p70、tnf-α、ifn-α、ifn-γ二抗。
117.制备方法：
118.等量取上述多种检测微球并且等量取上述多种报告分子，加上述冻干保护剂混合
均匀，混匀后的体系中，每种报告分子的浓度为2μg/ml，每种检测微球的浓度为20000个/ml。将微球和报告分子的混合液在液氮中速冻成冰球,每个冰球50ul。
119.混匀后的体系进一步按照如下冻干程序进行冻干，即得。
120.冻干阶段温度(℃)持续时间(min)真空(pa)预冷冻-50～-453005升华干燥-45～-109005解析干燥0～303000.1
121.对比例2、
122.原料如下：
123.冻干保护剂：同实施例1。
124.检测微球：偶联了il-1β、il-2、il-4、il-5、il-6、il-8、il-10、il-17a、il-17f、il-12p70、tnf-α、ifn-α、ifn-γ抗体的聚苯乙烯荧光微球，
125.报告分子：异硫氰酸荧光素-链霉素-生物素标记的il-1β、il-2、il-4、il-5、il-6、il-8、il-10、il-17a、il-17f、il-12p70、tnf-α、ifn-α、ifn-γ二抗。
126.制备方法：
127.等量取上述多种检测微球并且等量取上述多种报告分子，加上述冻干保护剂混合均匀，混匀后的体系中，每种报告分子的浓度为2μg/ml，每种检测微球的浓度为20000个/ml。将微球和报告分子的混合液在液氮中速冻成冰球,每个冰球50ul。
128.混匀后的体系进一步按照如下冻干程序程序进行冻干，即得。
129.冻干阶段温度(℃)持续时间(min)真空(pa)预冷冻-50～-453005升华干燥-45～-109005解析干燥0～303000.1
130.对比例3、
131.原料如下：
132.冻干保护剂：海藻糖0.5％w/v、甘露醇0.5％w/v、牛血清白蛋白2％w/v、吐温20 0.5％v/v、proclin300 0.01％v/v，余量为缓冲液，缓冲液为0.15mol/l的磷酸盐缓冲液，ph为7.0。
133.检测微球：偶联了il-1β、il-2、il-4、il-5、il-6、il-8、il-10、il-17a、il-17f、il-12p70、tnf-α、ifn-α、ifn-γ抗体的聚苯乙烯荧光微球，
134.报告分子：异硫氰酸荧光素-链霉素-生物素标记的il-1β、il-2、il-4、il-5、il-6、il-8、il-10、il-17a、il-17f、il-12p70、tnf-α、ifn-α、ifn-γ二抗。
135.制备方法：
136.等量取上述多种检测微球并且等量取上述多种报告分子，加上述冻干保护剂混合均匀，混匀后的体系中，每种报告分子的浓度为2μg/ml，每种检测微球的浓度为20000个/ml。将微球和报告分子的混合液在液氮中速冻成冰球,每个冰球50ul。
137.混匀后的体系进一步按照实施例1的冻干程序程序进行冻干，即得。
138.以下通过实验例证明本发明的有益效果。
139.实验例1、冻干后形态稳定性测试
140.1、实验方法
141.低温保存：将本发明实施例1制备的冻干试剂、对比例1制备的冻干试剂在4～8℃放置12个月，观察形态变化。
142.室温保存：将本发明实施例1制备的冻干试剂、对比例1制备的冻干试剂在25℃放置12个月，观察形态变化。
143.低温与室温交叉保存：将本发明实施例1制备的冻干试剂-20℃放置1天后转入25℃放置一天持续30天交叉保存。
144.2、实验结果
145.低温保存结果如图1所示，左侧为实施例1的冻干工艺和冻干缓冲液配方制备的冻干制剂，右侧为对比例1的冻干工艺和冻干缓冲液配方制备的冻干制剂，可见对比例1的冻干制剂出现了一定的皱缩，实施例冻干制剂的形态无明显变化，稳定性佳。
146.室温保存结果如图2所示，左侧为实施例1的冻干工艺和冻干缓冲液配方制备的冻干制剂，右侧为对比例1的冻干工艺和冻干缓冲液配方制备的冻干制剂，可见对比例1的冻干制剂出现了一定的皱缩，实施例冻干制剂的形态无明显变化，稳定性佳。
147.实施例1的冻干试剂低温与室温交叉保存结果如图3所示，左图为放置前初始状态，右图为30天后的状态，可见，冻干制剂的形态无明显变化，稳定性佳。
148.实验例2、检测准确性及稳定性测试
149.1、实验方法
150.(1)实施例1、对比例1的冻干制剂分别加入il-1β、il-2、il-4、il-5、il-6、il-8、il-10、il-17a、il-17f、il-12p70、tnf-α、ifn-α、ifn-γ标准品(浓度均为2000pg/ml)室温下反应1.5小时后，加入sa-pe染色20分钟，然后用流式细胞仪检测，根据流式细胞仪得到各因子的测试值。实验结果如表1、表2所示。
151.(2)实施例1的制剂在冻干前、冻干后分别加入血清样本室温下反应1.5小时后加入sa-pe染色20分钟，然后用流式细胞仪检测，根据流式细胞仪得到各因子的测试值。实验结果如表2所示。
152.(3)实施例1的冻干制剂与其在低温与室温交叉保存30天后的制剂，分别加入il-1β、il-2、il-4、il-5、il-6、il-8、il-10、il-17a、il-17f、il-12p70、tnf-α、ifn-α、ifn-γ标准品(浓度均为2000pg/ml)室温下反应1.5小时后加入sa-pe染色20分钟，然后用流式细胞仪检测，根据流式细胞仪得到各因子的测试值。实验结果如表3所示。
153.2、实验结果
154.(1)所有指标的线性相关系数r≥99.0％，偏倚百分比≤15.0％。如表1所示：
155.表1、实施例1的冻干试剂检测结果
[0156][0157]
可以看出本发明冻干试剂荧光不出现明显衰减，检测准确。
[0158]
表2、对比例1的检测结果
[0159][0160]
从上表可以看出对标准品进行检测时，对比例的荧光衰减13.94％～55.27％，检测准确度低。对比例2、对比例3的结果与对比例1相似，荧光均出现明显衰减，检测准确度低。
[0161]
以上结果说明：本发明特定冻干保护剂、特定冻干程序下制得的冻干试剂能够应用于流式多因子检测，准确定量检测多种因子。
[0162]
(2)所有指标的偏倚百分比≤15.0％。如表3所示：
[0163]
表3、实施例1的试剂冻干前、后检测结果
[0164][0165]
上述结果表明：使用本发明特定的冻干保护剂，在特定的冻干程序下制得的冻干制剂，检测准确性不受冻干过程影响，稳定性好，能够应用于流式多因子检测，准确定量检测多种因子。
[0166]
(3)所有指标的偏倚百分比≤5.0％，如表4所示：
[0167]
表4、实施例1的试剂在低温与室温交叉保存30天后的检测结果
[0168][0169]
上述结果说明，本发明的特定的冻干保护剂，在特定的冻干程序下制得的冻干制剂保存稳定性好，在变化的温度条件下保存30天，其检测准确性也不受影响。
[0170]
综上，本发明提供了一种冻干保护剂，可以对检测微球、报告分子抗体实现冻干保护，因此捕获微球和报告分子均可以预先混合冻干或分别冻干后预混合得到比例精确的免疫学定量检测冻干试剂，该冻干试剂可常温保存、稳定性好，并且避免了加样过程中的污染和误差，提高了检测效率，具有优异的推广应用前景。