一种复层人工硬脑膜的制备方法与流程

1.本发明属于硬脑膜技术领域，具体涉及一种复层人工硬脑膜的制备方法。


背景技术：

2.硬脑膜是介于颅骨和脑组织之间的膜性组织，是脑组织的一道重要的防护膜。创伤、炎症、肿瘤侵蚀及手术操作等均能造成硬脑膜损伤，破坏其完整性。因此硬脑膜修复是颅部手术中重要一步，可较好保持硬脑膜的完整性和防止脑脊液渗漏。
3.目前临床上所用到的硬脑膜产品中，脱细胞基质类的产品通常为猪腹膜、羊腹膜、牛心包原材料等通过脱细胞技术处理制成的。这些材料与硬膜结构相似，有助于恢复正常的生理解剖结构。但是这些材料存在细胞残留、免疫排斥反应，病毒感染，保存及使用步骤繁琐等缺点。
4.胶原蛋白海绵类产品以动物组织提取的ⅰ型胶原蛋白为原料，经冷冻干燥工艺制成，是一类已经在临床成功应用数十年的人工硬脑膜产品，具有优良的诱导组织再生能力。此类产品在使用中的主要问题为缝合性能、抗降解性能及防渗漏性能不佳。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种制备工艺简单，可工业化的专用于经鼻蝶入路颅底重建手术的生物膜制备方法，以解决现有硬脑膜产品防渗漏性能以及回弹性能方面的问题。
6.为实现本发明的上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.一种复层人工硬脑膜的制备方法，包括如下步骤：
8.(1)配制硫酸软骨素钠和胶原蛋白的醋酸溶液，搅拌使溶解或溶胀均匀，真空脱泡，得到浆液，备用；
9.(2)依次向冻干盘a、冻干盘b中倒入浆液，先将冻干盘a中的浆液于-20℃条件下预冻8-16h，将冻干盘b中的浆液降温至4-10℃，然后将冻干盘b中的浆液倒入冻干盘a中，-80℃条件下预冻4-8h，得到预冻浆液；
10.(3)将预冻浆液于温度为-45℃～30℃，真空度为0.2bar条件下冷冻干燥26-34h，得到复层人工硬脑膜半成品；
11.(4)将复层人工硬脑膜半成品于温度为95-105℃，真空度为0.08-0.1bar条件下高温真空交联24-72h；
12.(5)灭菌，即得所述的复层人工硬脑膜。
13.优选的，步骤(1)中，所述的浆液中，硫酸软骨素钠的质量体积浓度为0.03-0.1％，胶原蛋白的质量体积浓度为0.3-1.0％，所述的醋酸溶液为0.05m醋酸溶液。
14.优选的，步骤(1)中，所述搅拌为采用均质机以15000-20000r/min的速度搅拌1-2h。
15.优选的，步骤(2)中，向冻干盘a中倒入3～5mm深的浆液，向冻干盘b中倒入1～2mm深的浆液。
16.优选的，步骤(3)中，所述的冷冻干燥包括如下步骤：
17.冷冻阶段，温度：-45～-35℃，时间：15min；
18.第一干燥阶段，温度：-10～-8℃，时间：740～920min，真空度：0.2bar；
19.第二干燥阶段，温度：-13～-10℃，时间：380～460min，真空度：0.2bar；
20.第三干燥阶段，温度：-5～0℃，时间：400～520min，真空度：0.2bar；
21.第四干燥阶段，温度：20～30℃，时间：60～100min，真空度：0.2bar。
22.优选的，步骤(4)中，所述的高温真空交联的温度为105℃，真空度为0.09bar，时间为60h。
23.优选的，步骤(5)中，所述的灭菌为使用环氧乙烷、co-60γ射线辐照、紫外辐照中的至少一种方法进行灭菌。所述的环氧乙烷灭菌包括：环氧乙烷占环氧乙烷和二氧化碳混合气体的比例为40～60％，温度为50～60℃，湿度为20～50％rh，时间为2～5h，换气次数为4～7次。
24.本发明的有益效果为：
25.1、本发明所述的复层人工硬脑膜的制备方法，首次预冻为-20℃条件下预冻8-16h，温度稍高，时间较长，此阶段浆料缓慢冷冻，冰晶生长缓慢，形成较为疏松的结构；二次预冻为-80℃条件下预冻4-8h，温度低，时间短，使得冰晶能迅速生成，形成较为致密的结构。预冻之后，仅需一次冻干，即可得到具有不同致密度的复层人工硬脑膜。本发明提供了一种通过特殊的梯度预冻工艺以及一次冻干获得复层人工硬脑膜的新方法，且最终制备的复层人工硬脑膜在防渗漏性能、抗降解性能以及缝合性能方面均优异。除此以外，电镜下显示，与现有的通过机械压制以及两次冻干工艺获得的复层人工硬脑膜相比，本发明方法制备的复层人工硬脑膜致密层的孔结构短轴更长，孔隙更近似圆形，更有利于细胞迁移及组织生长。
26.2、本发明所述的复层人工硬脑膜的制备方法，对高温真空交联的工艺参数进行了优化，进一步提升了最终制备的硬脑膜的回弹性能。
具体实施方式
27.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
28.以下实施例中，胶原蛋白为牛跟腱中提取的高纯度胶原蛋白，其中i型胶原蛋白占总蛋白含量不小于99％，羟脯氨酸的含量不小于10％。
29.实施例1
30.本实施例提供一种复层人工硬脑膜的制备方法，包括如下步骤：
31.(1)配制硫酸软骨素钠质量体积浓度为0.03％，胶原蛋白质量体积浓度为0.3％的0.05m醋酸溶液，采用均质机18000r/min搅拌2h，真空脱泡，得到浆液，备用；
32.(2)向冻干盘a中倒入3mm深的浆液，向冻干盘b中倒入1mm深的浆液，先将冻干盘a中的浆液于-20℃条件下预冻8h，将冻干盘b中的浆液降温至4℃，然后将冻干盘b中的浆液倒入冻干盘a中，-80℃条件下预冻4h，得到预冻浆液；
33.(3)将预冻浆液置于冻干机中冻干，得到复层人工硬脑膜半成品；所述的冷干包括如下步骤：
34.冷冻阶段，温度：-35℃，时间：15min；
35.第一干燥阶段，温度：-8℃，时间：920min，真空度：0.2bar；
36.第二干燥阶段，温度：-10℃，时间：460min，真空度：0.2bar；
37.第三干燥阶段，温度：-5℃，时间：520min，真空度：0.2bar；
38.第四干燥阶段，温度：20℃，时间：100min，真空度：0.2bar；
39.(4)将复层人工硬脑膜半成品放入真空干燥箱中，于温度为95℃，真空度为0.1bar条件下进行高温真空交联72h；
40.(5)环氧乙烷灭菌，环氧乙烷占环氧乙烷和二氧化碳混合气体的比例为40％，温度为50℃，湿度为20％rh，时间为5h，换气次数为4次，即得所述的复层人工硬脑膜。
41.实施例2
42.本实施例提供一种复层人工硬脑膜的制备方法，包括如下步骤：
43.(1)配制硫酸软骨素钠质量体积浓度为0.1％，胶原蛋白质量体积浓度为1.0％的0.05m醋酸溶液，采用均质机15000r/min搅拌2h，真空脱泡，得到浆液，备用；
44.(2)向冻干盘a中倒入5mm深的浆液，向冻干盘b中倒入2mm深的浆液，先将冻干盘a中的浆液于-20℃条件下预冻16h，将冻干盘b中的浆液降温至10℃，然后将冻干盘b中的浆液倒入冻干盘a中，-80℃条件下预冻8h，得到预冻浆液；
45.(3)将预冻浆液置于冻干机中冻干，得到复层人工硬脑膜半成品；所述的冷干包括如下步骤：
46.冷冻阶段，温度：-45℃，时间：15min；
47.第一干燥阶段，温度：-10℃，时间：740min，真空度：0.2bar；
48.第二干燥阶段，温度：-13℃，时间：380min，真空度：0.2bar；
49.第三干燥阶段，温度：0℃，时间：400min，真空度：0.2bar；
50.第四干燥阶段，温度：30℃，时间：60min，真空度：0.2bar；
51.(4)将复层人工硬脑膜半成品放入真空干燥箱中，于温度为100℃，真空度为0.08bar条件下进行高温真空交联24h；
52.(5)环氧乙烷灭菌，环氧乙烷占环氧乙烷和二氧化碳混合气体的比例为60％，温度为60℃，湿度为50％rh，时间为2h，换气次数为7次，即得所述的复层人工硬脑膜。
53.实施例3
54.本实施例提供一种复层人工硬脑膜的制备方法，包括如下步骤：
55.(1)配制硫酸软骨素钠质量体积浓度为0.05％，胶原蛋白质量体积浓度为0.5％的0.05m醋酸溶液，采用均质机20000r/min搅拌1h，真空脱泡，得到浆液，备用；
56.(2)向冻干盘a中倒入4mm深的浆液，向冻干盘b中倒入2mm深的浆液，先将冻干盘a中的浆液于-20℃条件下预冻10h，将冻干盘b中的浆液降温至5℃，然后将冻干盘b中的浆液倒入冻干盘a中，-80℃条件下预冻6h，得到预冻浆液；
57.(3)将预冻浆液置于冻干机中冻干，得到复层人工硬脑膜半成品；所述的冷干包括如下步骤：
58.冷冻阶段，温度：-40℃，时间：15min；
59.第一干燥阶段，温度：-10℃，时间：800min，真空度：0.2bar；
60.第二干燥阶段，温度：-13℃，时间：410min，真空度：0.2bar；
61.第三干燥阶段，温度：0℃，时间：420min，真空度：0.2bar；
62.第四干燥阶段，温度：30℃，时间：70min，真空度：0.2bar；
63.(4)将复层人工硬脑膜半成品放入真空干燥箱中，于温度为105℃，真空度为0.09bar条件下进行高温真空交联60h；
64.(5)环氧乙烷灭菌，环氧乙烷占环氧乙烷和二氧化碳混合气体的比例为50％，温度为60℃，湿度为30％rh，时间为3h，换气次数为5次，即得所述的复层人工硬脑膜。
65.一、防渗漏性能测试：为了验证本发明方法制备的生物膜的防渗漏效果，在100mm
×
100mm的生物膜样品上缓慢注射一定量生理盐水，记录水滴落的时间，水滴滴落的时长可以间接反应产品的防渗漏性能，见表1。可以看出，本发明各实施例方法制备的生物膜样品在注水量25ml时，滴落时间均大于5min，说明具有较好的防渗漏性能。
66.表1
67.样品注水量(ml)滴落时间(min)实施例1256.3实施例2257.1实施例3256.5
68.二、抗降解性能：按照yy/t 1511-2017中6.8进行可消化性能测试，见表2。
69.表2
70.样品完全消化时间(min)实施例161.4
±
2.1实施例266.3
±
1.7实施例363.8
±
1.3
71.三、缝合强度测试：取样品剪切为15mm
×
15mm的方块，使用医用缝合线从材料中心穿过，一端固定缝线，另一端固定在材料的1/3处，使用拉力机将样品经受1n的静态轴向拉力1min。
72.表3
73.样品拉力(n)实施例12.1
±
0.3实施例22.3
±
0.2实施例32.2
±
0.3
74.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。