促进血管生成的方法
交叉引用
1.本技术要求2019年6月20日提交的美国临时申请号62/864,379的权益，该美国临时申请通过引用并入本文中关于联邦政府资助的研究的声明
2.本发明是在美国政府的支持下由美国国立卫生研究院根据合同编号ro1 ey06819进行的。
技术实现要素：
3.在某些实施方案中，本文公开了促进有需要的个体中血管生成的方法，所述方法包括使包含内皮细胞和周细胞的组织与胎儿支持组织产品接触。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品来自胎盘、胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、羊膜基质、羊膜胶质、羊水或其组合。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品分离自冷冻或先前冷冻的胎儿支持组织。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品是磨碎的、粉碎的、分碎的(morselized)、移植物、薄片、微粉化的、粉末、匀浆或提取物。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品包含脐带羊膜(ucam)。在一些实施方案中，所述ucam还包含华顿氏胶(wharton's jelly)。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品包含脐带，所述脐带基本上不含静脉或动脉。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品包含脐带，所述脐带包含静脉或动脉。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品包含天然hc-ha/ptx3复合物、重构的hc-ha/ptx3(rchc-ha/ptx3)复合物或其组合。在一些实施方案中，所述rchc-ha/ptx3复合物包含高分子量透明质酸(hmw ha)、间-α-抑制剂(iαi)蛋白的重链1(hc1)和重链2(hc2)以及正五聚蛋白3蛋白(ptx3)。在一些实施方案中，所述rchc-ha/ptx3复合物由hmw ha、hc1、hc2和ptx3组成。在一些实施方案中，所述rchc-ha/ptx3复合物由hmw ha、hc1、hc2、ptx3和tsg-6组成。在一些实施方案中，所述天然hc-ha/ptx3复合物来自胎儿支持组织。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品包含药学上可接受的辅料、载体或其组合。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品被配制成非固体剂型。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品被配制成固体剂型。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品被配制成溶液、混悬剂、糊剂、软膏、油乳剂、乳膏、洗剂、凝胶、贴剂、棒状剂、膜剂、涂剂或其组合。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品被配制用于局部施用、通过注射施用、外用施用或吸入。在一些实施方案中，被配制用于外用施用的所述胎儿支持组织产品还包含渗透增强剂、胶凝剂、粘合剂、润肤剂或其组合。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品被配制用于控释。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品被配制成控释颗粒、脂质复合物、脂质体、纳米颗粒、微球、微粒或纳米胶囊。在一些实施方案中，所述组织包括缺血组织。在一些实施方案中，所述组织包括溃疡、创伤、穿孔、烧伤、手术、损伤或瘘管。在一些实施方案中，所述方法防止组织坏死。在一些实施方案中，所述方法还包括在接触步骤之前选择具有包含内皮细胞和周细胞的组织的个体。在一些实施方案中，选择包括检测所述组织中的周细胞标志物。在一些实施方案中，所述周细胞标志物是flk-1、cd34、cd31、α-sma、pdgfrβ、ng2或其组合。
4.在某些实施方案中，本文公开了治疗有需要的个体的缺血性病况的方法，所述方法包括使缺血组织与胎儿支持组织产品接触。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品来自胎盘、胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、羊膜基质、羊膜胶质、羊水或其组合。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品分离自冷冻或先前冷冻的胎儿支持组织。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品是磨碎的、粉碎的、分碎的、移植物、薄片、微粉化的、粉末、匀浆或提取物。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品包含ucam。在一些实施方案中，所述ucam还包含华顿氏胶。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品包含脐带，所述脐带基本上不含静脉或动脉。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品包含脐带，所述脐带包含静脉或动脉。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品包含天然hc-ha/ptx3复合物、rchc-ha/ptx3复合物或其组合。在一些实施方案中，所述rchc-ha/ptx3复合物包含高分子量透明质酸(hmw ha)、间-α-抑制剂(iαi)蛋白的重链1(hc1)和重链2(hc2)以及正五聚蛋白3蛋白(ptx3)。在一些实施方案中，所述rchc-ha/ptx3复合物由hmw ha、hc1、hc2和ptx3组成。在一些实施方案中，所述rchc-ha/ptx3复合物由hmw ha、hc1、hc2、ptx3和tsg-6组成。在一些实施方案中，所述天然hc-ha/ptx3复合物来自胎儿支持组织。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品包含药学上可接受的辅料、载体或其组合。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品被配制成非固体剂型。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品被配制成固体剂型。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品被配制成溶液、混悬剂、糊剂、软膏、油乳剂、乳膏、洗剂、凝胶、贴剂、棒状剂、膜剂、涂剂或其组合。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品被配制用于局部施用、通过注射施用或外用施用。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品被配制用于外用施用，所述胎儿支持组织产品还包含渗透增强剂、胶凝剂、粘合剂、润肤剂或其组合。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品被配制用于控释。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品被配制成控释颗粒、脂质复合物、脂质体、纳米颗粒、微球、微粒或纳米胶囊。在一些实施方案中，所述缺血性病况包括心肌缺血、缺血性结肠炎、肠系膜缺血、脑缺血、急性肢体缺血、发绀和坏疽。
5.在某些实施方案中，本文描述了促进有需要的个体中神经血管生成的方法，所述方法包括使包含神经嵴祖细胞的组织与胎儿支持组织产品接触。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品来自胎盘、胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、羊膜基质、羊膜胶质、羊水或其组合。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品分离自冷冻或先前冷冻的胎儿支持组织。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品是磨碎的、粉碎的、分碎的、移植物、薄片、微粉化的、粉末、匀浆或提取物。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品包含脐带羊膜(ucam)。在一些实施方案中，所述ucam还包含华顿氏胶。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品包含脐带，所述脐带基本上不含静脉或动脉。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品包含脐带，所述脐带包含静脉或动脉。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品包含天然hc-ha/ptx3复合物、重构的hc-ha/ptx3(rchc-ha/ptx3)复合物或其组合。在一些实施方案中，所述rchc-ha/ptx3复合物包含高分子量透明质酸(hmw ha)、间-α-抑制剂(iαi)蛋白的重链1(hc1)和重链2(hc2)以及正五聚蛋白3蛋白(ptx3)。在一些实施方案中，所述rchc-ha/ptx3复合物由hmw ha、hc1、hc2和ptx3组成。在一些实施方案中，所述rchc-ha/ptx3复合物由hmw ha、hc1、hc2、ptx3和tsg-6组成。在一些实施方案中，所述天然hc-ha/ptx3复合物来自胎儿支持组织。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品包含药
学上可接受的辅料、载体或其组合。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品被配制成非固体剂型。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品被配制成固体剂型。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品被配制成溶液、混悬剂、糊剂、软膏、油乳剂、乳膏、洗剂、凝胶、贴剂、棒状剂、膜剂、涂剂或其组合。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品被配制用于局部施用、通过注射施用、外用施用或吸入。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品被配制用于外用施用，所述胎儿支持组织产品还包含渗透增强剂、胶凝剂、粘合剂、润肤剂或其组合。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品被配制用于控释。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品被配制成控释颗粒、脂质复合物、脂质体、纳米颗粒、微球、微粒或纳米胶囊。在一些实施方案中，所述组织包括缺血组织。在一些实施方案中，所述组织包括溃疡、创伤、穿孔、烧伤、手术、损伤或瘘管。在一些实施方案中，所述方法防止组织坏死。
6.在某些实施方案中，本文描述了促进有需要的个体中包含内皮细胞和周细胞的组织的血管生成的方法，所述方法包括通过使所述组织与胎儿支持组织产品接触而将周细胞重编程为第一祖表型，以及通过使所述组织与所述胎儿支持组织产品接触而将内皮细胞重编程为第二祖表型。在一些实施方案中，使所述周细胞与所述胎儿支持组织产品选择性接触。在一些实施方案中，使所述内皮细胞与所述胎儿支持组织产品选择性接触。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品包含天然hc-ha/ptx3复合物、重构的hc-ha/ptx3(rchc-ha/ptx3)复合物或其组合。在一些实施方案中，所述rchc-ha/ptx3复合物包含高分子量透明质酸(hmw ha)、间-α-抑制剂(iαi)蛋白的重链1(hc1)和重链2(hc2)以及正五聚蛋白3蛋白(ptx3)。在一些实施方案中，所述rchc-ha/ptx3复合物由hmw ha、hc1、hc2和ptx3组成。在一些实施方案中，所述rchc-ha/ptx3复合物由hmw ha、hc1、hc2、ptx3和tsg-6组成。在一些实施方案中，所述天然hc-ha/ptx3复合物来自胎儿支持组织。在一些实施方案中，所述组织还包含神经嵴祖细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括使所述神经嵴祖细胞与所述胎儿支持组织产品接触。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品来自胎盘、胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、羊膜基质、羊膜胶质、羊水或其组合。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品分离自冷冻或先前冷冻的胎儿支持组织。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品是磨碎的、粉碎的、分碎的、移植物、薄片、微粉化的、粉末、匀浆或提取物。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品包含脐带羊膜(ucam)。在一些实施方案中，所述ucam还包含华顿氏胶。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品包含脐带，所述脐带基本上不含静脉或动脉。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品包含脐带，所述脐带包含静脉或动脉。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品包含药学上可接受的辅料、载体或其组合。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品被配制成非固体剂型。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品被配制成固体剂型。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品被配制成溶液、混悬剂、糊剂、软膏、油乳剂、乳膏、洗剂、凝胶、贴剂、棒状剂、膜剂、涂剂或其组合。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品被配制用于局部施用、通过注射施用、外用施用或吸入。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品被配制用于外用施用，所述胎儿支持组织产品还包含渗透增强剂、胶凝剂、粘合剂、润肤剂或其组合。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品被配制用于控释。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品被配制成控释颗粒、脂质复合物、脂质体、纳米颗粒、微球、微粒或纳米胶囊。在一些实施方案中，所述组织包括缺血组织。在一些实施方案中，所述组织包括溃疡、创伤、穿孔、烧伤、手术、损
伤或瘘管。在一些实施方案中，所述方法防止组织坏死。在一些实施方案中，所述方法还包括在接触步骤之前选择具有包含内皮细胞和周细胞的组织的个体。在一些实施方案中，选择包括检测所述组织中的周细胞标志物。在一些实施方案中，所述周细胞标志物是flk-1、cd34、cd31、α-sma、pdgfrβ、ng2或其组合。
7.在某些实施方案中，本文描述了治疗有需要的个体中包含内皮细胞和周细胞的缺血组织的方法，所述方法包括通过使所述组织与胎儿支持组织产品接触而将周细胞重编程为第一祖表型，以及通过使所述组织与所述胎儿支持组织产品接触而将内皮细胞重编程为第二祖表型。在一些实施方案中，使所述周细胞与所述胎儿支持组织产品选择性接触。在一些实施方案中，使所述内皮细胞与所述胎儿支持组织产品选择性接触。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品包含天然hc-ha/ptx3复合物、rchc-ha/ptx3复合物或其组合。在一些实施方案中，所述rchc-ha/ptx3复合物包含高分子量透明质酸(hmw ha)、间-α-抑制剂(iαi)蛋白的重链1(hc1)和重链2(hc2)以及正五聚蛋白3蛋白(ptx3)。在一些实施方案中，所述rchc-ha/ptx3复合物由hmw ha、hc1、hc2和ptx3组成。在一些实施方案中，所述rchc-ha/ptx3复合物由hmw ha、hc1、hc2、ptx3和tsg-6组成。在一些实施方案中，所述天然hc-ha/ptx3复合物来自胎儿支持组织。在一些实施方案中，所述组织还包含神经嵴祖细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括使所述神经嵴祖细胞与所述胎儿支持组织产品接触。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品来自胎盘、胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、羊膜基质、羊膜胶质、羊水或其组合。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品分离自冷冻或先前冷冻的胎儿支持组织。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品是磨碎的、粉碎的、分碎的、移植物、薄片、微粉化的、粉末、匀浆或提取物。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品包含ucam。在一些实施方案中，所述ucam还包含华顿氏胶。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品包含脐带，所述脐带基本上不含静脉或动脉。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品包含脐带，所述脐带包含静脉或动脉。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品包含药学上可接受的辅料、载体或其组合。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品被配制成非固体剂型。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品被配制成固体剂型。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品被配制成溶液、混悬剂、糊剂、软膏、油乳剂、乳膏、洗剂、凝胶、贴剂、棒状剂、膜剂、涂剂或其组合。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品被配制用于局部施用、通过注射施用或外用施用。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品被配制用于外用施用，所述胎儿支持组织产品还包含渗透增强剂、胶凝剂、粘合剂、润肤剂或其组合。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品被配制用于控释。在一些实施方案中，所述胎儿支持组织产品被配制成控释颗粒、脂质复合物、脂质体、纳米颗粒、微球、微粒或纳米胶囊。在一些实施方案中，缺血性病况包括心肌缺血、缺血性结肠炎、肠系膜缺血、脑缺血、急性肢体缺血、发绀和坏疽。
附图说明
8.本公开的新颖特征在随附权利要求中具体地阐述。通过参考阐述其中利用本公开的原理的说明性实施方案的以下详细描述和附图将获得对本公开的特征和优点的更好理解，在附图中：
9.图1示出了在有或没有lnc的情况下固定的hc-ha/ptx3对huvec的凋亡和坏死作
用。
10.图2a-2b示出了在有或没有在塑料上的p4 lnc的情况下可溶性hc-ha/ptx3/4p对gfp huvec的凋亡作用。图2a示出了检测细胞凋亡和坏死的免疫荧光染色。图2b示出了凋亡和坏死的百分比。
11.图3a-3b示出了检测细胞凋亡的免疫荧光染色。图3a示出了检测huvec、周细胞和lnc中凋亡的免疫荧光染色。图3b示出了同时或顺序加入hc-ha/ptx3后的免疫荧光染色，以检测huvec 周细胞和huvec lnc中的凋亡。
12.图4示出了在有或没有在matrigel
tm
上的lnc的情况下可溶性hc-ha/ptx3/4p对gfp-huvec的凋亡作用。
13.图5示出了当lnc在包被的matrigel
tm
上与gfp-huvec共培养时，可溶性hc-ha/ptx3促进lnc静止。
14.图6示出了gfp-huvec和lnc的重聚，其导致在低剂量hc-ha/ptx3(2μg/ml)下芽样lnc生长，但在较高剂量(100μg/ml)下抑制生长。
15.图7示出了hc-ha/ptx3在p10 lnc中于60min时促进早期球体形成。
16.图8a-8d示出了关于hc-ha/ptx3、ha或3d matrigel
tm
的mrna表达时程。图8a示出了cxcr4的mrna表达时程。图8b示出了sdf-1的mrna表达时程。图8c示出了ngf的mrna表达时程。图8d示出了vegf的mrna表达时程。
17.图9a-9d示出了证实cxcr4和sdf-1的细胞质/细胞核表达的免疫荧光染色。图9a示出了暴露于hc-ha/ptx3后cxcr4的免疫荧光染色。图9b示出了暴露于ha后cxcr4的免疫荧光染色。图9c示出了3d matrigel
tm
(3d mg)上cxcr4的免疫荧光染色。图9d示出了暴露于hc-ha/ptx3后sdf-1的免疫荧光染色。
18.图10a-10e示出了hif信号传导的mrna表达模式时程。图10a示出了hif1β的mrna表达模式时程。图10b示出了hif1α的mrna表达模式时程。图10c示出了hif2α的mrna表达模式时程。图10d示出了hif1α的mrna表达模式时程。图10e示出了hif1β的mrna表达模式时程。
19.图11a-11c示出了hif1β的免疫荧光(if)染色。图11a示出了在hc-ha/ptx3存在下hif1β的if染色。图11b示出了在ha存在下hif1β的if染色。图11c示出了3d matrigel
tm
(3d mg)上hif1β的if染色。
20.图12a-12e示出了免疫荧光(if)染色。图12a示出了在hc-ha/ptx3存在下hif1α的if染色。图12b示出了在ha存在下hif1α的if染色。图12c示出了3d matrigel
tm
(3d mg)上hif1α的if染色。图12c示出了hif1α的if染色。图12d示出了hif1β的if染色。
21.图13a-13f示出了磷酸化phd2(p-phd2，ser125)的免疫荧光(if)染色。图13a示出了在hc-ha/ptx3存在下p-phd2的免疫荧光染色。图13b示出了在ha存在下磷-phd2(p-phd2)的if染色。图13c示出了3d matrigel
tm
(3d mg)上p-phd2的if染色。图13d示出了在hc-ha/ptx3存在下phd2的免疫荧光染色。图13e示出了在ha存在下phd2的if染色。图13f示出了3d matrigel
tm
(3d mg)上phd2的if染色。
22.图14a-14c示出了pp2a c亚基的免疫荧光(if)染色。图14a示出了在hc-ha/ptx3存在下pp2a c亚基的免疫荧光染色。图14b示出了在ha存在下pp2a c亚基的if染色。图13c示出了3d matrigel
tm
(3d mg)上pp2a c亚基的if染色。
23.图15a-15c示出了pp2a b55α的免疫荧光(if)染色。图15a示出了在hc-ha/ptx3存
在下pp2a b55α的免疫荧光染色。图15b示出了在ha存在下pp2a b55α的if染色。图15c示出了3d matrigel
tm
(3d mg)上pp2a b55α的if染色。
24.图16示出了在hc-ha/ptx3存在下hif2α的if染色。
25.图17示出了在hc-ha/ptx3存在下芳烃受体(ahr)的if染色。
26.图18a-18c示出了hes-1、notch3和jag1的mrna表达模式时程。图18a示出了hes-1的mrna表达模式时程。图18b示出了notch3的mrna表达模式时程。图18c示出了jag1的mrna表达模式时程。
27.图19a-19b示出了hes1的免疫荧光(if)染色。图19a示出了在hc-ha/ptx3存在下hes1的if染色。图19b示出了在ha存在下hes1的if染色。
28.图20a-20c示出了notch 1或notch3的免疫荧光(if)染色。图20a示出了在hc-ha/ptx3存在下notch1的if染色。图20b示出了在3d matrigel(mg)存在下notch3的if染色。图20c示出了在hc-ha/ptx3存在下notch3的if染色。
29.图21a-21f示出了vegf、pdgfα、cd31、igf-1、ngf和p75
ntr
的mrna表达模式时程。图21a示出了vegf的mrna表达模式时程。图21b示出了pdgfα的mrna表达模式时程。图21c示出了cd31的mrna表达模式时程。图21d示出了igf-1的mrna表达模式时程。图21e示出了ngf的mrna表达模式时程。图21f示出了p75
ntr
的mrna表达模式时程。图21g示出了sox2的mrna表达模式时程。图21h示出了musashi-1的mrna表达模式时程。图21i示出了pdgfrβ的mrna表达模式时程。
30.图22a-22d示出了在hc-ha/ptx3存在下p4 lnc中hif1α、hif1β、cxcr4、hif2α、hes1、ahr、nicd和sdf1的免疫荧光(if)染色。图22a示出了hif1α和hif1β的免疫荧光(if)染色。图22b示出了cxcr4和hif2α的免疫荧光(if)染色。图22c示出了hes1和ahr的免疫荧光(if)染色。图22d示出了nicd和sdf1的免疫荧光(if)染色。
31.图23a-23d示出了在ha存在下hif1α、hif1β、cxcr4和hes1的免疫荧光(if)染色。图23a示出了hif1α的免疫荧光(if)染色。图23b示出了hif1β的免疫荧光(if)染色。图23c示出了cxcr4的免疫荧光(if)染色。图23d示出了hes1的免疫荧光(if)染色。
32.图24a-24e示出了固定的hc-ha/ptx3(而非在3d matrigel
tm
上)在p10 lnc中促进神经嵴祖细胞具有神经胶质潜能。在改良的胚胎干细胞培养基(mescm)中，将1
×
105/ml的p10 lnc接种于covalink-nh 96板中5％包被的mg、3d mg或固定的hc-ha/ptx3上48h。图24a示出了由相差显微镜测定的在24h和48h时球体形成的结果。白色标尺＝50μm。图24b示出了用于比较当与在包被的mg(##p《0.05，n＝3)或3d mg(**p《0.05，n＝3)上的各自基因表达比较时，在hc-ha/ptx3上的p10 lnc的神经嵴标志物pax6、p75
ntr
、musashi-1、巢蛋白(nestin)、msx-1、foxd3的mrna水平的定量rt-pcr分析。图24c示出了显示神经嵴祖细胞标志物pax6、sox2、p75
ntr
和musashi-1的细胞定位的免疫荧光染色。核通过hoechst 33342复染。白色标尺＝25μm。在各自的诱导培养基中培养后，分别通过神经丝m(nfm)、o4和胶质纤维酸性蛋白(gfap)的相差显微镜和免疫荧光染色评估源自细胞聚集体的细胞的分化潜能(图24d)。核通过hoechst 33342复染。标尺＝50μm。图24e示出了对pax6、sox2、p75
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、musashi-1和巢蛋白的免疫荧光染色。
33.图25a-25e示出了可溶性hc-ha/ptx3促进p10 lnc中早期细胞聚集和pax6 神经嵴祖细胞。在mescm中，将1
×
105/ml的p10角膜缘微环境细胞接种于可溶性hc-ha/ptx3、3d mg
或包被的mg上。图25a示出了细胞形态和聚集的相差显微镜图像(由白色箭头标记)。白色标尺＝100μm。在3d mg和hc-ha/ptx3上不同时程的定量rt-pcr分析用于比较p10 lnc中的p75
ntr
(图25b)、ngf(图25c)和musashi-1(图25d)的mrna。(##p《0.01，n＝3)。图25e示出了确认48h时在包被的mg、固定的hc-ha/ptx3或可溶性hc-ha/ptx3上pax6、p75
ntr
和sox2的表达的免疫荧光染色。标尺：50μm。核通过hoechst 33342复染。
34.图26a-26f示出了可溶性hc-ha/ptx3促进的细胞聚集和核pax6表达由cxcr4/sdf-1信号传导介导。在有或没有可溶性hc-ha/ptx3的情况下，将p10 lnc接种于3d mg中或包被的mg上，并用或不用在mescm中的amd3100预处理5、15、30、60min或48h。通过相差显微镜评估细胞聚集(图26a，标尺＝100μm)。使用在时间0时在3d matrigel中的表达水平设置为1，通过qrt-pcr测定cxcr4/sdf-1信号传导，以比较sdf-1(图26c)和cxcr4(图26b)的mrna转录物水平(**p《0.01或
##
p《0.01，n＝3)。使用包被的mg的表达水平设置为1，通过pax6、p75
ntr
、ngf、musashi-1、msx-1和foxd3的mrna转录物水平的qrt-pcr(图26e，**p《0.01)以及通过cxcr4、sdf-1和pax6的免疫荧光染色(图26d，核通过hoechst 33342复染，标尺＝50μm)进行表型表征。使用β-肌动蛋白或组蛋白h3作为上样对照，通过western印迹确认pax6和cxcr4的细胞质或细胞核提取物级分的蛋白表达。(图26f)。
35.图27a-27g示出了hc-ha/ptx3促进p10 lnc中细胞聚集和bmp信号传导；然而，单独使用在塑料上的bmp配体未促进bmp信号传导及降低细胞聚集。早期(p4)的角膜缘微环境细胞在改良的胚胎干细胞培养基(mescm)中添加或未添加bmp配体或hc-ha/ptx3的情况下在塑料上扩增24h。在mescm中，将晚期传代(p10)的角膜缘微环境细胞接种于3d mg上或固定的hc-ha/ptx3中5、15、30、60和120分钟。在24h时比较p4 lnc上hc-ha/ptx3中或用bmp配体处理的塑料中的细胞聚集体，并比较核psmad1/5/8的免疫荧光染色。相位白色标尺＝100μm。图27a示出了通过rt-qpcr分析的在包被的mg或hc-ha/ptx3上bmp配体以及受体bmp2、bmp4、bmp6、bmpr1a、bmpr2和acvr1的转录物表达用于在p4和p10 lnc中进行比较。图27b示出了比较在包被的matrigel
tm
、hc-ha/ptx3或可溶性hc-ha/ptx3上的p4和p10 lnc中的核psmad1/5/8的免疫荧光染色。if白色标尺＝25μm。在3d mg和hc-ha/ptx3上不同时程的定量rt-pcr分析用于比较p10 lnc中bmp2(图27c)、bmp4(图27d)和bmp6(图27e)的mrna表达。(**p《0.01，n＝3；##p《0.01，n＝3)。图27f示出了核psmad1/5/8的免疫荧光染色。图27g示出了使用β-肌动蛋白和组蛋白h3作为上样对照，如通过western印迹确认的psmad1/5的细胞核和细胞质提取物级分的蛋白表达。
36.图28a-28g示出了固定的hc-ha/ptx3促进p4 lnc中细胞聚集所需的bmp信号传导和启动pcp信号传导。在改良的胚胎干细胞培养基中，将1
×
105/ml的p4 lnc接种于covalink-nh 96板上固定的hc-ha/ptx3中48h，在此之前该p4 lnc用ldn-193189预处理1h，或用含有混合hiperfect sirna转染试剂和乱序rna、sibmpr1a、sibmpr2或sibmpr1a/sibmpr2的50μl dmem的转染试剂预处理72h。图28a示出了在24h时通过相差显微镜成像的所得细胞聚集体。图28b示出了wnt5a转录物表达的qrt-pcr。图28c示出了wnt5b转录物表达的qrt-pcr。图28d示出了wnt11转录物表达的qrt-pcr。图28e示出了接种于固定的hc-ha/ptx3、包被的matrigel
tm
或3d matrigel
tm
上的p10lnc中的pc-jun和pax6的免疫染色。图28f示出了bmp配体和受体(以及pcp配体和受体)的转录物表达的qrt-pcr。图28g示出了进行psmad1/5/8(p-c-jun和nkd1)的免疫染色以确认标准bmp信号传导(和pcp信号传导)的状
态。核通过hoechst 33342复染。标尺＝25μm。
37.图29a-29e示出了角膜缘微环境细胞(lnc)中特有的核46kda pax6。图29a示出了从角膜缘组织新鲜分离的pck(-)lnc(箭头)和pck( )角膜缘上皮细胞显示了pax6的阳性核染色，而从上皮脱落的角膜基质新鲜分离的pck(-)csc显示了pax6的细胞质染色。lnc和csc以相同方式在mescm中包被的matrigel
tm
上扩增直至第4代(p4)，而csc也在神经干细胞培养基(nscm)或dmem/10％fbs中塑料上进行培养。图29b示出了通过相差显微镜在第6天进行的细胞形态比较。图29c示出了通过p4 lnc中神经嵴标志物(pax6、p75
ntr
、musashi-1、sox2、巢蛋白、msx2和foxd3)的rt-qpcr分析的转录物表达与在相同培养条件下p4 csc的转录物表达进行比较(
##
p《0.05，n-3)。柱状图从左至右：p4 csc/dmem；p4 csc/nscm；p4 csc/mescm；p4lnc/mescm。图29d示出了在mescm中包被的matrigel
tm
上的p4lnc和p4 csc中的波形蛋白、pax6、p75
ntr
、musashi-1、sox2和巢蛋白的细胞定位的免疫荧光染色(核通过hoechst 33342复染)，标尺＝100μm。图29e示出了使用组蛋白3作为上样对照，通过western印迹确认来自p4 csc、p4 lnc和p10 lnc的pax6蛋白表达。
38.图30a-30h示出了连续传代后lnc中核pax6染色的丧失。lnc和csc分离自同一供体的四个象限(标记为a-d)和中央角膜(标记为e)，如图30a所示。将这些lnc和csc连续传代以测量在mescm中包被的matrigel
tm
上的累积倍增时间，如图30c所示。图30b示出了在第6天时通过相差显微镜测定的细胞形态的比较。图30d示出了使用p2中每种标志物的转录表达水平设置为1，通过rt-qpcr测定的血管生成标志物(α-sma、pdgfrβ、flk-1、cd31)和间充质干细胞标志物(cd73和cd105)的转录表达(**p《0.01，n＝3)。柱状图从左至右：p2、p4、p6、p8、p13。图30e示出了使用p2中每种标志物的转录表达水平设置为1，通过rt-qpcr测定的神经嵴标志物(pax6、p75
ntr
、musashi-1、sox2、巢蛋白、foxd3和msx1)的转录表达(**p《0.01，n＝3)。柱状图从左至右：p2、p4、p6、p8、p13。图30f示出了免疫荧光染色显示pax6、p75
ntr
、musashi-1、sox2和巢蛋白的细胞定位。标尺＝100μm。图30g示出了核pax6染色的细胞在连续传代过程中来自区域a的总lnc中下降的百分比。图30h示出了使用p2中每种标志物的转录表达水平设置为1，通过rt-qpcr测定的各种标志物的转录表达。
39.图31a-31f示出了在连续传代后lnc和csc的神经潜能下降。对于每次传代，在nscm神经球培养基中，将5
×
103/cm
2 lnc细胞接种于包被聚hema的12孔板上以产生神经球6天(图31a；标尺＝50μm)。图31b示出了活细胞测定和死细胞测定，显示由p4 lnc形成的球体在第6天是活的而无死细胞。标尺＝200μm。从四个不同角膜缘区扩增的lnc测量神经球形成效率(％)，并与每次传代的csc区的效率进行比较(图31c；
##
p《0.001(lnc a)；**p《0.001(lnc b))。将由p4csc形成的神经球中的神经嵴标志物(例如pax6、p75
ntr
、musashi-1、sox2、巢蛋白、msx1和foxd3)的转录物水平与由转录表达设置为1的mescm中接种于包被的matrigel
tm
上的p4 lnc或p4 csc形成的神经球中神经嵴标志物的转录物水平进行比较(图31d，**p＝0.0001，#p＝0.001，n＝3)。柱状图从左至右：p4 csc mescm、p4 csc神经球、p4 lnc神经球。图31e示出了显示源自p4 csc和p4 lnc的神经球中的pax6、musashi-1和巢蛋白的细胞定位的免疫荧光染色。标尺＝100μm。图31f示出了通过神经丝m(nfm)和β-iii微管蛋白、o4和胶质纤维酸性蛋白(gfap)的免疫荧光染色分别评估p4或p10 lnc分化成神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞的潜能。标尺＝50μm。核通过hoechst33342复染。
40.图32a-32e示出了pax6的强制表达上调p10lnc中神经嵴标志物的表达。图32a示出
了ad-gfp(gfp)质粒或ad-gfp-pax6(gfp-pax6)质粒。在5天期间内预先测定了质粒各自的感染复数(moi)后，将质粒转染到在mescm中包被的matrigel
tm
上培养的p10 lnc中(图32b，*p《0.1，**p《0.05，n＝3)。在各自转染后，使用rt-pcr分析比较esc标志物(oct4、sox2和nanog)和神经嵴标志物(p75
ntr
、musashi-1、巢蛋白、msx1和foxd3)的转录物水平(图32c，**p《0.05，n＝3)。图32d示出了使用β-肌动蛋白作为上样对照的western印记分析比较46kda pax6、oct4、p75
ntr
和musashi-1的蛋白表达。通过免疫荧光双染或单染测定pax6和oct4、pax6和sox2、以及p75
ntr
和musashi-1的细胞定位(图32e)。核通过hoechst 33342复染。标尺＝100μm。
41.图33a-33c示出了pax6的强制表达上调p10lnc中神经嵴标志物的表达。将在mescm中包被的matrigel
tm
上的p10 lnc用ad-gfp(gfp)或ad-gfp-pax6(gfp-pax6)质粒以moi 100转染4天，然后将培养基换成nscm神经球培养基7天。通过有或没有gfp荧光的共聚焦显微镜对神经球进行成像(图33a)。比较直径大于50μm的神经球的总数(图33b，*p＝0.001，n＝3)。在细胞在不同诱导培养基中培养并通过神经丝m(nfm)、o4和胶质纤维酸性蛋白(gfap)的相差显微镜和免疫荧光染色进行观察后，评估源自神经球的细胞的分化潜能(图33c，核通过hoechst 33342复染，标尺＝50μm)。
42.图34a-34f示出了具有pax6的强制表达的p10 lnc促进lepc的自更新。在用ad-gfp或ad-gfp-pax6质粒以moi 100转染的p10lnc和lepc之间进行体外重聚测定，并与p4 lnc的阳性对照和p4csc的阴性对照进行比较。在共焦显微镜下在第1天和第6天通过相位和gfp荧光对球体形态进行成像(图34a；标尺＝50μm)。当与作为对照的p4 csc进行比较时，通过qrt-pcr分析得到的重聚球体的bmi-1(**p＝0.003，n＝3)、δnp63α(**p＝0.06，n＝3)和细胞角蛋白12(ck12)(**p＝0.000004、n＝3)的转录表达(图34b)。对bmi-1/pck、gfp/p63α和gfp/ck12进行pck( )细胞的免疫双染(图34c，白色箭头表示pck(-)细胞；标尺＝50μm)。在3t3成纤维细胞饲养层上进行与用ad-gfp或ad-gfp-pax6转染的p10 lnc、p4 lnc或p4 csc重聚或未重聚的lepc的体外克隆测定。通过罗丹明b染色评估克隆生长(图34d；标尺＝0.5mm)，同时比较总克隆、全克隆、部分克隆和旁克隆的克隆形成率(％)(图34e，*p《0.05；**《0.01)。全克隆的上皮形态进一步通过p63α、pax6和cd12的相位图像和免疫染色进行表征(图34f；标尺＝50μm)。核通过hoechst 33342复染。
43.图35a-35b示出了在连续传代后lnc中核pax6神经嵴祖细胞状态的逐渐丧失。p10 lnc在mescm中的5％包被的mg上并连续传代。通过使用第二代(p2)的表达水平设置为1对神经嵴标志物(例如pax6、sox2、p75
ntr
、musashi-1和巢蛋白)的mrna水平的定量rt-pcr(图35a，##p《0.01，n＝3)以及p4与p10 lnc之间pax6、sox2、p75
ntr
、musashi-1和巢蛋白的免疫荧光染色(图35b，标尺＝100μm)测定p10lnc的表型。
44.图36a-36f示出了由hc-ha/ptx3促进的细胞聚集和cscr4/sdf-1信号传导不受bmp信号传导影响。将在mescm中包被的mg上的p10 lnc用或不用针对bmpr1a、bmpr1b、bmpr2和acvr1的sirna转染进行预处理，然后在mescm中有或没有可溶性hc-ha/ptx3的情况下将p10 lnc接种于包被的mg上。当与乱序rna(scrna)作为对照进行比较时，转染效率通过qrt-pcr验证(图36a，**p《0.01，n＝3)。bmp信号传导通过对psmad1/5/8免疫荧光染色进行测量(图36b)，并且细胞聚集通过相差显微镜进行检测(图36c，标尺＝100μm)。使用在时间0时在hc-ha/ptx3 scrna的情况下细胞的表达水平设置为1(*p》0.05，n＝3)，通过cxcr4(图36d)和
sdf-1(图36e)转录物表达的qrt-pcr以及通过对cxcr4和pax6的免疫荧光染色(图36f，核通过hoechst 33342复染，标尺＝25μm)评估cxcr4/sdf-1信号传导。
45.图37a-37c示出了在60分钟内lnc中由ha和hc-ha/ptx3导致的细胞骨架变化与rho gtpase rhoa、rac1和cdc42效应蛋白相关。图37a示出了用hc-ha/ptx处理的lnc的相位图。图37b示出了用ha和hc-ha/ptx3处理后，rhoa、rac1和cdc42活性的图。图37c示出了dnase i/鬼笔环肽(g-肌动蛋白/f-肌动蛋白)的免疫双染。
46.图38a-38b示出了人角膜、角膜缘和结膜中notch配体和受体的表达。图38a示出了notch受体(notch 1，notch 1胞内结构域(nicd)，notch2和notch 3)和notch配体(jagged 1，delta)的体内信号传导。图38b示出了在新鲜胶原酶分离的团状物(cluster)中的体内notch信号传导。
47.图39a-39e示出了在塑料、3d matrigel和hc-ha/ptx3上notch信号的表达。
48.图40a-40b示出了在48小时时，在固定的hc-ha/ptx3上lepc和lnc中典型notch信号传导的表达。
49.图41a-41c示出了在48小时时阻断notch信号传导抑制固定的hc-ha/ptx3上lepc和lnc中bmp和非典型范wnt。图41a示出了在用与lepc重聚的lncs中hc-ha/ptx3和hc-ha/ptx3/dapt处理后各种基因的mrna水平的图。图41b示出了用各种标志物进行的免疫染色。
50.图42示出了在48小时时，在塑料、3d matrigel或固定的hc-ha/ptx3上lnc中的notch信号传导。
51.图43示出了在hc-ha/ptx3或3d matrigel(mg)存在下hes1、notch3和notch1的免疫荧光(if)染色。
52.图44示出了相差显微图像，显示早在60分钟时可溶性hc-ha/ptx3(而非在ha或包被的matrigel(mg)中)促进细胞聚集。
53.图45a-45c示出了可溶性hc-ha/ptx3(而非ha或3d mg单独使用)促进血管新生出芽。图45a示出了显示4h时细胞形态重聚聚集体的相差显微图像。图45b-45c示出了在d13时从侵入边缘的两侧测量的出芽突起的直径的图。
54.图46示出了在有或没有固定的ha、hc-ha/ptx3复合物的情况下接种于塑料上，然后用或不用tgfβ1处理的人角膜成纤维细胞(hcf)中hif1αmrna表达的图。
具体实施方式
55.血管包括形成血管壁的内衬的内皮细胞和在血管表面上发现的周细胞。血管通过两种不同的过程产生，这两种不同的过程为涉及由现有血管形成新血管的血管新生(angiogenesis)，和涉及血管的重新形成的血管生成(vasculogenesis)。正常血管新生是复杂的多步骤过程，其包括建立基质结合生长因子(gf)(例如vegf-a、bfgf、pdgf-bb)的梯度形成、内皮细胞(ec)的迁移和增殖、细胞外基质的溶解以及壁细胞(例如周细胞)的募集以稳定毛细血管发育。与肿瘤相关的异常血管新生的特征在于血管渗漏和出血，并且通常与缺少周细胞有关和/或伴随无法结合vegf-a相关基质类肝素。
56.脑中的周细胞来源于神经嵴细胞，并且促进神经发生和血管生成，在本文中称为神经血管生成的过程。周细胞具有多种支持功能，以调节血脑屏障(bbb)完整性和血管新生、影响神经炎症反应，并具有多能干细胞活性。周细胞缺陷已被认为是糖尿病相关的微血
管疾病(例如视网膜病和肾病)的早期标志，并且可能导致异常血管新生，造成血管渗漏和出血、小鼠肿瘤模型中转移瘤增加、复杂神经系统疾病(例如阿尔茨海默病)中的脑血管功能障碍，以及肌萎缩性脊髓侧索硬化症。
57.在一些实施方案中，本文提供了促进有需要的个体中血管生成或正常血管新生的方法，该方法包括使包含内皮细胞和周细胞或神经嵴祖细胞的组织与胎儿支持组织产品接触。在一些实施方案中，血管生成作为神经血管生成的一部分发生。在一些实施方案中，神经血管生成还包括神经发生。在一些实施方案中，本文还提供了治疗有需要的个体的缺血性病况的方法，该方法包括使缺血组织与胎儿支持组织产品接触。在一些实施方案中，本文还提供了治疗有需要的个体的神经性病况的方法，该方法包括使缺血组织与胎儿支持组织产品接触。
58.在一些实施方案中，本文还提供了抑制有需要的个体中异常血管新生的方法，该方法包括使包含内皮细胞的组织与胎儿支持组织产品接触。在一些实施方案中，该组织缺少周细胞。在一些实施方案中，该方法还包括通过检测不存在周细胞标志物选择所述个体。某些定义
59.除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与要求保护的主题所属领域的技术人员通常所理解的相同的含义。
60.在一些实施方案中，本文中使用的范围和量表示为“约”特定的值或范围。约还包括确切的量。因此，“约5μg”意指“约5μg”和“5μg”。通常，术语“约”包括可能被预期在实验误差内的量。
61.本文中使用的“胎儿支持组织产品”意指源于用于支持胎儿发育的组织的任何分离的产品。胎儿支持组织产品的实例包括但不限于：(i)胎盘羊膜(pam)或基本上分离的pam、(ii)脐带羊膜(ucam)或基本上分离的ucam、(iii)绒毛膜或基本上分离的绒毛膜、(iv)羊膜-绒毛膜或基本上分离的羊膜-绒毛膜、(v)胎盘或基本上分离的胎盘、(vi)脐带或基本上分离的脐带，或者(vii)它们的任何组合。在一些实施方案中，胎儿支持组织选自胎盘羊膜(pam)、脐带羊膜(ucam)、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、胎盘、脐带及其任何组合。在一些实施方案中，胎儿支持组织包含脐带。胎儿支持组织产品包括胎儿支持组织的任何形式，包括低温保存的、终端-灭菌的、冻干的胎儿支持组织，或者由研磨胎儿支持组织而得的粉末。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品是磨碎的、粉碎的、分碎的、移植物、薄片、粉末、凝胶、匀浆、提取物，或者终端-灭菌的产品。
62.本文中使用的“胎盘”是指将发育中的胎儿与母体子宫壁连接以允许经由母体血液供给来进行营养物摄取、废物清除和气体交换的器官。胎盘由三层构成。包围胎儿的最内胎盘层称为羊膜。尿囊是胎盘的中间层(源于胚胎后肠)；起源于脐的血管穿过此膜。胎盘的最外层绒毛膜与子宫内膜接触。绒毛膜和尿囊融合而形成绒毛膜尿囊膜。
63.本文中使用的“绒毛膜”是指由胚外中胚层和两层滋养层形成的膜。绒毛膜由两层构成：由滋养层形成的外层，以及由体壁中胚层形成的内层；羊膜与后者接触。滋养层由立方形或棱形细胞的内层、细胞滋养层或郎罕氏层(layer of langhans)，以及无细胞界限的富核原生质的外层合体滋养层构成。无血管的羊膜粘附于绒毛膜的内层。
64.本文中使用的“羊膜-绒毛膜”是指包含羊膜和绒毛膜的产品。在一些实施方案中，羊膜和绒毛膜未被分离(即，羊膜天然地粘附于绒毛膜的内层)。在一些实施方案中，羊膜初
始地与绒毛膜分离，而后在处理期间与绒毛膜合并。
65.本文中使用的“脐带”是指将发育中的胎儿与胎盘连接的器官。脐带由华顿氏胶(主要由粘多糖制得的胶状物质)构成。它包含一个静脉和两个动脉，该静脉将充氧的富含营养物的血液运载到胎儿，该动脉将缺氧的营养物耗尽的血液运离。
66.本文中使用的“胎盘羊膜”(pam)是指源于胎盘的羊膜。在一些实施方案中，pam被基本上分离。
67.本文中使用的“脐带羊膜”(ucam)意指源于脐带的羊膜。ucam是半透明膜。ucam具有多层：上皮层；基膜；致密层；成纤维细胞层；以及海绵层。ucam缺少血管或直接血液供给。在一些实施方案中，ucam包含华顿氏胶。在一些实施方案中，ucam包含血管和/或动脉。在一些实施方案中，ucam包含华顿氏胶和血管和/或动脉。
68.本文中使用的“人组织”意指源于人体的任何组织。在一些实施方案中，人组织是胎儿支持组织，其选自胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、胎盘或它们的任何组合。
69.本文中使用的“最小操作”意指：(1)对于结构组织，不改变组织的与组织的重建、修复或置换用途相关的原始相关特征的处理；以及(2)对于细胞或非结构组织，不改变细胞或组织的相关生物特征的处理。
70.本文中使用的“移植物”意指用于置换损伤的、受损的或缺失的组织的蛋白(例如胶原蛋白和弹性蛋白)和聚糖(例如皮肤素、透明质酸和软骨素)的基质。在某些实例中，该基质被铺设并且宿主细胞逐渐整合到该基质中。
71.本文中使用的“薄片(sheet)”意指任何连续的扩展或表面。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的薄片基本上变平。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的薄片是扁平的。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的薄片是管状的。在一些实施方案中，该薄片是适合于待治疗的创伤的任何形状或尺寸。在一些实施方案中，该薄片是方形、圆形、三角形或矩形。
72.术语“新鲜胎儿支持组织”是指出生后少于10天的胎儿支持组织，并且该新鲜胎儿支持组织的形式与其出生后基本上相同。在一些实施方案中，该新鲜胎儿支持组织包含胎儿支持组织细胞。在一些实施方案中，该胎儿支持组织细胞包含周细胞。在一些实施方案中，维持该细胞支持组织细胞的生物活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。
[0073]“基本上分离的”或“分离的”，在用于胎儿支持组织的背景时，意指该胎儿支持组织与源于原始源生物的大多数其他非胎儿支持组织材料(例如其他组织、红细胞、静脉、动脉)相分离。
[0074]
本文中使用的短语“其中分离的胎儿支持组织产品的生物和结构完整性基本上被保存”意指当与新鲜胎儿支持组织的生物活性和结构完整性比较时，分离的胎儿支持组织的生物活性和结构完整性仅降低约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约50％或约60％。
[0075]
本文中使用的“处理”意指对胎儿支持组织或包含hc-ha/ptx3的制剂执行的除了恢复、供体筛查、供体测试、贮藏、标记、包装或分配之外的任何活动，例如测试微生物、配制、灭菌、灭活或除去外来剂(adventitious agent)的步骤、防腐以便贮藏、以及从贮藏取
出。
[0076]
本文中使用的术语“纯化的”和“分离的”意指材料(例如hc-ha/ptx3复合物)基本上或大体上不含通常在其天然状态时伴随其的组分。在一些实施方案中，“纯化的”或“分离的”意指约50％或更多的材料(例如hc-ha/ptx3复合物)不含通常在其天然状态时伴随其的组分，例如约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％不含通常在其天然状态时伴随其的组分。
[0077]
本文中使用的“生物活性”意指在包含hc-ha/ptx3的胎儿支持组织产品中多肽和多糖的活性。在一些实施方案中，存在于胎儿组织支持产品中的多肽和多糖的生物活性是抗炎、抗瘢痕、抗血管新生或抗粘附。在一些实施方案中，生物活性是指胎儿组织支持产品中的hc-ha/ptx3复合物的体内活性，或者在体内施用胎儿支持组织产品时产生的生理反应。在一些实施方案中，在胎儿支持组织产品中hc-ha/ptx3复合物的生物活性基本上被保持。在一些实施方案中，存在于胎儿组织支持产品中的多肽和多糖的活性是促进创伤愈合。在一些实施方案中，存在于胎儿支持组织产品中的多肽和多糖的活性是防止瘢痕。在一些实施方案中，存在于胎儿支持组织产品中的多肽和多糖的活性是减轻炎症。因此，生物活性涵盖胎儿支持组织产品中的hc-ha/ptx3复合物的治疗效果和药学活性。
[0078]
本文中使用的“结构完整性”意指构成胎儿支持组织产品的基质和基膜的完整性。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的结构完整性导致缝合拉出强度。
[0079]
本文中使用的重构的hc-ha/ptx3(rchc-ha/ptx3)复合物是通过在体外该复合物的组分分子组装而形成的hc-ha/ptx3复合物。组装rchc-ha/ptx3的过程包括用从生物来源纯化的天然蛋白或分子、通过重组方法产生的重组蛋白或者体外合成的合成分子进行重构。在一些实例中，用于组装rchc-ha/ptx3的纯化的天然蛋白是含有其他蛋白的复合物(即多聚体、多链蛋白或其他复合物)中的蛋白。在一些实例中，ptx3被纯化为来自细胞的多聚体(例如均多聚体)并且用于组装rchc-ha/ptx3复合物。
[0080]
本文中使用的纯化的天然hc-ha/ptx3(nhc-ha/ptx3)复合物是指从生物来源(例如细胞、组织或生物流体)纯化的hc-ha/ptx3复合物。在一些实施方案中，nhc-ha/ptx3是从胎儿支持组织纯化的。在一些实施方案中，nhc-ha/ptx3是从羊膜纯化的。在一些实施方案中，nhc-ha/ptx3是从脐带纯化的。这种复合物通常在受试者中进行体内组装或者在来自受试者(包括人或其他动物)的细胞、组织或者生物流体中进行离体组装。
[0081]
本文中使用的ptx3/ha复合物是指通过使ptx3与固定的ha接触而形成的中间复合物。在本文提供的方法中，ptx3/ha复合物是在hc1添加到ha之前产生。
[0082]
本文中使用的“透明质酸”、“玻尿酸”或“透明质酸盐”(ha)可互换地用于表示含有d-葡糖醛酸和n-乙酰基葡糖胺(d-葡糖醛酰基-n-乙酰基葡糖胺)的重复二糖单元的基本上无硫酸的直链糖胺聚糖(gag)。
[0083]
本文中使用的术语“具有不需要的变化的组织”是指由于例如退行性疾病(例如关节炎、多发性硬化、帕金森病、肌肉萎缩症和亨廷顿病)或老化而退化；或由于损害(例如烧伤、创伤、裂伤、损伤、溃疡、手术)或由于缺血而受损的组织。
[0084]
本文中使用的术语“组织特征性间充质细胞”是指组织特征性的特化细胞，例如，心肌细胞、成骨细胞(骨细胞)、软骨细胞(chondrocytes)(软骨细胞(cartilage cells))、
肌细胞(肌肉细胞)和脂肪细胞(adipocytes)(脂肪细胞(fat cells))。
[0085]
本文中使用的术语“高分子量”或“hmw”，如在高分子量透明质酸(hmw ha)中，意指重均分子量大于约500千道尔顿(kda)的ha，例如，约500kda至约10,000kda、约800kda至约8,500kda、约1100kda至约5,000kda，或者约1400kda至约3,500kda。在一些实施方案中，hmw ha具有3000kda或更高的重均分子量。在一些实施方案中，hmw ha具有3000kda的重均分子量。在一些实施方案中，hmw ha是重均分子量约3000kda的在一些实施方案中，hmw ha具有约500kda至约10,000kda的分子量。在一些实施方案中，hmw ha具有约800kda至约8,500kda的分子量。在一些实施方案中，hmw ha具有约3,000kda的分子量。
[0086]
本文中使用的术语“低分子量”或“lmw”，如在低分子量透明质酸(lmw ha)中，意指重均分子量小于500kda的ha，例如，小于约400kda、小于约300kda、小于约200kda、小于约100kda、小于约50kda、小于约40kda、小于约30kda、小于约20kda、约200-300kda、约1-300kda、约15至约40kda，或约8-10kda。
[0087]
本文中使用的正五聚蛋白3或者ptx3蛋白或多肽是指任何ptx3蛋白，包括但不限于重组产生的蛋白、合成产生的蛋白、天然ptx3蛋白，以及从细胞或组织提取的ptx3蛋白。ptx3包括ptx3的多聚体形式(例如均多聚体)，包括但不限于天然或人工产生的二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、四聚体、八聚体及其他多聚体形式。
[0088]
本文中使用的肿瘤坏死因子刺激的基因-6(tsg-6)是指任何tsg-6蛋白或多肽，包括但不限于重组产生的蛋白、合成产生的蛋白、天然tsg-6蛋白，以及从细胞或组织提取的tsg-6蛋白。
[0089]
本文中使用的间-α-抑制剂(iαi)是指iαi蛋白，其由通过硫酸软骨素链共价连接的类型hc1或hc2的轻链(即双库尼茨抑制剂(bikunin))和一条或两条重链构成。在一些实施方案中，iαi来源于血清，或者来源于在促炎性细胞因子(例如il-1或tnf-α)的构成模式刺激下产生iαi的细胞例如肝细胞或者羊膜上皮或基质细胞或者脐带上皮或基质细胞。
[0090]
本文中使用的“透明质酸结合蛋白”、“ha结合蛋白”或“habp”是指与ha特异性结合的任何蛋白。
[0091]
本文中使用的术语“有效量”或“治疗有效量”是指施用足量的药剂或化合物，其将在某种程度上缓解正被治疗的疾病或病况的一种或更多种症状。在一些实施方案中，结果是减弱和/或减轻疾病的体征、症状或病因，或者生物系统的任何其他期望的改变。例如，治疗性用途的“有效量”是提供疾病症状的临床上显著减轻而无过度的不良副作用所需的包含本文公开的化合物的组合物的量。在一些实施方案中，在任何个别情况中适当的“有效量”可以利用技术(例如剂量递增研究)来确定。术语“治疗有效量”包括例如预防性有效量。本文公开的化合物的“有效量”是有效达到期望效果或治疗性改善而无过度的不良副作用的量。应理解，在一些情况下，“有效量”或“治疗有效量”可以由于在组合物的代谢、受试者的年龄、体重、总体状况、正被治疗的病况、正被治疗的病况的严重程度以及处方医师的判断方面的差异而因受试者而异。在一些实施方案中，有效量是足以促进组织中血管生成或正常血管新生的产品或化合物的量。
[0092]
本文中使用的术语“受试者”、“个体”和“患者”可互换地使用。所述术语均不应被解释为需要医学专业人员(例如医生、护士、医师助理、值班人员、临终关怀工作者)的监督。本文中使用的受试者是任何动物，包括哺乳动物(例如人或非人的动物)和非哺乳动物。在
本文提供的方法和组合物的一个实施方案中，哺乳动物是人。
[0093]
本文中使用的术语“治疗(treat、treating或treatment)”及其他语法等同形式，包括但不限于：缓解、减轻或改善疾病或病况的一种或更多种症状，改善、预防或减少疾病或病况的一种或更多种另外的症状的出现、严重程度或频率，改善或预防疾病或病况的一种或更多种症状的潜在代谢原因，抑制疾病或病况例如防止疾病或病况的发展，减轻疾病或病况，使疾病或病况消退，减轻由疾病或病况所致的状况，或者预防性和/或治疗性地抑制疾病或病况的症状。在非限制性实例中，为了预防性获益，将本文公开的rchc-ha/ptx3复合物或组合物施用于具有患特定疾病风险的个体、具有患特定疾病倾向的个体、或者报告疾病的一种或更多种生理症状的个体。使用方法
[0094]
在一些实施方案中，本文提供了促进有需要的个体中血管生成的方法。在一些实施方案中，本文提供了促进有需要的个体中神经血管生成的方法。在一些实施方案中，促进有需要的个体中血管生成或神经血管生成包括使组织与本文所述的胎儿支持组织产品接触。在一些实施方案中，该组织包含内皮细胞和周细胞。在一些实施方案中，该组织包含神经嵴祖细胞。在一些实施方案中，该组织包含内皮细胞，并且该方法包括进一步将周细胞募集至该组织。在一些实施方案中，该组织包含内皮细胞，并且该方法包括进一步将神经嵴祖细胞募集至该组织。在一些实施方案中，该组织是缺血组织。在一些实施方案中，本文所述的方法防止该组织坏死。在一些实施方案中，该胎儿支持组织产品将周细胞、神经嵴祖细胞或其组合募集至施用部位。在一些实施方案中，施用部位是组织。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品将祖细胞重编程为促进血管生成或神经血管生成的细胞。在一些实施方案中，祖细胞是神经嵴祖细胞。在一些实施方案中，神经嵴祖细胞重编程为周细胞。
[0095]
在一些实施方案中，本文还提供了治疗有需要的个体的缺血性病况的方法。在一些实施方案中，治疗个体的缺血性病况包括使缺血组织与本文所述的胎儿支持组织产品接触。在一些实施方案中，缺血组织包含内皮细胞和周细胞。在一些实施方案中，缺血组织包含内皮细胞，并且该方法包括进一步将周细胞募集至所述缺血组织。在一些实施方案中，本文所述的方法防止所述缺血组织坏死。在一些实施方案中，缺血性病况包括心肌缺血、缺血性结肠炎、肠系膜缺血、脑缺血、急性肢体缺血、发绀和坏疽。在一些实施方案中，本文还提了供治疗微血管疾病的方法。在一些实施方案中，微血管疾病是糖尿病相关的微血管疾病。在一些实施方案中，糖尿病相关的微血管疾病是视网膜病或肾病。在一些实施方案中，缺血性病况是神经营养或神经病性病况。在一些实施方案中，神经性病况减弱一条神经或超过一条神经的功能。在一些实施方案中，神经性病况是遗传性神经病或获得性神经病。在一些实施方案中，获得性神经病是由外伤、感染、疾病、药物治疗、血管疾病、维生素失衡或酒精中毒引起的神经病。在一些实施方案中，该疾病是糖尿病。
[0096]
在一些实例中，该组织是眼组织、脑组织、心脏组织、皮肤组织、关节、脊柱、软组织、肌肉组织、软骨、骨、肌腱、韧带、神经或椎间盘。在一些实例中，该组织是眼组织。在一些实例中，该组织是心脏组织。在一些实例中，该组织是皮肤组织。在一些实例中，具有不需要的变化的组织是关节组织。在一些实例中，该组织来自脊柱。在一些实例中，该组织是椎间盘。在一些实例中，该组织是软组织。在一些实例中，该组织是肌肉组织。在一些实例中，该组织是软骨。在一些实例中，该组织是骨。在一些实例中，该组织是肌腱。在一些实例中，该
组织是韧带。在一些实例中，该组织是神经。
[0097]
在一些实例中，该组织包括退化组织、烧伤、裂伤、缺血组织、创伤、损伤、溃疡或手术切口。在一些实施方案中，该组织包括溃疡、创伤、穿孔、烧伤、手术、损伤或瘘管。在一些实例中，该组织包括退化组织。在一些实例中，该组织包括烧伤。在一些实例中，该组织包括裂伤。在一些实例中，该组织包括缺血组织。在一些实例中，该组织包括创伤。在一些实例中，该组织包括损伤。在一些实例中，该损伤是心肌梗死。在一些实例中，该组织包括溃疡。在一些实施方案中，该溃疡是糖尿病溃疡。在一些实例中，该组织包括手术切口。
[0098]
在一些实施方案中，接触发生的时间足以使血管生成或神经血管生成发生。在一些实施方案中，时间段为至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周或2周。
[0099]
在一些实施方案中，接触发生的时间足以使所述胎儿支持组织产品将祖细胞重编程为促进血管生成生或神经血管生成的细胞。在一些实施方案中，该祖细胞是神经嵴祖细胞。在一些实施方案中，该神经嵴祖细胞重编程为周细胞。在一些实施方案中，时间段为至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周或2周。
[0100]
在一些实施方案中，接触发生的时间足以诱导基因表达。在一些实施方案中，诱导基因表达的接触包括1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周或2周。
[0101]
在一些实施方案中，接触发生的时间足以诱导转录因子的核移位。在一些实施方案中，诱导转录因子的核移位的接触包括至少约5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、1小时、4小时、8小时、12小时、16小时、1天、2天、3天、4天或多于4天。至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周或2周。
[0102]
在一些实施方案中，将神经嵴祖细胞募集至组织包括使该组织与本文所述的胎儿支持组织产品接触。在一些实施方案中，将周细胞募集至组织包括向该组织施用本文所述的胎儿支持组织产品。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品将周细胞、神经嵴祖细胞或其组合吸引至施用部位。在一些实施方案中，周细胞是表达周细胞表型的细胞。在一些实施方案中，表达周细胞表型的细胞是角膜缘微环境细胞(lnc)。
[0103]
在一些实方案中，组织中内皮细胞与周细胞的比率为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。在一些实施方案中，使组织与周细胞接触以达到内皮细胞与周细胞的比率为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。在一些实施方案中，将周细胞募集至组织中以达到内皮细胞与周细胞的比率为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。
[0104]
在一些实施方案中，胎儿支持组织产品包括胎儿支持组织的提取物、胎儿支持组织匀浆、胎儿支持组织粉末、分碎的胎儿支持组织、粉碎的胎儿支持组织、磨碎的胎儿支持组织、胎儿支持组织移植物、纯化的hc-ha/ptx3、重构的hc-ha/ptx3或其组合。
[0105]
在某些实施方案中，本文提供了促进有需要的个体中血管生成或神经血管生成的方法，其中使组织与胎儿支持组织产物接触调节基因表达。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品包含天然hc-ha/ptx3复合物、重构的hc-ha/ptx3(rchc-ha/ptx3)复合物或其组合。在一些实施方案中，hc-ha/ptx3导致血管新生基因、神经源性基因或其组合的表达增加。在一些实施方案中，hc-ha/ptx3导致血管新生基因、神经源性基因或其组合的表达增加至少约0.5x、1.0x、1.5x、2.0x、3.0x、4.0x或大于4.0x。在一些实施方案中，血管新生基因、神经源性基因或其组合包括vegf、pdgfα、pdgfβ、cd31、igf-1、ngf、p75
ntr
、sox-2、musashi-1、
pdgfrα、pdgfrβ、vegfr1或vegfr2。
[0106]
在一些实施方案中，使组织与包含天然hc-ha/ptx3复合物、重构的hc-ha/ptx3(rchc-ha/ptx3)复合物或其组合的胎儿支持组织产品接触足够的时间量以调节基因表达。在一些实施方案中，使组织与包含天然hc-ha/ptx3复合物的胎儿支持组织产品接触至少约5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、1小时、4小时、8小时、12小时、16小时、1天、2天、3天、4天或多于4天。至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周或2周。
[0107]
在一些实施方案中，hc-ha/ptx3调节细胞功能。在一些实施方案中，hc-ha/ptx3促进凋亡、坏死或其组合。在一些实施方案中，hc-ha/ptx3促进凋亡、坏死或其组合至少约0.5x、1.0x、1.5x、2.0x、3.0x、4.0x或大于4.0x。在一些实施方案中，hc-ha/ptx3抑制细胞增殖。在一些实施方案中，hc-ha/ptx3抑制细胞增殖至少约0.5x、1.0x、1.5x、2.0x、3.0x、4.0x或大于4.0x。
[0108]
在一些实施方案中，hc-ha/ptx3调节细胞信号传导。在一些实施方案中，hc-ha/ptx3通过增加基因表达、蛋白表达、蛋白活性或其组合调节细胞信号传导。在一些实施方案中，hc-ha/ptx3通过降低基因表达、蛋白表达、蛋白活性或其组合调节细胞信号传导。在一些实施方案中，hc-ha/ptx3调节sdf-1/cxcr信号传导。在一些实施方案中，hc-ha/ptx3调节hif1信号传导。在一些实施方案中，hif1包含h1f1α。在一些实施方案中，hif1包括hif1β。在一些实施方案中，hc-ha/ptx3调节tgfβ信号传导。在一些实施方案中，hc-ha/ptx3调节非典型tgfβ信号传导。在一些实施方案中，hc-ha/ptx3调节cd44icd信号传导。在一些实施方案中，hc-ha/ptx3调节hes信号传导。在一些实施方案中，hc-ha/ptx3调节pax6信号传导。在一些实施方案中，hc-ha/ptx3调节notch信号传导。在一些实施方案中，hc-ha/ptx3通过调节notch配体、notch受体或其组合的表达调节notch信号传导。在一些实施方案中，notch配体包含notch 1、notch 2、notch 3、notch 4、jagged 1、jagged 2、jagged 3、dll1、dll2、dll3或dll4。在一些实施方案中，notch配体包含notch 2、notch 3、jagged 1或dll2。
[0109]
在一些实施方案中，hc-ha/ptx3调节多种信号传导通路。在一些实施方案中，hc-ha/ptx3调节sdf-1/cxcr、hif1、tgfβ、cd44icd、hes、pax6、notch信号传导或其组合。
[0110]
在某些实施方案中，本文提供了促进有需要的个体中血管生成或神经血管生成的方法，其中使组织与胎儿支持组织产品接触导致细胞重编程。在一些实施方案中，hc-ha/ptx3调节细胞重编程。在一些实施方案中，hc-ha/ptx3调节细胞聚集、细胞形状或细胞特异性标志物的表达。
[0111]
在一些实施方案中，hc-ha/ptx3将lnc重编程为祖细胞表型。在一些实施方案中，hc-ha/ptx3将lnc重编程为血管祖细胞表型。在一些实施方案中，hc-ha/ptx3调节flk-1、cd34、cd31、α-sma、pdgfrβ、ng2、pax6、p75ntr、musashi-1、sox2、巢蛋白、msx1、foxd3、flk-1、pdgfrβ、cd31或其组合的表达。在一些实施方案中，hc-ha/ptx3调节表达pax6。在一些实施方案中，足以重编程lnc的时间为至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、24小时、36小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、2周、3周或4周。
[0112]
在一些实施方案中，该方法还包括使组织与tgfβ1接触。在一些实施方案中，执行本文中所述的方法需要另外施用tgfβ1。在一些实施方案中，执行本文中所述的方法不需要另外施用tgfβ1。在一些实施方案中，该细胞同时与包含hc-ha/ptx3的胎儿支持组织产品和
tgfβ1接触。在一些实施方案中，该组织首先与包含hc-ha/ptx3的胎儿支持组织产品，然后与tgfβ1顺序接触。在一些实施方案中，该组织首先与tgfβ1，然后与包含hc-ha/ptx3的胎儿支持组织产品顺序接触。在一些实施方案中，tgfβ1以治疗有效量施用。在一些实施方案中，tgfβ1的治疗有效量是足以使包含hc-ha/ptx3的所述胎儿支持组织产品能够执行本文所述方法的tgfβ1的量。胎儿支持组织产品
[0113]
在一些实施方案中，胎儿支持组织产品是磨碎的胎儿支持组织、粉碎的胎儿支持组织、粉末的胎儿支持组织、微粉化的胎儿支持组织、分碎的胎儿支持组织、胎儿支持组织移植物、胎儿支持组织薄片、胎儿支持组织匀浆、胎儿支持组织提取物或其任何组合。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品是终端-灭菌的。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品是纯化的天然hc-ha/ptx3复合物、重构的hc-ha/ptx3或其组合。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品是粉碎的、粉末的或微粉化的胎儿支持组织。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品是分碎的胎儿支持组织。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品是胎儿支持组织的提取物。在一些实施方案中，胎儿支持组织是胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、胎盘、羊膜基质、羊膜胶质或其任何组合。
[0114]
在一些实施方案中，胎儿支持组织产品是脐带产品、羊膜产品或脐带羊膜产品。在一些实施方案中，脐带产品包含脐带羊膜和至少一些华顿氏胶。在一些实施方案中，脐带产品缺少脐带静脉和动脉。
[0115]
在一些实施方案中，胎儿支持组织产品是胎儿支持组织的提取物。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品是来自胎儿支持组织的纯化的天然hc-ha/ptx3复合物(nhc-ha/ptx3)。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品是重构的hc-ha/ptx3复合物(rhc-ha/ptx3)。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品基本上由nhc-ha/ptx3组成。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品基本上由rchc-ha/ptx3组成。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品是nhc-ha/ptx3和rchc-ha/ptx3的组合。在一些实施方案中，nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3还包含富含亮氨酸的小蛋白聚糖(slrp)。在一些实施方案中，slrp为i类、ii类或iii类slrp。在一些实施方案中，slrp选自i类slrp，例如核心蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖。在一些实施方案中，slrp选自ii类slrp，例如纤调蛋白聚糖、光蛋白聚糖、prelp(富含脯氨酸精氨酸末端的富含亮氨酸的蛋白)、角蛋白聚糖和骨粘附蛋白聚糖。在一些实施方案中，slrp选自iii类slrp，例如骺蛋白聚糖(epipycan)和骨甘蛋白聚糖(osteoglycin)。在一些实施方案中，slrp选自双库尼茨抑制剂、核心蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖和骨粘附蛋白聚糖。在一些实施方案中，slrp包含糖胺聚糖。在一些实施方案中，slrp包含硫酸角蛋白。
[0116]
胎儿支持组织产品的产生
[0117]
在一些实施方案中，胎儿支持组织产品源于脐带(uc)组织。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品源于羊膜(am)组织。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品源于脐带羊膜组织。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品包含：不包含静脉或动脉的分离的胎儿支持组织。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品包含：分离的胎儿支持组织，其不包含静脉或动脉、具有代谢活性的细胞、活动性hiv-1、活动性hiv-2、活动性htlv-1、活动性乙型肝炎、活动性丙型肝炎、活动性西尼罗病毒、活动性巨细胞病毒、活动性人传染性海绵状脑病，或者
活动性梅毒螺旋体(treponema pallidum)，其中胎儿支持组织产品的天然结构完整性在初始切取之后至少15天期间基本上得以保持。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品包含脐带羊膜和华顿氏胶。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品中hc-ha/ptx3复合物的生物活性基本上得以保持。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品中hc-ha/ptx3复合物的生物活性在至少15天期间基本上保持。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在初始切取之后至少20天期间基本上得以保持。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在初始切取之后至少25天期间基本上得以保持。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在初始切取之后至少30天期间基本上得以保持。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在初始切取之后至少35天期间基本上得以保持。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在初始切取之后至少40天期间基本上得以保持。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在初始切取之后至少45天期间基本上得以保持。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在初始切取之后至少50天期间基本上得以保持。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在初始切取之后至少55天期间基本上得以保持。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在初始切取之后至少60天期间基本上得以保持。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在初始切取之后至少90天期间基本上得以保持。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在初始切取之后至少180天期间基本上得以保持。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在初始切取之后至少1年期间基本上得以保持。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在初始切取之后至少2年期间基本上得以保持。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在初始切取之后至少3年期间基本上得以保持。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在初始切取之后至少4年期间基本上得以保持。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物和结构完整性在初始切取之后至少5年期间基本上得以保持。在一些实施方案中，胎儿支持组织获自人、非人灵长类动物、牛或猪。.
[0118]
在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品保持在低于0℃直至已确定供体和样品合格性。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品保持在0℃至-80℃直至已确定供体和样品合格性。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品储存在-80℃杀死存在于胎儿支持组织中的基本上所有细胞。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品储存在-80℃杀死存在于胎儿支持组织产品中的基本上所有细胞，同时相对于新鲜(即未冷冻的)胎儿支持组织维持或增加胎儿支持组织产品的生物活性(例如其抗炎、抗瘢痕、抗-抗原和抗粘附性质)。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品储存在-80℃导致存在于胎儿支持组织中的基本上所有细胞的代谢活性丧失。在一些实施方案中，胎儿支持组织被干燥。在一些实施方案中，胎儿支持组织未经脱水。
[0119]
对胎儿支持组织的处理
[0120]
在一些实施方案中，处理遵循良好组织操作规范(good tissue practices(gtp))进行以确保没有污染物被引入胎儿支持组织产品中。
[0121]
在一些实施方案中，利用fda许可的筛查测试对胎儿支持组织进行hiv-1、hiv-2、htlv-1、乙型和丙型肝炎、西尼罗病毒、巨细胞病毒、人传染性海绵状脑病(例如
creutzfeldt-jakob疾病)和梅毒螺旋体测试。在一些实施方案中，组织被hiv-1、hiv-2、htlv-1、乙型和丙型肝炎、西尼罗病毒或巨细胞病毒污染的任何指征导致对该组织样品的立即隔离检疫和后续破坏。在一些实施方案中，对供体的医疗记录进行风险因素检查，并且检查乙型肝炎、丙型肝炎或hiv感染的临床证据。
[0122]
在一些实施方案中，胎儿支持组织被冷冻。在一些实施方案中，胎儿支持组织未被冷冻。若胎儿支持组织未被冷冻，则对其按照紧接着下文所述进行处理。
[0123]
在一些实施方案中，将基本上全部血液从胎儿支持组织(例如来自存在于胎儿支持组织中的任何动脉和静脉，以及已渗入组织中的血液)除去。在一些实施方案中，在胎儿支持组织被冷冻之前将基本上全部血液除去。在一些实施方案中，未将血液从胎儿支持组织除去。在一些实施方案中，在胎儿支持组织被冷冻之前未将血液从胎儿支持组织除去。在一些实施方案中，在胎儿支持组织已被冷冻之后将血液基本上除去。
[0124]
在一些实施方案中，将胎儿支持组织在搅拌下用缓冲剂进行洗涤以除去过量的血液和组织。在一些实施方案中，将胎儿支持组织在搅拌下浸透缓冲剂以除去过量的血液和组织。
[0125]
在一些实施方案中，胎儿支持组织产品是胎儿支持组织移植物。在一些实施方案中，分离的胎儿支持组织用于产生胎儿支持组织移植物。在一些实施方案中，将胎儿支持组织(例如利用手术刀)切割成多个切片。切片的尺寸取决于源于胎儿支持组织的胎儿支持组织移植物的期望用途。在一些实施方案中，将切割的胎儿支持组织任选地用缓冲剂再次洗涤以进一步除去过量的血液和组织。
[0126]
脐带包含两个动脉(脐带动脉)和一个静脉(脐带静脉)。在一些实施方案中，从uc除去静脉和动脉。在某些实例中，静脉和动脉被包围(或悬浮或包埋)在华顿氏胶内。在一些实施方案中，静脉和动脉不从所述uc中除去。在某些实例中，静脉和动脉被包围(或悬浮或包埋)在华顿氏胶内。在一些实施方案中，将静脉和动脉除去同时除去华顿氏胶。
[0127]
胎儿支持组织产品的期望厚度决定如何处理所述胎儿支持组织产品。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的期望厚度决定了除去了多少华顿氏胶。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品与缓冲剂接触以促进华顿氏胶和ucam的分离。在一些实施方案中，使用剥离、旋磨器(rotoblator)(即附接至具有金刚石包被的钻头的钻的导管)、吸脂术、高压液体、刷子(例如，在高速下旋转的机械化刷子)或手术刀片除去华顿氏胶。在一些实施方案中，不除去华顿氏胶。在一些实施方案中，不除去华顿氏胶以及脐静脉和动脉。在一些实施方案中，不除去华顿氏胶，而除去脐静脉和动脉。
[0128]
在一些实施方案中，胎儿支持组织产品包含分离的脐带羊膜(ucam)。在某些实例中，包含蛋白、聚糖、蛋白-聚糖复合物(例如透明质酸与iαi的重链和ptx3的复合物)和促进组织修复的酶。例如，ucam基质含有生长因子、抗血管新生和抗炎蛋白，以及各种蛋白酶的天然抑制剂。在一些实施方案中，存在于ucam中的蛋白和酶扩散出uc并进入周围组织。在一些实施方案中，通过从uc中除去所有华顿氏胶和脐带血管并留下ucam而分离ucam。在获得基本上纯的ucam后，任选择地用缓冲剂洗涤ucam以除去过量的血液和组织。在一些实施方案中，ucam包括华顿氏胶。在一些实施方案中，ucam包括华顿氏胶以及脐静脉和动脉。在一些实施方案中，ucam包含华顿氏胶，而不包含脐静脉和动脉。
[0129]
在一些实施方案中，胎儿支持组织产品呈任何适合的形状(例如方形、圆形、三角
形、矩形)。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品从胎儿支持组织的薄片产生。在一些实施方案中，该薄片是扁平的。在一些实施方案中，该薄片是管状的。
[0130]
在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品(例如利用手术刀)切成多个切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约1.0cm
×
约0.25cm、0.5cm、0.75cm、1.0cm、2.0cm、3.0cm、4.0cm、5.0cm或6cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约2cm
×
约2cm、3cm、4cm、5cm或6cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约3cm
×
约3cm、4cm、5cm或6cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约4cm
×
约4cm、5cm或6cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约5cm
×
约5cm或6cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约6cm
×
约6cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约8cm
×
约1cm、2cm、3cm、4cm、5cm、6cm、7cm或8cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约10cm
×
约10cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约12cm
×
约10cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约15cm
×
约10cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约20cm
×
约10cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约25cm
×
约10cm的切片。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品分割成约30cm
×
约10cm的切片。
[0131]
在一些实施方案中，在搅拌下使所述胎儿支持组织产品与缓冲剂接触以除去基本上所有剩余的红细胞。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品与缓冲剂接触10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、40分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、18小时、24小时或大于24小时。在一些实施方案中，uc产品与缓冲剂接触2天、3天、4天、5天、6天、7天、1周、2周、3周、4周或大于4周。
[0132]
在一些实施方案中，胎儿支持组织产品包含一种药学上可接受的辅料、载体或其组合。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品被配制成非固体剂型。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品被配制成固体剂型。
[0133]
处理胎儿支持组织产品
[0134]
在一些实施方案中，分离的胎儿支持组织用于产生分碎的胎儿支持组织产品。本文中使用的“碎片(morsel)”是指已从较大块组织获得的尺寸范围为约0.1mm至约1.0cm长度、宽度或厚度的组织颗粒。本文中所述的“碎片”保留其所源于的组织的特征并且在检查时可鉴定为所述组织。本文中使用的术语“分碎的”、“分碎”和“分碎化”是指与本技术的“碎片”相关的动作。在一些实施方案中，将分碎的胎儿支持组织产品通过使分碎的胎儿支持组织与载体混合而进一步处理成溶液、混悬剂或乳剂。在一些实施方案中，分碎的胎儿支持组织产品被配制成溶液、混悬剂、糊剂、软膏、油乳剂、乳膏、洗剂、凝胶、贴剂、棒状剂、膜剂、涂剂或其组合。在一些实施方案中，使分碎的胎儿支持组织产品与贴剂或创伤敷料接触。在一些实施方案中，分碎的胎儿支持组织产品被配制用于肠胃注射剂，作为无菌溶液、混悬剂或乳剂施用，或者被配制用于吸入。
[0135]
在一些实施方案中，将羊膜组织和脐带组织以0.001:99.999w/w％至99.999:0.001w/w％中的任何比例的混合物通过利用本领域技术人员已知的任何分碎工具(例如组织研磨机、超声破碎器、珠磨式研磨机(bread beater)、冷冻机/磨碎机、混合器、研钵/杵、转子-定子、厨房用切碎器、磨碎器、尺子和手术刀)从新鲜或冷冻的组织进行分碎，从而获得尺寸范围为约0.1mm至约1.0cm长度、宽度或厚度的碎片。在一些实施方案中，将所得的碎
片均质化而产生尺寸一致的碎片。在一些实施方案中，将所得的碎片湿法使用，通过本领域技术人员已知的任何方法(例如离心或冻干)进行部分脱水或基本上脱水。在一些实施方案中，将所得的胎儿支持组织产品立即使用，或者储存在本领域技术人员已知的任何类型的容器(例如袋子、罐子、瓶子、管、安瓿和预填充的注射器)中以供后续使用。在一些实施方案中，将分碎的胎儿支持组织产品通过本领域技术人员已知的任何方法(例如γ辐射)进行灭菌。
[0136]
在一些实施方案中，分离的胎儿支持组织用于产生粉碎的胎儿支持组织产品。本文中使用的“粉碎的胎儿支持组织产品”意指包含已被破碎(或解离)的组织的胎儿支持组织产品。在一些实施方案中，粉碎的胎儿支持组织产品是干粉。在一些实施方案中，将粉碎的胎儿支持组织产品通过使胎儿支持组织粉末与载体混合而进一步处理成溶液、混悬剂或乳剂。在一些实施方案中，粉碎的胎儿支持组织产品被配制成溶液、混悬剂、糊剂、软膏、油乳剂、乳膏、洗剂、凝胶、贴剂、棒状剂、膜剂、涂剂或其组合。在一些实施方案中，使粉碎的胎儿支持组织产品与贴剂或创伤敷料接触。在一些实施方案中，粉碎的胎儿支持组织产品被配制成用于肠胃注射剂，作为无菌溶液、混悬剂或乳剂施用，或者用于吸入。
[0137]
在一些实施方案中，将分离的胎儿支持组织通过任何适合的方法进行粉碎。在一些实施方案中，将分离的胎儿支持组织通过使用粉碎机(例如bessman组织粉碎机、biospec生物粉碎机，或者covaris cryoprep)进行粉碎。在一些实施方案中，将分离的胎儿支持组织通过使用组织研磨机(例如potter-elvehjem研磨机或wheaton顶置式搅拌机)进行粉碎。在一些实施方案中，将分离的胎儿支持组织通过使用超声破碎器进行粉碎。在一些实施方案中，将分离的胎儿支持组织通过使用珠磨式研磨机进行粉碎。在一些实施方案中，将分离的胎儿支持组织通过使用冷冻机/磨粉机(例如sampleprep冷冻机/磨粉机或retch球磨机)进行粉碎。在一些实施方案中，将分离的胎儿支持组织通过使用杵和研钵进行粉碎。在一些实施方案中，将分离的胎儿支持组织通过手动使用杵和研钵进行粉碎。
[0138]
在一些实施方案中，胎儿支持组织产品是来自胎儿支持组织的提取物。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品是hc-ha/ptx3复合物。在一些实施方案中，hc-ha/ptx3复合物是nhc-ha/ptx3、rchc-ha/ptx3或其组合。在一些实施方案中，hc-ha/ptx3复合物通过任何合适的方法进行纯化。
[0139]
在一些实施方案中，hc-ha/ptx3复合物通过离心(例如超速离心、梯度离心)、色谱法(例如离子交换色谱、亲和色谱、尺寸排阻色谱和羟基磷灰石色谱)、凝胶过滤或差分溶解度、乙醇沉淀，或者通过任何其他可供用于纯化蛋白的技术进行纯化(参见，例如scopes，protein purification principles and practice第2版，springer-verlag,new york,1987；higgins,s.j.和hames,b.d.(编)，protein expression:a practical approach,oxford univ press,1999；以及deutscher,m.p.、simon,m.i.、abelson,j.n.(编)，guide to protein purification:methods in enzymology(methods in enzymology series,第182卷),academic press,1997，全部通过引用并入本文)。
[0140]
在一些实施方案中，nhc-ha/ptx3分离自提取物。在一些实施方案中，该提取物从羊膜提取物制得。在一些实施方案中，该提取物从脐带提取物制得。在一些实施方案中，脐带提取物包含脐带基质和/或华顿氏胶。在一些实施方案中，nhc-ha/ptx3复合物被包含在通过超速离心制得的提取物中。在一些实施方案中，nhc-ha/ptx3复合物被包含在利用
cscl/4-6m胍hcl梯度通过超速离心制得的提取物中。在一些实施方案中，该提取物通过至少2轮超速离心制得。在一些实施方案中，该提取物通过多于2轮超速离心制得(即nhc-ha/ptx3 2
nd
)。在一些实施方案中，该提取物通过至少4轮超速离心制得(即nhc-ha/ptx3 4
th
)。在一些实施方案中，nhc-ha/ptx3复合物包含富含亮氨酸的小蛋白聚糖。在一些实施方案中，nhc-ha/ptx3复合物包含hc1、ha、ptx3和/或富含亮氨酸的小蛋白聚糖。
[0141]
低温保存
[0142]
在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品冷冻以便进行低温保存。在一些实施方案中，低温保存胎儿支持组织产品未破坏胎儿支持组织细胞外基质的完整性。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品暴露于液态气体(例如液氮或液氢)。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品暴露于液氮。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品没有接触液态气体。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品置于容器中并且使该容器与液态气体接触。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品暴露于液态气体直至该胎儿支持组织产品被冷冻。
[0143]
冻干
[0144]
在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品冻干。在一些实施方案中，在进行分碎、粉碎、低温保存、灭菌或纯化之前，将胎儿支持组织产品冻干。在一些实施方案中，在进行分碎、粉碎、低温保存、灭菌或纯化之后，将胎儿支持组织产品冻干。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品在冷冻之后进行冻干。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品在通过任何适合的方法(例如暴露于液态气体、置于冷冻机中)冷冻之后进行冻干。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品通过暴露于低于约0℃的温度进行冷冻。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品通过暴露于低于约-20℃的温度进行冷冻。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品通过暴露于低于约-40℃的温度进行冷冻。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品通过暴露于低于约-50℃的温度进行冷冻。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品通过暴露于低于约-60℃的温度进行冷冻。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品通过暴露于低于约-70℃的温度进行冷冻。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品通过暴露于低于约-75℃的温度进行冷冻。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品通过暴露于低于约-80℃的温度进行冷冻。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品通过暴露于低于约-90℃的温度进行冷冻。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品通过暴露于低于约-100℃的温度进行冷冻。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品通过暴露于液态气体进行冷冻。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品置于冻干装置的真空室中直至已除去全部或基本上全部液体(例如水)。在一些实施方案中，低温保存的胎儿支持组织产品是冻干的。
[0145]
灭菌
[0146]
在一些实施方案中，对胎儿支持组织产品通过任何适合的(例如医学上可接受的)方法进行终端灭菌。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品是冻干的胎儿支持组织产品。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品暴露于γ辐射足以对该胎儿支持组织产品灭菌的时间段。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品暴露于25kgy的γ辐射足以对该胎儿支持组织产品灭菌的时间段。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品暴露于电子束足以对该胎儿支持组织产品灭菌的时间段。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品暴露于x射线辐射
足以对该胎儿支持组织产品进灭菌的时间段。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品暴露于uv辐射足以对该胎儿支持组织产品灭菌的时间段。
[0147]
再水化
[0148]
在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品部分地或完全地再水化。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品通过使胎儿支持组织产品与缓冲剂或与水接触进行再水化。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品与等渗缓冲剂接触。在一些实施方案中，使胎儿支持组织与盐水接触。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品与pbs接触。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品与林格氏液(ringer’s solution)接触。在一些实施方案中，该林格氏液是乳酸林格氏盐水。在一些实施方案中，该胎儿支持组织产品与哈特曼溶液(hartmann’s solution)接触。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品与tris缓冲盐水接触。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品与hepes缓冲盐水；50％dmem 50％甘油；10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％甘油；和/或10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％丙二醇接触。
[0149]
在一些实施方案中，胎儿支持组织产品与缓冲剂接触10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、40分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、18小时、24小时或大于24小时。在一些实施方案中，uc产品与缓冲剂接触2天、3天、4天、5天、6天、7天、1周、2周、3周、4周或大于4周。
[0150]
在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品储存以供后续使用。在一些实施方案中，储存胎儿支持组织产品未破坏胎儿支持组织细胞外基质的完整性。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品冻干。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品储存在任何适合的储存介质中。
[0151]
在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品任选地与基材(即支持性背衬)接触。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品没有与基材接触。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品取向为使得胎儿支持组织产品与基材接触。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品取向为使得基质与基材接触。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品取向为使得上皮侧与基材接触。
[0152]
在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品附接至基材。在一些实施方案中，基材是硝酸纤维素纸(nc)。在一些实施方案中，基材是尼龙膜(nm)。在一些实施方案中，基材是聚醚砜膜(pes)。hc-ha/ptx3组合物
[0153]
在一些实施方案中，胎儿支持组织产品是天然hc-ha/ptx3(nhc-ha/ptx3)复合物、重构的hc-ha/ptx3(rchc-ha/ptx3)复合物或其组合。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品包含hc-ha/ptx3和药物辅料。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品基本上由nhc-ha/ptx3复合物或rchc-ha/ptx3复合物组成。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品包含药学上可接受的稀释剂、辅料、溶媒或载体。在一些实施方案中，适当的制剂取决于所选择的施用途径。
[0154]
在一些实施方案中，nhc-ha/ptx3分离自提取物。在一些实施方案中，该提取物从羊膜提取物制得。在一些实施方案中，该提取物从脐带提取物制得。在一些实施方案中，脐
带提取物包含脐带基质和/或华顿氏胶。在一些实施方案中，nhc-ha/ptx3复合物被包含在通过超速离心制得的提取物中。在一些实施方案中，nhc-ha/ptx3复合物包含富含亮氨酸的小蛋白聚糖。在一些实施方案中，nhc-ha/ptx3复合物包含hc1、ha、ptx3和/或富含亮氨酸的小蛋白聚糖(slrp)。
[0155]
在一些实施方案中，对组织提取物进行超速离心。在一些实施方案中，超速离心用于纯化nhc-ha/ptx3可溶性复合物。在一些实施方案中，nhc-ha可溶性复合物包含富含亮氨酸的小蛋白聚糖。在一些实施方案中，nhc-ha/ptx3可溶性复合物包含hc1、ha、ptx3和/或富含亮氨酸的小蛋白聚糖。
[0156]
在一些实施方案中，nhc-ha/ptx3复合物通过免疫亲和层析、亲和层析或其组合进行纯化。在一些实施方案中，产生抗hc1抗体、抗hc2抗体或两者并将其固定于固定支架。在一些实施方案中，hc-ha复合物(例如通过(a)抗hc1抗体和hc1、(b)抗hc2抗体和hc2、(c)抗ptx抗体和ptx3、(d)抗slrp抗体和slrp或(e)其任何组合的相互作用)结合抗体。在一些实施方案中，产生habp并将其固定于固定支架。
[0157]
在一些实施方案中，nhc-ha/ptx3复合物是利用一种或更多种抗体从本文所述的不溶性级分进行纯化。在一些实施方案中，nhc-ha/ptx3复合物是利用抗slrp抗体从本文所述的不溶性级分进行纯化。
[0158]
在一些实施方案中，nhc-ha/ptx3复合物是从本文所述的可溶性级分进行纯化。在一些实施方案中，nhc-ha/ptx3复合物是利用抗ptx3抗体从本文所述的可溶性级分进行纯化。
[0159]
在一些实施方案中，nhc-ha/ptx3复合物包含富含亮氨酸的小蛋白聚糖(slrp)。在一些实施方案中，nhc-ha/ptx3复合物包含i类、ii类或iii类slrp。在一些实施方案中，富含亮氨酸的小蛋白聚糖选自i类slrp，例如核心蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖。在一些实施方案中，富含亮氨酸的小蛋白聚糖选自ii类slrp，例如纤调蛋白聚糖、光蛋白聚糖、prelp(富含脯氨酸精氨酸末端的富含亮氨酸的蛋白)、角蛋白聚糖和骨粘附蛋白聚糖。在一些实施方案中，富含亮氨酸的小蛋白聚糖选自iii类slrp，例如骺蛋白聚糖和骨甘蛋白聚糖)。在一些实施方案中，富含亮氨酸的小蛋白聚糖选自双库尼茨抑制剂、核心蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖和骨粘附蛋白聚糖。在一些实施方案中，富含亮氨酸的小蛋白包含糖胺聚糖。在一些实施方案中，富含亮氨酸的小蛋白聚糖包含硫酸角质素。
[0160]
在一些实施方案中，产生重构的hc-ha/ptx3复合物的方法包括：(a)使高分子量透明质酸(hmw ha)与iαi和tsg-6接触而形成与tsg-6预结合的hc-ha复合物，以及(b)在适合的条件下使hc-ha复合物与正五聚蛋白3(ptx3)接触而形成rchc-ha/ptx3复合物。本文中提供了通过这种方法制得的rchc-ha/ptx3复合物。在一些实施方案中，iαi的hc1与ha形成共价键。在一些实施方案中，该方法的步骤(a)和(b)按照顺序依次进行。在一些实施方案中，该方法包括使与tsg-6预结合的hc-ha复合物与ptx3接触。在一些实施方案中，纯化的rchc-ha/ptx3复合物通过以下方法体外产生，该方法包括(a)使高分子量乙酰透明质酸(hmw ha)与(i)正五聚蛋白3(ptx3)、(ii)包含重链1(hc1)和重链2(hc2)的间-α-抑制剂(iai)蛋白和(iii)肿瘤坏死因子α刺激的基因6(tsg-6)接触，以形成包含hmw ha、hc1、hc2和ptx3的rchc-ha/ptx3复合物；和(b)从不需要的组分纯化rchc-ha/ptx3复合物。在一些实施方案案中，纯化的nhc-ha/ptx3不包含间-α-抑制剂(iai)蛋白重链2(hc2)。在一些实施方案中，纯
化的rchc-ha/ptx3包含间-α-抑制剂(iai)蛋白，其包含重链2(hc2)。在一些实施方案中，rchc-ha/ptx3包含ha、hc1、hc2和ptx3。在一些实施方案中，rchc-ha/ptx3包含ha、hc1、hc2、ptx3和tsg-6。
[0161]
在一些实施方案中，该方法包括在适合的条件下首先使高分子量透明质酸(hmw ha)与正五聚蛋白3(ptx3)接触而形成ptx3/ha复合物，然后使该ptx3/ha复合物与iαi和tsg-6接触。
[0162]
在一些实施方案中，使iαi蛋白和tsg-6蛋白接触而以约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1或20:1(iαi:tsg-6)的摩尔比复合。在一些实施方案中，iαi:tsg-6的比值范围是约1:1至约20:1，例如约1:1至约10:1、例如约1:1至5约:1、例如约1:1至约3:1。在一些实施方案中，iαi:tsg-6的比值是3:1或更高。在一些实施方案中，iαi:tsg-6的比值是3:1。
[0163]
在一些实施方案中，该方法的步骤(a)和(b)按照顺序依次进行。在一些实施方案中，该方法包括使ptx3/ha复合物与iαi和tsg-6接触。
[0164]
在一些实施方案中，药物组合物进一步包含至少一种药学上可接受的载体。在一些实施方案中，药物组合物进一步包含佐剂、辅料、防腐剂、延迟吸收剂、填料、粘结剂、吸附剂、缓冲剂和/或增溶剂。配制成包含本文提供的hc-ha/ptx3复合物的示例性药物组合物包括但不限于：凝胶、溶液、混悬剂、乳剂、糖浆、颗粒、粉末、匀浆、软膏、片剂、胶囊、丸剂、膏剂、乳膏、洗剂、贴剂、棒状剂、膜剂、涂剂、气雾剂或其组合。在一些实施方案中，包含hc-ha/ptx3的胎儿支持组织产品是移植物或薄片。
[0165]
剂型
[0166]
下面提供胎儿支持组织产品的剂型。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品包含hc-ha/ptx3复合物。在一些实施方案中，hc-ha/ptx3复合物是从胎儿支持组织纯化的天然复合物，或重构的hc-ha/ptx3复合物或其组合。
[0167]
在一些实施方案中，胎儿支持组织产品作为水性混悬剂施用。在一些实施方案中，水性混悬剂包含水、林格氏液和/或生理盐溶液。在一些实施方案中，林格氏液是乳酸林格氏盐水。在一些实施方案中，水性混悬剂包含甜味剂或调味剂、着色物或染料，以及若需要，乳化剂或助悬剂，以及稀释剂水、乙醇、丙二醇、甘油，或者其组合。在一些实施方案中，水性混悬剂包含助悬剂。在一些实施方案中，水性混悬剂包含：羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基-纤维素、海藻酸钠、聚乙烯基-吡咯烷酮、黄蓍胶和/或阿拉伯树胶。在一些实施方案中，水性混悬剂包含分散剂或润湿剂。在一些实施方案中，水性混悬剂包含天然存在的磷脂例如卵磷脂，或者氧化烯与脂肪酸的缩合产物例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或者氧化乙烯与长链脂肪族醇的缩合产物例如十七乙烯-氧基鲸蜡醇，或者氧化乙烯与从脂肪酸和己糖醇而得的偏酯的缩合产物例如聚氧基乙烯山梨醇单油酸酯，或者氧化乙烯与从脂肪酸和己糖醇酐而得的偏酯的缩合产物例如聚乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。在一些实施方案中，水性混悬剂包含防腐剂。在一些实施方案中，水性混悬剂包含乙基对羟基苯甲酸酯或者正丙基对羟基苯甲酸酯。在一些实施方案中，水性混悬剂包含甜味剂。在一些实施方案中，水性混悬剂包含蔗糖、糖精或阿斯巴甜。
[0168]
在一些实施方案中，胎儿支持组织产品作为油性混悬剂施用。在一些实施方案中，油性混悬剂通过使活性成分悬浮在植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)中，或者
在矿物油(例如液体石蜡)中进行配制。在一些实施方案中，油性混悬剂包含增稠剂(例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇)。在一些实施方案中，油性混悬剂包含甜味剂(例如上述那些)。在一些实施方案中，油性混悬剂包含抗氧化剂(例如丁羟基茴香醚或α-生育酚)。
[0169]
在一些实施方案中，胎儿支持组织产品用于肠胃外注射(例如，通过注射或输注，包括动脉内、心内、皮内、十二指肠内、髓内、肌内、骨内、腹腔、鞘内、血管内、静脉内、玻璃体内、硬膜外和/或皮下)。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品作为无菌溶液、混悬剂或乳剂施用。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品被配制用于吸入。
[0170]
在一些实施方案中，用于注射的配方剂以单位剂型存在，例如在安瓿中或在多剂量容器中，添加有防腐剂。
[0171]
在一些实施方案中，包含hc-ha/ptx3复合物的胎儿支持组织产品被配制用于外用施用。外用制剂包括但不限于，软膏、乳膏、洗剂、溶液、糊剂、凝胶、膜剂、棒状剂、脂质体、纳米颗粒。在一些实施方案中，外用制剂通过使用贴片、绷带或创伤敷料施用。
[0172]
在一些实施方案中，包含hc-ha/ptx3复合物的胎儿支持组织产品被配制为固体、交联凝胶或脂质体形式的组合物。在一些实施方案中，包含hc-ha/ptx3复合物的胎儿支持组织产品被配制为不溶性交联水凝胶。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品被配制成凝胶。
[0173]
在一些实施方案中，外用制剂包含胶凝剂(或增稠剂)。适合的胶凝剂包括但不限于：纤维素、纤维素衍生物、纤维素醚(例如羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素)、瓜尔胶、黄原胶、刺槐豆胶、海藻酸盐(例如海藻酸)、硅酸盐、淀粉、黄蓍胶、羧基乙烯基聚合物、卡拉胶、石蜡、凡士林、阿拉伯树胶(阿拉伯树胶)、琼脂、硅酸镁铝、海藻酸钠、硬脂酸钠、墨角藻、皂土、卡波姆、卡拉胶、聚羧乙烯、黄原胶、纤维素、微晶纤维素(mcc)、角豆胶、角叉菜提取物(chondrus)、右旋糖、红藻胶、明胶、茄替胶(ghatti gum)、瓜尔胶、锂蒙脱石、乳糖、蔗糖、麦芽糖糊精、甘露醇、山梨醇、蜂蜜、玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、刺梧桐树胶、聚乙二醇(例如peg 200-4500)、黄蓍胶、乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、乙基甲基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、氧化聚明胶、果胶、聚明胶肽、聚维酮、碳酸丙烯酯、甲基乙烯基醚/马来酸酐共聚物(pvm/ma)、聚(甲基丙烯酸甲氧基乙基酯)、聚(甲基丙烯酸甲氧基乙氧基乙基酯)、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素(hpmc)、羧甲基纤维素钠(cmc)、二氧化硅、聚乙烯基吡咯烷酮(pvp:聚维酮)，或其组合。
[0174]
在一些实施方案中，本文公开的外用制剂包含润肤剂。润肤剂包括但不限于：蓖麻油酯、可可脂酯、红花油酯、棉花籽油酯、玉米油酯、橄榄油酯、鱼肝油酯、杏仁油酯、鳄梨油酯、棕榈油酯、芝麻油酯、角鲨烯酯、kikui油酯、大豆油酯、乙酰化甘油单酸酯、乙氧基甘油单硬脂酸酯、月桂酸己酯、月桂酸异己酯、棕榈酸异己酯、棕榈酸异丙酯、棕榈酸甲酯、油酸癸酯、油酸异癸酯、硬脂酸十六基酯、硬脂酸癸酯、异硬脂酸异丙酯、异硬脂酸甲酯、己二酸二异丙酯、己二酸二异己酯、己二酸二己基癸基酯、癸二酸二异丙酯、乳酸月桂酯、乳酸十四烷酯、乳酸十六烷酯、肉豆酸油酯、硬脂酸油酯和油酸油酯、壬酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、异硬脂酸、羟基硬脂酸、油酸、亚油酸、蓖麻油酸、花生酸、山嵛酸、芥酸、月桂醇、十四烷醇、鲸蜡醇、十六烷醇、硬脂醇、异硬脂醇、羟基硬脂醇、油醇、蓖麻油醇、山嵛醇、芥
醇、2-辛基十二烷基醇、羊毛脂和羊毛脂衍生物、蜂蜡、鲸脑、肉豆蔻酰肉豆蔻酸酯、硬脂酰硬脂酸酯、巴西棕榈蜡、烛树蜡、卵磷脂和胆固醇。
[0175]
在一些实施方案中，包含hc-ha/ptx3复合物的胎儿组织支持产品用一种或更多种天然聚合物配制。在一些实施方案中，包含hc-ha/ptx3复合物的胎儿组织支持产品天然聚合物配制，该天然聚合物是纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、角蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白原、透明质酸、硫酸肝素、硫酸软骨素。在一些实施方案中，包含hc-ha/ptx3复合物的胎儿组织支持产品用聚合物凝胶配制，该聚合物凝胶由天然聚合物配制。在一些实施方案中，包含hc-ha/ptx3复合物的胎儿组织支持产品用聚合物凝胶配制，该聚合物凝胶由天然聚合物配制，该天然聚合物例如但不限于：纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、角蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白原、透明质酸、硫酸肝素、硫酸软骨素及其组合。
[0176]
在一些实施方案中，包含hc-ha/ptx3复合物的胎儿组织支持产品被配制用于向眼或其相关组织施用。适合于向眼施用的制剂包括但不限于：溶液、混悬剂(例如水性混悬剂)、软膏、凝胶、乳膏、脂质体、泡囊、药质体、纳米颗粒，或者其组合。在一些实施方案中，用于向眼外用施用的包含hc-ha/ptx3复合物的胎儿组织支持产品通过喷施、洗涤或其组合施用。在一些实施方案中，包含hc-ha/ptx3复合物的胎儿组织支持产品通过可注射的贮库制剂向眼施用。
[0177]
本文中使用的“贮库制剂”是植入眼或其相关组织(例如巩膜)中的(例如皮下、肌内、玻璃体内或结膜内)控释制剂。在一些实施方案中，贮库制剂通过在生物可降解的聚合物中形成包含hc-ha/ptx3复合物的胎儿组织支持产品的微囊化的基质(也称为微胶囊化的基质)进行配制。在一些实施方案中，贮库制剂通过将包含hc-ha/ptx3复合物的胎儿组织支持产品包封在脂质体或微乳剂中进行配制。
[0178]
用于向眼施用的制剂具有眼科上可接受的渗透性。在某些实例中，泪液具有与0.9％氯化钠溶液相等的等渗值。在一些实施方案中，约0.6％至约1.8％氯化钠等效的等渗值适合于向眼外用施用。在一些实施方案中，本文公开的向眼施用的制剂具有约200至约600mosm/l的渗量。在一些实施方案中，本文公开的向眼施用的制剂是低渗的，因此需要添加任何适合的物质以达到适当的渗透性范围。眼科上可接受的调节渗透性的物质包括但不限于：氯化钠、氯化钾、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和硫酸铵。
[0179]
用于向眼施用的制剂具有眼科上可接受的澄清度。眼科上可接受的澄清化剂的实例包括但不限于聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80或其组合。
[0180]
在一些实施方案中，用于向眼施用的制剂包含眼科上可接受的粘度增强剂。在一些实施方案中，粘度增强剂增加本文公开的制剂保留在眼中的时间。在一些实施方案中，增加本文公开的制剂保留在眼中的时间允许更大的药物吸收和效果。粘膜粘附性聚合物的非限制性实例包括羧甲基纤维素、卡波姆(丙烯酸聚合物)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚丙烯酰胺、聚卡波非、丙烯酸/丙烯酸丁酯共聚物、海藻酸钠和右旋糖。
[0181]
在一些实施方案中，用于向眼施用的制剂被施用或递送至眼的后段(例如视网膜、脉络膜、玻璃质和视神经)。在一些实施方案中，用于递送至眼的后部的本文公开的用于向眼使用的外用制剂包含增溶剂，例如硫酸葡聚糖和/或环糊精。用于一些实施方案中的硫酸葡聚糖包括但不限于：硫酸右旋糖、硫酸环糊精和β-1,3-硫酸葡聚糖、其天然的和衍生物，或者任何化合物，该化合物暂时地结合到并被保留在包含成纤维细胞生长因子(fgf)的组
织，改善药物的稳定性和/或溶解性，和/或改善本文公开的用于向眼施用的制剂的穿透性和眼部吸收。用于一些实施方案中作为增溶剂的环糊精衍生物包括但不限于：α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、羟乙基β-环糊精、羟丙基γ-环糊精、羟丙基β-环糊精、硫酸α-环糊精、硫酸β-环糊精、磺基丁基醚β-环糊精。
[0182]
剂量
[0183]
药物组合物施用的量部分地取决于被治疗的个体。在向人受试者施用药物组合物的情况下，每日剂量将通常由处方医师决定，剂量一般根据以下项而改变：个体的年龄、性别、膳食、体重、总体健康和反应、个体的症状的严重程度、正被治疗的确切疾病或病况、正被治疗的疾病或病况的严重程度、施用时间、施用途径、组合物处置、排泄速度、药物联用，以及处方医师的判断。
[0184]
在一些实施方案中，包含hc-ha/ptx3复合物的胎儿支持组织产品的剂量为约0.001至约1000mg/kg体重/天。在一些实施方案中，包含hc-ha/ptx3复合物的胎儿支持组织产品的量的范围为约0.5至约50mg/kg/天。在一些实施方案中，本文公开的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3复合物的量为约0.001至约7g/天。在一些实施方案中，包含hc-ha/ptx3复合物的胎儿支持组织产品的量为约0.01至约7g/天。在一些实施方案中，本文公开的包含hc-ha/ptx3复合物的胎儿支持组织产品的量为约0.02至约5g/天。在一些实施方案中，包含hc-ha/ptx3复合物的胎儿支持组织产品的量为约0.05至约2.5g/天。在一些实施方案中，包含hc-ha/ptx3复合物的胎儿支持组织产品的量为约0.1至约1g/天。
[0185]
在一些实施方案中，在组织中不需要的变化发生之前、期间或之后施用包含hc-ha/ptx3复合物的制胎儿支持组织产品。在一些实施方案中，在疾病或病况发生之前、期间或之后与联合治疗一起施用包含hc-ha/ptx3复合物的胎儿支持组织产品。在一些实施方案中，包含本文公开的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3的组合物的施用时间改变。因此，在一些实例中，包含hc-ha/ptx3复合物的胎儿支持组织产品用作预防，并且向倾向于在组织中发生不需要的变化的受试者连续地施用以防止组织中不需要的变化的发生。在一些实施方案中，在不需要的变化开始期间或之后尽快向受试者施用包含hc-ha/ptx3复合物的胎儿支持组织产品。在一些实施方案中，在不需要的变化开始的最初48小时内，优选地在症状开始的最初48小时内，更优选地在症状开始的最初6小时内，最优选地在症状开始的3小时内，开始施用包含hc-ha/ptx3复合物的胎儿支持组织产品。在一些实施方案中，初始施用经由任何可行的途径，例如，静脉内注射、推注、在5分钟至约5小时期间输注、丸剂、胶囊、透皮贴片、经颊递送，或者其组合。优选地，在检测到或者疑似不需要的变化开始之后尽快施用包含hc-ha/ptx3复合物的胎儿支持组织产品，并且持续治疗所需的时长，例如，约1个月至约3个月。在一些实施方案中，治疗时长因每名受试者而异，并且时长利用已知的标准确定。在一些实施方案中，在至少2周，优选约1个月至约5年，更优选约1个月至约3年期间，施用包含hc-ha/ptx3复合物的胎儿支持组织产品或含有复合物的制剂。
[0186]
在一些实施方案中，包含hc-ha/ptx3复合物的胎儿支持组织产品以单剂量施用，每天一次。在一些实施方案中，包含hc-ha/ptx3复合物的胎儿支持组织产品以多剂量施用，每天多于一次。在一些实施方案中，包含hc-ha/ptx3复合物的胎儿支持组织产品每天施用两次。在一些实施方案中，包含hc-ha/ptx3复合物的胎儿支持组织产品每天施用三次。在一些实施方案中，nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3复合物每天施用四次。在一些实施方案中，包
含hc-ha/ptx3复合物的胎儿支持组织产品每天施用多于四次。
[0187]
在个体的状况没有改善的情况下，根据医生的判断，长期(即在延长的时间段期间，包括个体生命的整个持续时间)施用包含hc-ha/ptx3复合物的胎儿支持组织产品，以便改善或以其他方式控制或限制个体的疾病或病况的症状。
[0188]
在一些实施方案中，包含hc-ha/ptx3复合物的胎儿支持组织产品被包装为制品，其包含包装材料、有效预防和/或治疗疾病或病况的药物组合物，以及标签，该标签说明该药物组合物应用于将由于该疾病或病况而具有不需要的变化的组织中的成纤维细胞重编程。在一些实施方案中，药物组合物被包装成单位剂型，包含用于单剂量或多剂量的药物组合物量。在一些实施方案中，包装的组合物包含药物组合物的冻干粉末，其在施用之前(例如用水或盐水)进行重构。
[0189]
医疗器械和生物材料组合物
[0190]
在一些实施方案中，包含hc-ha/ptx3复合物的胎儿支持组织产品直接组装在可植入医疗器械的表面上或配制为可植入医疗器械的涂层。在一些实施方案中，nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3复合物直接组装在可植入医疗器械或其部分的表面上。
[0191]
示例性可移植的医疗器械包括但不限于：人工关节、矫形装置、骨植入物、隐形眼镜、缝合线、手术吻合器、手术夹具、导管、血管成形术球囊、传感器、手术器械、电极、针、注射器、创伤引流、分流器、尿道插件、金属或塑料植入物、心脏瓣膜、人工器官、叠缝托圈、瓣膜成形术环、导丝、k-丝或denham钉、支架、支架移植物、血管移植物、起搏器、丸剂、薄镜片、医用管线、输液套管、可植入式除颤器、神经刺激器、葡萄糖传感器、脑脊髓液分流器、可植入式药物泵、脊柱笼、人工椎间盘、眼部植入物、耳蜗植入物、乳房植入物、髓核置换装置、耳管、人工晶状体、药物递送系统、微颗粒、纳米颗粒和微胶囊。
[0192]
在一些实施方案中，将包含hc-ha/ptx3复合物的胎儿组织支持产品直接组装在用于递送生物材料(例如干细胞或胰岛素产生细胞)的支架、微粒、微胶囊或微载体上。在一些实施方案中，包含hc-ha/ptx3复合物的胎儿组织支持产品附接于微胶囊或直接组装在一微胶囊上。实施例实施例1：hc-ha/ptx3上角膜缘微环境细胞(lnc)与人脐静脉内皮细胞(huvec)的共培养防止huvec凋亡
[0193]
先前已经证明，可溶性hc-ha/ptx3通过阻断cd44 ab 24h可以独立地抑制huvec活力，抑制huvec的细胞增殖并减少huvec的细胞死亡。还报道了含有间充质波形蛋白 来自角膜缘的细胞的胶原酶分离的团状物异源表达esc和巢蛋白。这种lnc能够在包被的matrigel
tm
(mg)上在mescm中进一步扩增超过12代。p4 lnc通过msc三系分化维持表型，该表型表达血管周细胞标志物(周细胞-ec)标志物(例如，flk-1、cd34、cd31、α-sma、pdgfrβ和ng2)。当在lnc存在下将hc-ha/ptx3加入角膜缘上皮细胞(lepc)时，细胞增殖减少，具有静止标志物核bmi-1。尚不清楚加入具有周细胞表型的lnc是否可以在hc-ha/ptx3存在下防止huvec细胞死亡。
[0194]
材料和方法
[0195]
细胞：gfp huvec(p3)购自neuromics(目录号gf01)。这些细胞分离自正常的人脐静脉，并在第1代用gfp-慢病毒颗粒转染。将嘌呤霉素抗性gfp huvec保持在含有5％fbs和
生长补充剂的内皮细胞生长培养基中纤连蛋白包被的溶液上，直至第3代。当达到～70％-90％汇合时，每三天按1:3传代细胞。传代3-8的细胞用于所有实验。
[0196]
lnc(p2-p5)在含有4ng/ml bfgf和10ng/ml lif的mescm中在包被有5％matrigel
tm
的6孔塑料上扩增。
[0197]
共培养：将共2
×
104个/96孔的gfp-huvec、lnc或gfp-huvec/lnc(1:1)1重悬于含10ng/ml vegf的egm培养基中，在包被的纤连蛋白包被混合物(athena，0407)上。内皮基础培养基-2(ebm-2)含有2％fbs、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、egf、胰岛素样生长因子-1(igf-1)、血管内皮生长因子(vegf)、氢化可的松、抗坏血酸、肝素、庆大霉素和两性霉素b(lonza)。在接种期间或之前，每96孔加入2-2.5μg(25μg/ml)的可溶性或固定的hc-ha/ptx3，并在37℃下培养48h。对于血管形成，将细胞以105个细胞/cm2的密度接种在matrigel
tm
的表面上，其通过在使用前将50μl的100％matrigel
tm
加入24孔板中30分钟(min)进行制备，并且在egm2中培养以引发如报道的血管样网络。p4/3d细胞或单独的huvec也以与对照相同的密度接种。实验重复进行三次。
[0198]
细胞死亡测定(gfp-认证的凋亡/坏死检测试剂盒)：使用细胞死亡测定试剂盒进行活细胞成像并且确定合适的终止时间。在细胞死亡测定之前至少4小时(h)加入阳性对照(凋亡诱导剂和坏死剂)，并且按照生产商建议的方案终止细胞培养。在实际实验前24h，基于在包被纤连蛋白的96板上lnc或gfp huvec中的阳性和阴性对照的图像可视化测试预试验(表1；图1)。使用终浓度为2μm(1:500)的凋亡诱导剂(星形孢菌素)。阴性对照用dmso处理。记录五个代表的图像场。对gfp-huvec或非glp lnc进行计数，并且比较以花青素3显示的阳性凋亡膜联蛋白v(黄色)和坏死阳性凋亡(红色-7-aad)。计算且比较总gfp-huvec、lnc或总细胞中黄色或红色阳性的百分比。表1.预试验的实验设计。
[0199]
结果和结论
[0200]
在塑料(pl)上，在24h时，单独的huvec或与lnc共培养的huvec中不存在凋亡和坏死。当用hc-ha/ptx3处理24h时，单独的huvec显示出比与lnc共培养的huvec显著更高的坏死百分比(》7.1％，白色箭头；图2a-2b)，表明与lnc共培养的huvec可以防止huvec坏死。
[0201]
在pl上，在hc-ha/ptx3上单独的gfp-huvec促进细胞凋亡，但在pl或ha中不促进细胞凋亡(图3a，n＝3)。hc-ha/ptx3促进gfp-huvec中的细胞凋亡，但不促进周细胞或lnc中的细胞凋亡。然而，当与周细胞或单独的lnc共培养时，在接种后6h时同时或顺序加入hc-ha/ptx3促进gfp-huvec中的细胞凋亡(图3b，n＝3)。在matrigel
tm
上，在24h时，单独的gfp-huvec促进经典的管形成(图4)。当hc-ha/ptx3同时加入gfp-huvec时，huvec不能形成管形成(图4)。当hc-ha/ptx3同时加入与gfp-huvec共培养的lnc中时，早在4h时观察到gfp-huvec管形成，并且gfp-huvec快速形成聚集体并在24h时被lnc包裹。该结果表明lnc与gfp-huvec的重聚对于防止gfp-huvec细胞死亡是关键的，否则其由hc-ha/ptx3诱导(图4)。
[0202]
总之，gfp-huvec在matrigel
tm
上形成经典的血管形成。hc-ha/ptx3通过促进单独的gfp-huvec凋亡和坏死而促进抗血管新生作用。gfp-huvec与lnc的重聚防止gfp-huvec发生由hc-ha/ptx3诱导的凋亡和坏死。实施例2：lnc与huvec在hc-ha/ptx3上的共培养抑制huvec中的细胞增殖并且促进管形成
[0203]
体外血管管形成是表明内皮细胞形成血管和管腔的能力的最直接功能证据。在hc-ha/ptx3存在下，加入lnc是否能促进细胞增殖和血管新生尚不清楚。
[0204]
材料和方法
[0205]
细胞：gfp huvec(p3)购自neuromics(目录号gf01)。这些细胞分离自正常的人脐静脉，并在第1代用gfp-慢病毒颗粒转染。将嘌呤霉素抗性gfp huvec保持在含有5％fbs和生长补充剂的内皮细胞生长培养基中纤连蛋白包被的溶液上，直至第3代。当达到～70％-90％汇合时，每三天按1:3传代细胞。传代3-8的细胞用于所有实验。
[0206]
lnc(p2-p5)在含有4ng/ml bfgf和10ng/ml lif的mescm中在包被有5％matrigel
tm
的6孔塑料上扩增。
[0207]
结果和结论
[0208]
如edu核染色所提示的，在huvec或单独的周细胞(lnc)中加入可溶性ha(图2a-2b)促进细胞增殖。相反，加入可溶性hc-ha/ptx3抑制两种细胞类型的细胞增殖(图3a-3b)。当huvec与周细胞或lnc一起接种并同时处理时，与24h时的ha处理相反，hc-ha/ptx3促进细胞死亡并且抑制增殖(图5)。重聚的gfp-huvec和lnc在低剂量hc-ha/ptx3(25μg/ml)下生长为芽状lnc，但在高剂量(100μg/ml)下抑制生长为芽。(图6)重聚的gfp-huvec和lnc聚集体促进matrigel
tm
上的血管新生出芽。实施例3：固定的hc-ha/ptx3促进可与p10 lnc中的细胞聚集相关的信号传导
[0209]
尚不清楚hc-ha/ptx3是否在p10 lnc中的细胞聚集之前独特地促进早期信号传导(cxcr4/sdf-1、hif或其他)。
[0210]
材料和方法
[0211]
细胞培养：对于时程研究，将1
×
105/ml的p10 lnc接种在三种基材上：3d matrigel
tm
、ha或hc-ha/ptx3，在mescm中在5、15、30、60min、24h和48h进行(表2)。表2.实验装置
[0212]
qpcr：比较hif1α、hif1β、hif2α、sdf-1、cxcr4、hes1在5min、15min、30min、60min、120min、240min或24h和48h的mrna表达。
[0213]
免疫染色：然后将lnc进行细胞离心涂片，以在5min、15min、30min和60min时测定hif1α、hif1β、hif2α、sdf-1、cxcr4和hes1的核移位。
[0214]
结果和讨论
[0215]
在3d matrigel
tm
中，早在60min和120min时观察到10lnc hc-ha/ptx3促进球体形成的相差时程(图7)。cxcr4(图8a)和sdf-1(图8b)的mrna表达时程揭示了早在15min时hc-ha/ptx3促进cxcr4的转录物水平上调，并在60min达到峰值。240min后促进sdf-1的转录物水平上调。
[0216]
免疫荧光染色证实细胞质/膜cxcr4/sdf-1存在于对照中(图9a-9d)。早在15min时hc-ha/ptx3促进cxcr4移位至细胞核，并且在大多数细胞中在30min时显著表达(图9a)。在60min时，cxcr4不再在细胞核中表达(图9a)。相反，ha和3d mg促进cxcr4的膜移位(图9b)。
这些数据表明，hc-ha/ptx3在p10 lnc中球体形成之前，在60min时独特地促进短暂核cxcr4。(已经表明3d悬滴衍生的聚集体促进cxcr4在人msc中的表达，从而促进huvec的粘附。)
[0217]
不清楚cxcr4核移位的作用。cxcr4核定位可促进核hif1α，并且核hif1α促进cxcr4转录，其促进核cxcr4表达作为癌转移中的前馈环。cxcr4也有报道在肾癌细胞中sdf-1或非肌肉肌球蛋白重链iia蛋白结合时移位至细胞核。cxcr4的核翻译也与缺氧期间大鼠神经嵴干细胞中的hif1α相关，以抑制增殖。hif1α直接作为cxcr4启动子上的缺氧反应元件的上游结合，从而上调cxcr4在内皮细胞和各种癌细胞中的表达。
[0218]
hif信号传导的mrna表达时程模式显示，在15min时hc-ha/ptx3独特上调hif1β的表达(图10a)，而其不引起hif1α(图10b)或hif2α(图10c)的任何显著差异。免疫荧光(if)染色证实在5min时hc-ha/ptx3促进hif1α(图12a)和hif1β(图11a)的核染色，并且维持hif1α的核染色直至15min和30min(在60min时在细胞聚集体中显著减少)。然而，ha促进细胞质和核hif1α(图12b)和hif1β(图11b)二者。if染色显示对照中的核磷酸化phd2(磷酸-phd2(p-phd2)丝氨酸125)。在5min和15min时hc-ha/ptx3独特地抑制核p-phd2，在此期间核hif1α最显著(图13a)。相反，ha和3d mg保持核磷酸-phd2直至60min(图13b)。这些数据显示，hc-ha/ptx3、ha或3d mg之间在phd2的非磷酸化形式(图13d-13f)和pp2a/b55α(图15a-15c)的蛋白表达中没有显著差异。if数据表明，在5min和30min时hc-hc/ptx3促进核pp2a c亚基的高活性(图14a)。相反，在整个60min内ha(图14b)或3d mg(图14c)显示出核pp2a c亚基表达显著降低。
[0219]
值得注意的是，加入amd3100上调hif-1α和hif-1β转录物的两个峰，表明有或没有sdf1-cxcr4信号传导在hif-1α和hif-1β的转录物调节中起不同的作用(图10d和10e)。
[0220]
if染色显示在整个时程研究期间hif2α(图15)和芳烃受体(ahr)(图17)没有差异。上述数据表明，hc-ha/ptx3独特地促进hif1α和hif1β的短暂核表达(早在5min时)，其与已知促进hif-1α的蛋白酶体降解的磷酸-phd2的短暂下调相关。相反，ha促进细胞质和核hif1α和hif1β的持续表达以及p-phd2(丝氨酸125)保持在核中。
[0221]
hif1α是细胞过程的主要调节剂，该细胞过程包括调节氧浓度、有氧糖酵解、细胞迁移和炎症。值得注意的是，已报道hif-1α与哺乳动物组织再生有关。hif复合物在特定启动子或增强子位点(例如，缺氧反应元件(hre))与dna结合，导致对超过100种基因产物的转录调节。这些包括再生过程(例如血管新生)中的目标分子，该血管新生由血管内皮生长因子(vegf)、vegf受体-1(vegfr-1)、血小板衍生生长因子(pdgf)和红细胞生成素(epo)诱导。涉及再生的其他过程包括组织重塑，其由尿激酶型纤溶酶原激活物受体(upar)、基质金属蛋白酶2(mmp2)、mmp9和金属蛋白酶的组织抑制剂(timp)诱导；以及糖酵解代谢，其由乳酸脱氢酶(ldh)和丙酮酸脱氢酶激酶(pdk)诱导，ldh将丙酮酸转化为乳酸，pdk阻断丙酮酸进入三羧酸(tca)循环。抑制hif1a延缓成年mrl小鼠自发再生耳闭合，表明hif1a在再生中发挥中心作用。
[0222]
hif1β是配体结合亚基在配体结合后从胞浆移位至核所需的，增强hif靶基因激活。hif-1结合bmp4和cxcr4中的hre序列启动子。
[0223]
phd-2主要在细胞质中，在细胞质和细胞核之间穿梭，并且可以在癌细胞的细胞核中。phd2介导的hif-1α的羟基化主要发生在细胞核中。
[0224]
phd2在丝氨酸125上被m-tor介导的p70s6-激酶(p70s6k)磷酸化，以增加其降解hif1α的能力，但被pp2a/b55α脱磷酸化。尚不清楚hc-ha/ptx3是否促进pp2a在核中使phd2脱磷酸化。蛋白磷酸酶2a全酶是由结构亚基a、催化亚基c和调节亚基b组成的异源三聚蛋白。响应于egf或胰岛素，pp2a在tyr307处被src磷酸化，从而导致pp2a活性的实质性降低。已经观察到pp2a的leu309的羧基基团的可逆甲基化。甲基化改变pp2a的确认，以及其定位和与b调节亚基的缔合。
[0225]
在15min时hc-ha/ptx3也独特地诱导不清楚的cxcr4(实施例3)。核hif1α蓄积需要核移位cxcr4，并且核hif1α促进cxcr4在前馈环中转录以促进癌转移。已经报道，需要起始hif1α来上调sdf-1/cxcr信号传导以促进小鼠中风后中枢疼痛中神经胶质-神经元相互作用之间的正反馈，这表明hif和cxcr4之间的反馈环具有强关系。关于核cxcr4、hif1α和p-phd2之间的关系尚不清楚。
[0226]
在3d matrigel
tm
上的p4 lnc中，mmp2和mmp9的mrna表达被显示下调，但不被hc-ha/ptx3下调。蛋白水平不清楚。还显示ptx3和tsg-6下调结膜松弛成纤维细胞的mrna和蛋白中mmp1和mmp-3的激活。在有/没有tgf-β1的情况下，hc-ha/ptx3抑制hcf中的mt1-mmp。(p-272，未公开的蛋白数据)再生过程可能涉及通过增加timp而快速更新mmp。由于mmp和timp参与组织再生，因此试图推测hc-ha/ptx3可能参与快速更新mmp的timp增加。
[0227]
时程揭示，与ha或3d matrigel
tm
上的转录物水平相比，早在15min时hc-ha/ptx3促进hes1的mrna表达，在120min时在p10lnc中达到峰值千倍(**《0.05，n＝3)(图18a)。当与3d matrigel
tm
相比时，notch3(图18b)和jag1(图18c)的表达水平被显著上调。
[0228]
免疫荧光染色证实，早在5min时hc-ha/ptx3促进核hes1(图19a)，其中早在15min时ha促进核hes1(图19b)。notch1的表达得到证实，在60min内在细胞核中不存在，这表明hes1的激活可能是notch非依赖性的(图20a)。
[0229]
已知hes1调节神经干细胞祖细胞的未分化状态/维持，以促进适当的神经元分化和细胞间相互作用的侧抑制。hes1的表达通常以每2小时振荡的方式进行，已在成纤维细胞和神经祖细胞中所证实。在没有hes基因的情况下，祖细胞仅提前分化成某些类型的神经元，并且在它们对于其他神经元和神经胶质细胞类型充分增殖之前被耗尽。这些数据显示，当用hc-ha/ptx3处理时，5分钟内发生hes1的短暂核移位。hes1的持续表达增强对前神经元基因的抑制并维持细胞的低增殖或静止模式。notch-hes1介导负责激活hif1α信号传导以在tyr 416处磷酸化stat3。尚不清楚负责蛋白hes1核翻译但由转录后事件表达的机制事件。
[0230]
已经证明，hes1的表达通过notch依赖和非依赖途径介导以促进血管新生和神经发生。hes1振荡已证明notch非依赖性和介导，该介导通过es细胞中bmp和lif信号传导、es衍生的神经祖细胞中fgf2-jnk轴、具有hes1的持续表达以维持树突形成的ngf-nf-kb、用于视网膜祖细胞增殖和视网膜神经节细胞命运特化的vegf-flk-1-erk以及结合hes1启动子以增强神经sc维持的pax3乙酰化作用进行。实施例4：hc-ha/ptx3促进血管新生和神经发生基因的表达增加
[0231]
尚不清楚hc-ha/ptx3引起的lnc表型变化是否不同于ha或3d matrigel
tm
。对mrna水平的早期变化筛选血管生成基因vegf、cd31、vegfrb和igf-1以及神经发生基因ngf和p75
ntr
。
[0232]
材料
[0233]
细胞培养：将1
×
105/ml的p10 lnc接种在三种基材上：3d matrigel
tm
、ha或hc-ha/ptx3，在mescm中进行48h。对于hc-ha/ptx3的时程研究，将用hc-ha/ptx3处理p10 lnc 5min、15min、30min、60min、24h和48h。
[0234]
qpcr：在3d mg、固定的ha和固定的hc-ha/ptx3上，在5min、15min、30min、60min、120min、240min、24h或48h时，比较血管新生的vegf、pdgfα、cd31和igf-1以及神经发生的ngf和p75
ntr
的mrna表达。
[0235]
免疫染色：然后将lnc进行细胞离心涂片，以测定在5min、15min、30min和60min时hif1α、hif1β、hif2α、sdf-1、cxcr4和hes1的核移位。
[0236]
结果和结论
[0237]
表达mrna的时程显示，与3d matrigel
tm
或ha相比，早在15min时hc-ha/ptx3在循环模式下显著上调p10 lnc中vegf(图21a)和pdgfα(图21b)的转录物水平，并在240min时达峰。在细胞聚集后240min，hc-ha/ptx3还显著上调cd31(图21c)和igf-1(图21d)的转录物水平。值得注意的是，与ha或3d mg相比，hc-ha/ptx3在24h内还显著上调ngf(图21e)和p75
ntr
(图21f)的转录物水平。上述数据一致表明hc-ha/ptx3在24h内仅上调不同于3d matrigel
tm
和ha上的基膜的血管新生基因和神经源性基因。实施例5：促进血管新生的早期信号
[0238]
先前发现lnc和sc之间的细胞-细胞间聚集由cxcr4/sdf-1轴介导，其中角膜缘基质nc高表达cxcr4，sc表达sdf-1。接种时amd3100或cxcr4阻断抗体对cxcr4的抑制作用破坏它们重聚，并产生体积较小的分离的聚集体，同时所得上皮细胞球体的角膜分化更严重，并且全克隆明显丢失。目前尚不清楚hc-ha/ptx3是否在细胞聚集前仅促进p10 lnc中的早期信号传导(cxcr4/sdf-1，hif或其他)。
[0239]
细胞培养：对于时程研究，在5min、15min、30min、60min、24h和48h时，将1
×
105/ml的p4 lnc接种于mescm培养基中基材ha或hc-ha/ptx3上(表3)。表3
[0240]
qpcr：在5min、15min、30min、60min、120min、240min或24h和48h时，比较hif1α、hif1β、hif2α、sdf-1、cxcr4、hes1的mrna表达。
[0241]
免疫染色：将lnc进行细胞离心涂片，以测定在5min、15min、30min和60min时hif1α、hif1β、hif2α、sdf-1、cxcr4和hes1的核移位。
[0242]
结果和结论
[0243]
cxcr4：免疫荧光染色证实对照品中存在细胞质/膜cxcr4。hc-ha/ptx3促进cxcr4在5min、30min移位至细胞核，短暂核移位(图9a)。相反，ha无该作用(图9b)。上述数据表明在球体形成和神经形成之前，hc-ha/ptx3仅促进p4 lnc中cxcr4的短暂核移位。可见，cxcr4核定位促进核hif-1α，并且核hif-1α促进癌症转移中作为前馈环的cxcr4转录。已报道cxcr4在肾癌细胞中与sdf-1或非肌球蛋白重链iia蛋白结合后移位至细胞核。cxcr4的核翻译也与缺氧期间抑制增殖的大鼠神经嵴干细胞中hif-1α相关。hif1α直接作为cxcr4启动子上的缺氧反应元件的上游结合，从而上调cxcr4在内皮细胞和各种癌细胞中的表达。
[0244]
hif：免疫荧光染色表明hc-ha/ptx3促进延长的hif1α核移位(5-60min)(图12a)。类似地，ha也与此相同(图12b)，这表明这种促进作用是由ha分子引起的。结果证明了hc-ha/ptx3和ha在血管新生中的作用。hc-ha/ptx3促进短暂hif1β核移位(15min)(图11a)。相反，ha促进延长的hif1β核移位(5-30min)(图11b)。这种差异的原因尚不明确。用hc-ha/ptx3或ha处理的lnc中未观察到hif2α的变化，这表明hif2α不参与上述作用。hc-ha/ptx3还促进ahr的核移位(15min)(图17)，表明ahr可能对血管新生起作用。
[0245]
配体结合后，配体结合亚基从胞浆移位至细胞核需要hif1β，其增强hif靶基因的激活。hif-1结合bmp4和cxcr4中的hre序列启动子。hif-1α是细胞过程的主要调节因子，该细胞过程包括调节氧浓度、有氧糖酵解、细胞迁移和炎症。值得注意的是，已报道hif-1α与哺乳动物组织再生有关。hif复合物在特定的启动子或增强子位点(缺氧反应元件(hre))与dna结合，导致对超过100种基因产物的转录调节。这些包括在再生过程(例如血管新生)中的目标分子，该血管新生由血管内皮生长因子(vegf)、vegf受体-1(vegfr-1)、血小板衍生生长因子(pdgf)和红细胞生成素(epo)诱导。涉及再生的其他过程包括组织重塑，其由尿激酶型纤溶酶原激活物受体(upar)、基质金属蛋白酶2(mmp2)、mmp9和金属蛋白酶的组织抑制剂(timp)诱导；以及糖酵解代谢，其由乳酸脱氢酶(ldh)和丙酮酸脱氢酶激酶(pdk)诱导，ldh将丙酮酸转化为乳酸，pdk阻断丙酮酸进入三羧酸(tca)循环。抑制hif1α延缓成年mrl小鼠中自发再生耳闭合，表明hif1α在再生中发挥作用。
[0246]
hes：已知hes1调节神经干细胞祖细胞的未分化状态/维持，以促进适当的神经元分化和细胞间相互作用的侧抑制。hes1的表达通常以每2小时振荡的方式进行，如在成纤维细胞和神经祖细胞中所证实。在没有hes基因的情况下，祖细胞仅提前分化成某些类型的神经元，并且在它们对于其他神经元和神经胶质细胞类型充分增殖之前被耗尽。这些数据显示，当用hc-ha/ptx3处理时，hc-ha/ptx3在15min内促进hes1的短暂核移位(图19a)。类似地，ha在5-15min内促进hes1核移位(图19b)。结果表明hes1核移位是由ha引起的。
[0247]
nicd和sdf1：在用hc-ha/ptx3(图22d)或ha处理的lnc中未观察到变化。实施例6：从人羊膜纯化的hc-ha/ptx3通过cxcr4/sdf-1信号传导促进细胞聚集从而使晚期传代角膜缘微环境细胞逆转为核pax6 神经嵴祖细胞。
[0248]
将水溶性am提取物作为独特基质进行纯化，该基质由与间α胰蛋白酶抑制剂重链1(hc1)共价连接(
“‑”
用于表示共价连接)的高分子量透明质酸(ha)组成，然后与正五聚蛋白3(ptx3)复合(“/”用于表示非共价连接)得到hc-ha/ptx3。已证实hc-ha/ptx3具有抗炎作用，即从促进刺激中性粒细胞的凋亡和极化m2巨噬细胞产生的先天免疫应答延伸至通过抑制th1和th17淋巴细胞的激活而下调同种异体反应免疫应答的适应性免疫应答。此外，hc-ha/ptx3还抑制人角膜成纤维细胞中tgf-β1启动子的活性。本文发现hc-ha/ptx3与3d mg的
不同之处在于逆转晚期传代lnc以重新获得核pax6 nc祖细胞状态是通过cxcr4/sdf-1信号传导(而非bmp信号传导)促进早期细胞聚集实现的。
[0249]
结果
[0250]
lnc连续传代导致核pax6 nc表型的逐渐丧失
[0251]
lnc连续传代至p10导致nc祖细胞状态的丧失，其可通过以下表征：核pax6染色，esc标志物和nc祖细胞标志物(例如sox2、p75ntr、musashi-1、巢蛋白、msx1和foxd3)的表达，以及神经胶质分化。由于核pax6表达存在区域差异，lnc在mescm中包被的mg上连续传代至p10，并通过转录表达和免疫测定表征其表型以建立基线。结果证实，p10 lnc对pax6、sox2、p75ntr、musashi-1和巢蛋白的转录表达水平确实显著低于p2 lnc(图35a，##p《0.01，n＝3)。免疫荧光染色进一步证实了p10 lnc中pax6的核染色丧失，并且与p4 lnc相比，nc标志物(例如p75ntr和musashi-1)的染色明显减少(图35b)。
[0252]
固定的hc-ha/ptx3促进细胞聚集并使p10 lnc逆转为核pax6 神经嵴祖细胞
[0253]
在mescm中在包被的mg上扩增的p4 lnc当重新接种在3d mg或固定的hc-ha/ptx3上时形成细胞聚集，其中后者还有助于恢复esc标志物的表达。想知道p10 lnc是否可以通过重新接种在固定的hc-ha/ptx3上而表现相同地恢复核pax6 nc祖细胞状态。因此，将在mescm中在包被的mg上扩增的p10 lnc重新接种于在mescm中在包被的mg、3d mg或固定的hc-ha/ptx3上48h。相差显微镜表明，在24h和48h时，p10 lnc在3d mg和固定的hc-ha/ptx3中形成细胞聚集(图24a)。定量rt-pcr显示，当与在包被的mg(图24b，**p《0.01，n＝3)或3d mg(图24b，##p《0.01，n＝3)上比较时，在固定的hc-ha/ptx3上，在p10 lnc中，pax6、p75
ntr
、musashi-1、巢蛋白、msx-1和foxd3的转录物水平显著上调。免疫荧光染色证实核pax6及其他神经嵴标志物sox2、p75
ntr
和musashi-1重新出现，但巢蛋白无差异(图24e)。分析了p10 lnc在重新接种在3d mg或固定的hc-ha/ptx3上之后分化为神经元、少突胶质细胞的和星形胶质细胞的潜能。相差显微镜显示，当p10 lnc重新接种在固定的hc-ha/ptx3上时，当与它们的重新接种在3d mg中的对应物相比时，p10 lnc表现出减小的尺寸并且采用扩大的潜能分化为神经元、少突胶质细胞的和星形胶质细胞(图24d)。总之，这些结果表明，固定的hc-ha/ptx3(而非3d mg)独特地使p10 lnc逆转为核pax6 nc祖细胞，具有较高的神经胶质细胞分化潜能。
[0254]
可溶性hc-ha/ptx3促进早期细胞聚集并逆转为pax6 nc祖细胞
[0255]
随后测试，在p10 lnc接种在包被的mg上时将可溶性hc-ha/ptx3直接加入mescm中是否也可以达到相同的结果。相差显微镜显示，早在60min时可溶性hc-ha/ptx3也促进细胞聚集(以白色箭头标记)，但是直至24h，在包被的mg上聚集的细胞铺展成单纺锤形细胞，而在3d mg中细胞聚集变得更加显著(图25a)，类似于图2中所示。定量rt-pcr揭示，当与3d mg相比时，在24和48h时，可溶性hc-ha/ptx3显著地上调p75
ntr
、ngf和musashi-1转录物(图25b-25d，
##
p《0.01，n＝3)。免疫荧光染色也证实，当与在3d mg上培养的细胞相比时，在48h时，可溶性hc-ha/ptx3实现了pax6和sox2的核染色以及p75
ntr
的细胞质染色(图25a)。这种染色模式类似于在固定的hc-ha/ptx3上观察到的(图24e)。
[0256]
可溶性hc-ha/ptx3促进细胞聚集由cxcr4/sdf-1信号传导介导并导致核pax6 nc祖细胞
[0257]
先前已报道，在3d mg中p4 lnc和lepc之间的重聚通过cxcr4/sdf-1信号传导介
导，其中受体cxcr4由lnc强表达，而sdf-1配体由lepc表达，并且这种重聚对于维持lepc的自我更新是关键的。因此，想知道在p10 lnc中由可溶性hc-ha/ptx3促进的细胞聚集是否可能也通过cxcr4/sdf-1信号传导介导。为了测试此假设，对cxcr4/sdf-1信号传导通过添加amd3100(其是小分子cxcr4抑制剂)进行干扰。相差显微镜证实，在p10 lnc中在60min时可溶性hc-ha/ptx3确实促进细胞聚集，与上述类似，并且这种聚集被amd3100完全中止(图26a)。通过qrt-pcr对转录物表达的时程研究表明，当将可溶性hc-ha/ptx3添加到在包被的mg上的p10 lnc时，与它们的在3d mg中的对应物相比，早在15min时cxcr4转录物明显上调四倍并且在60min时达到高峰值几乎500倍(图26b，**p《0.01和**p《0.01，n＝3)。amd310的添加显著地下调在24h时cxcr4转录物的这种上调并且在48h时完全中止(图26b)。相反，在前60min期间，在所有培养物中，sdf-1转录物没有上调，但是在24h时3d mg使其显著上调40倍并且可溶性hc-ha/ptx3使其上调10倍，其中后者也被amd3100完全中止(图26b，##p《0.01，n＝3)。在3d mg上，在整个60min期间，cxcr4的免疫荧光染色显示膜/细胞质染色。相反，在可溶性hc-ha/ptx3中，在0和5min时cxcr4染色是膜/细胞质染色，但在15和30min时是核染色，并在60min时逆转为在细胞聚集中主要是膜染色(图26d)。后者染色模式在添加amd3100时逆转成3d mg的模式(图26d)。相反，在接种在3d mg或可溶性hc-ha/ptx3的细胞中，在整个60min，sdf-1的免疫染色是膜/细胞质强染色，而在添加amd3100之后变为阴性(图26d)。cxcr4/sdf-1信号传导被amd3100阻断不仅防止由可溶性hc-ha/ptx3促进的细胞聚集而且导致pax6、p75ntr、ngf、musashi-1、msx-1和foxd3转录物的显著下调(图26e，**p《0.01，n＝3)。此外，在p10 lnc中由可溶性hc-ha/ptx促进的核pax6染色被amd3100中止(图26d)。为了证实上述结果，将cxcr4和pax6的亚细胞胞质级分和细胞核级分进行定量比较。与观察到的结果一致，western印迹分析显示胞质级分中cxcr4和pax6蛋白下降，而在15和30min时在可溶性hc-ha/ptx3中核移位增加。(图26f)通过amd3100阻断cxcr4/sdf-1信号传导，在各时间点时，cxcr4和pax6均保留在胞质级分中。(图26f)这些数据共同地表明，在p10lnc中由可溶性hc-ha/ptx3促进的细胞聚集由cxcr4/sdf-1信号传导介导，其作为诱因与核pax6 nc祖细胞表型的恢复相关联。
[0258]
hc-ha/ptx3激活bmp信号传导需要cxcr4/sdf-1
[0259]
已报道在p4 lnc中固定的hc-ha/ptx3(而非3d mg)独特地上调bmp信号传导，其导致维持角膜sc静止。因此，疑问在p10 lnc中bmp信号传导是否也可能由可溶性hc-ha/ptx3促进，若如此，它是否可能受由hc-ha/ptx3激活的cxcr4-sdf1信号传导影响。qrt-pcr表明，当与在包被的mg上扩增的p4 lnc相比时，bmp配体和bmp受体的转录物表达被p10 lnc显著地下调(图27a,**p《0.01，n＝3)。免疫荧光染色证实，psmad1/5/8的核定位在p4 lnc中弱表达而在p10 lnc中为零(图,27b)。相反，qrt-pcr揭示，当与3d mg相比时，bmp2、bmp4、bmp6转录物的表达水平确实被可溶性hc-ha/ptx3显著地上调(图27c-27e，##p《0.01，n＝3)。值得注意的是，bmp4和bmp6的上调是早在15min时并且在接近48h时循环到较高水平，而这对于bmp2仅在24h之后观察到(图27c-27e)。在整个48h中amd3100的添加中止bmp2、bmp4和bmp6的转录物水平(图27c-27e，**p《0.01，n＝3)。免疫荧光染色进一步证实，在p10 lnc中指示典型bmp信号传导的psmad1/5/8的强核染色被可溶性hc-ha/ptx3促进，但是在用amd3100处理之后不存在核染色(图27f)。western印迹证实早在5、15、30min时可溶性hc-ha/ptx3促进核psmad1/5；通过amd3100阻断cxcr4/sdf-1信号传导，未促进核psmad1/5。(图27g)这些发
现充分表明，在p10 lnc中由hc-ha/ptx3促进的cxcr4/sdf-1信号传导也作为诱因而与典型bmp信号传导的激活相关联。
[0260]
抑制bmp信号传导不影响由hc-ha/ptx3促进的通过cxcr4/sdf-1信号传导介导的核pax6染色和细胞聚集
[0261]
干扰由可溶性hc-ha/ptx3促进的bmp信号传导以确定通过cxcr4/sdf-1信号传导介导的细胞聚集是否需要bmp信号传导。为此，p10 lnc用或不用ldn-193189(小分子bmp抑制剂)(数据未示出)或针对bmp受体(即bmpr1a、bmpr1b、bmpr2)的短干扰rna(sirna)和activin受体i型(acvr1)进行预处理，接种在包被的mg上，然后将可溶性hc-ha/ptx3加入mescm中，进行另外48h。定量rt-pcr和免疫荧光染色证实了在降低bmp受体的转录物表达(图36a，**p《0.01，n＝3)和防止psmad1/5/8核染色(图36b)方面针对bmp受体的sirna的效能。然而，相差显微镜揭示，当相比于用乱序rna(scrna)预处理的对照时，在p10 lnc中可溶性hc-ha/ptx3所致的细胞聚集不受ldn-193189或针对bmp受体的sirna影响(图36c)。定量rt-pcr进一步揭示，当p10 lnc用ldn-193189或针对bmp受体的sirna预处理时，在整个48h中，cxcr4和sdf-1的表达水平没有显著差异(图36d-36e，p》0.1，n＝3)。此外，免疫荧光染色还表明，cxcr4的短暂核移位和核pax6染色未受影响(图36f)。这些数据共同地表明，当典型bmp信号传导被抑制时，hc-ha/ptx3所致的细胞聚集、核pax6染色和cxcr4/sdf-1信号传导激活未受影响。
[0262]
讨论
[0263]
早期传代的p4 lnc当被重新接种在固定的hc-ha/ptx3上时恢复在包被的mg中连续传代期间丧失的esc标志物的表达。本文中表明，传代的p10 lnc当被重新接种在固定的hc-ha/ptx3上时也恢复了在连续传代期间丧失的核pax6 nc多能神经嵴祖细胞表型(图24a-24e)。虽然固定的hc-ha/ptx3和3d mg二者均促进细胞聚集(24a-24e)，但是这种表型逆转是hc-ha/ptx3独有的，因为当p10 lnc仍然在包被的mg上培养时，当将可溶性hc-ha/ptx3添加到mescm中时，早在60min时就发生细胞聚集，但在其没有hc-ha/ptx3的对应物中或重新接种在3d matrigel上的情况中则没有(图25a-25e)。hc-ha/ptx3诱导的细胞聚集不同于3d mg所致的细胞聚集的观点进一步依据在于cxcr4/sdf-1信号传导的激活存在于前者中而非后者。其例证在于，在hc-ha/ptx3促进的细胞聚集之前，cxcr4转录物的显著上调cxcr4的核移位(图26a-26f)。amd3100对cxcr4的抑制不仅中止cxcr4转录的上调以及cxcr4的核移位，而且消除sdf-1的膜和细胞质染色以中断cxcr4/sdf-1信号传导。由于在60min时它也中止细胞聚集，所以得出结论hc-ha/ptx3促进的早期细胞聚集通过cxcr4/sdf-1信号传导介导并且对于表型逆转为核pax6 nc祖细胞状态是关键的，如添加amd3100后的结果所示(图26a-26f)。由于表型逆转的发生仅通过hc-ha/ptx3而非matrigel，其中二者均造成细胞聚集，但是推测由同型cxcr4/sdf-1信号传导触发的细胞聚集上独特的。未来的研究需要查看这种机制是否可以扩展来理解间充质细胞聚集/聚合，其与在牙齿、骨、头发、皮肤和肌肉中促进器官形成相关联。
[0264]
cxcr4在lnc中高表达，lnc在角膜基底上皮干细胞/祖细胞下方。但是其表达也随着在包被的matrigel上连续传代而下降(数据未示出)。本文发现cxcr4的核移位紧随在添加hc-ha/ptx3之后(图26a-26f)。此外，amd3100的添加防止cxcr4的这种短暂核移位和中止细胞聚集以及随后的表型逆转。因此，引人推测hc-ha/ptx3通过cxcr4的核移位而激活
cxcr4/sdf-1信号传导。然而，cxcr4的核移位已被视为若干癌细胞中高恶性的强指示，并且与hif1α关联作为前馈环路而促进肿瘤生长和rcc细胞中癌转移。因为相比于在癌细胞中因持续的sdf-1刺激而已观察到的，在lnc中cxcr4的核移位发生快得多，即在添加hc-ha/ptx3之后15和30min，需要进一步研究来确定在lnc中由hc-ha/ptx3促进的cxcr4的核移位是否通过相似的机制。
[0265]
已表明在p4 lnc中固定的hc-ha/ptx3(而非3d mg)可激活bmp信号传导，这对于保持角膜缘上皮sc静止是至关重要的。从本文可知，在连续传代期间，psmad1/5/8的核移位以及和bmp配体和受体的上调所证实的bmp信号传导也已丧失(图27a-27b)，同时还丧失了核pax6染色(图35a-35b)。但是，在p10 lnc中固定的(未示出)和可溶性hc-ha/ptx3仅激活bmp信号传导，这可通过30min时psmad1/5/8的核染色及细胞聚集前bmp4和bmp6转录物以循环波形式上调来证实(图27a-27g)。bmp信号传导涉及体细胞重编程的早期阶段，细胞聚集以及从成年皮肤成纤维细胞到诱导多能干细胞(ipsc)的间质上皮转移也反映了这点。这些数据揭示，amd3100对cxcr4/sdf-1信号传导的破坏中止前述由hc-ha/ptx3促进的bmp信号传导(图27a-27g)。相反，基于cxcr4转录物表达和核cxcr4染色，针对bmp受体的sirna对bmp信号传导的破坏既没有影响由cxcr4/sdf-1信号传导介导的细胞聚集，也没有中止核pax6染色(图36a-36f)。总之，这些结果表明，在p10 lnc中hc-ha/ptx3通过激活cxcr4/sdf-1信号传导而促进早期细胞聚集，其也是在p10 lnc中激活bmp信号传导所需的，并且cxcr4/sdf-1信号传导(而非bmp信号传导)在p10 lnc的表型逆转中是关键的。
[0266]
从人am纯化的hc-ha/ptx3发挥广泛的抗炎和抗瘢痕作用并且支持lnc以确保角膜上皮sc静止。这些作用共同地解释了分子机制，解释了为何低温保存的羊膜可以促进再生性愈合。本文首次提供证据表明，hc-ha/ptx3还可以促使老化的lnc逆转而恢复它们的pax6 nc祖细胞状态，结果有助于解释为何am的移植提高体内和离体扩增角膜sc来治疗因角膜sc缺陷所致的角膜失明的成功率。因为pax6 nc祖细胞具有分化为神经血管细胞的广泛分化潜能，hc-ha/ptx3还可以在身体的许多其他神经血管生态位中支持sc。
[0267]
材料和方法
[0268]
细胞分离和扩增
[0269]
在4℃下在optisol(chiron vision,irvine,ca)中保存小于7天的人角膜边缘和中央角膜扣状体获自供体(florida lions eye bank,miami,fl)。组织用含有50μg/ml庆大霉素和1.25μg/ml两性霉素b的ph为7.4的pbs漂洗三次，除去多余的巩膜、结膜、虹膜、角膜内皮和小梁网直至角膜巩膜边缘的施瓦尔贝氏线(schwalbe's line)，随后将组织切成1mm以内并超过解剖边缘的上、鼻、下和颞象限。通过在含5％co2的湿润培养箱中于4℃下在塑料皿中，用在改良胚胎干细胞培养基(mescm)中的10mg/ml分散酶消化各角膜缘象限16h，获得包括基底上皮细胞的完整上皮薄片，该mescm由补充有10％敲除血清、10ng/ml lif、4ng/ml bfgf、5mg/ml胰岛素、5mg/ml转铁蛋白、5ng/ml亚硒酸钠补充剂(its)、50μg/ml庆大霉素和1.25μg/ml两性霉素b的dulbecco改良eagle培养基(dmem)/f-12营养混合物(f-12)(1:1)制成。剩余的基质在37℃下用2mg/ml胶原酶a处理16h以产生漂浮团状物。
[0270]
对于扩增，在mescm中，将用0.25％胰蛋白酶和1mm edta(t/e)消化角膜缘团状物或csc生成的单细胞按1
×
104/cm2接种于预包被5％matrigel
tm
的6孔板中，并在5％co2湿润环境下培养，每3-4天更换培养基，共培养6-7天。对于在三维(3d)matrigel中的细胞培养，
在37℃下孵育60min后，通过向8孔腔室载玻片的每个腔室加入在mescm中稀释的50％matrigel制备matrigel。将lnc细胞接种在3d matrigel中，然后在mescm中培养24h或48h。
[0271]
汇合达到80％后，在包被的mg上培养的p10 lnc用含有/不含20μg/ml amd3100或100nm ldn-193189的0.1％dmso预处理30min，然后用胰蛋白酶处理，并以2
×
105/ml接种在mescm中包被的mg上另外48h，该mescm含有20μg/ml的amd3100或100nm ldn-193189及20μg/ml可溶性hc-ha/ptx3。对于敲低sirna，通过将200μl的无血清无抗生素的mescm与4μl的hiperfect sirna转染试剂(最终稀释度，1:300)和6μl的20μm针对bmpr1a、bmpr1b、bmpr2和acvr1的scrna或sirna(最终浓度为100nm)逐滴混合，随后在37℃下在1ml新鲜mescm中培养24h，然后在mescm中加入最终浓度为20μg/ml的可溶性hc-ha/ptx3，从而对在6孔包被的mg上80％汇合的p10 lnc进行转染。
[0272]
hc-ha/ptx3的纯化、表征和固定
[0273]
从bio-tissue,inc.(miami,fl)提供的低温保存的人胎盘纯化hc-ha/ptx3，其中有所改进。简言之，取自胎盘的am用freezemill(freezermill 6870，sampleprep，metuchen，nj)冷冻粉碎，在4℃下用pbs(ph 7.4)提取1h，并在4℃下在48,000
×
g下离心30min，得到上清液，将其命名为am提取物。然后，在4m gnhcl中以1.35g/ml的初始密度采用cscl梯度法通过超速离心将该提取物分级，以125,000g离心速度在15℃下持续48h(optima
tm l-80x，sw41转子，beckman coulter，indianapolis，in)。从各超离心管中收集总共12个级分(1ml/级分)。测定各级分的重量以计算密度，同时用酶联免疫吸附ha定量检测试剂盒(corgenix，broomfield co)和bca蛋白质分析试剂盒(life technologies，grand island，ny)分别测定各级分中ha含量和蛋白质含量。合并2-12个级分中含有大部分hc-ha/ptx3的级分，进一步在cscl/4m盐酸胍中以125,000g离心速度进行三轮连续超速离心，第2轮超速离心的密度为1.40g/ml，第3轮和第4轮超速离心的密度为1.42g/ml，每轮在15℃下持续48h。合并第4轮后的3-9个级分，并在4℃下用蒸馏水透析48h，共换水5次，冻干，储存于-80℃，并将其命名为hc-ha/ptx3。使用前，通过基于琼脂糖凝胶电泳验证其含有高分子量ha的生物化学组成来鉴定hc-ha/ptx3的质量，并在蛋白酶抑制剂(sigma-aldrich，st.louis，mo)存在条件下用/不用haase消化(1u/μg ha)的western印迹验证纯化的hc-ha/ptx3中是否存在hc1(ab70048，abcam，cambridge，ma)和ptx3(alx-804-464-c100，enzo life sciences，farmingdale，ny)。由于其中蛋白质的量可忽略，所以实验中hc-ha/ptx3的用量以ha的量表示。
[0274]
首先用70％乙醇对covalink-nh 96孔板(pierce)灭菌30min，然后用蒸馏水洗涤两次，从而将100μl的20μg/ml hc-ha/ptx3固定在covalink-nh 96孔板中。向各孔中加入hc-ha/ptx3，并在4℃下孵育过夜，该hc-ha/ptx3含有9.2mg/ml sulfo-nhs(pierce)和6.15mg/ml 1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(pierce)作为交联剂。之后，除去未交联的hc-ha/ptx3和交联试剂，并用2m nacl/50mm mgso4/pbs洗涤孔两次，随后用pbs洗涤两次。
[0275]
神经胶质分化
[0276]
在补充0.5％n2和1％b27的nscm中，将总共1
×
104/ml的p10lnc接种于48孔板中包被50μg/ml聚-l-鸟氨酸和20μg/ml层粘连蛋白或胶原iv的盖玻片上持续2天。对于神经元分化，将培养基更换为添加10ng/ml fgf2和20ng/ml bdnf的含有dmem/f12(1:3)以及0.5％n2
和1％b27的神经元诱导基础培养基(培养基a)持续3天以及更换为添加6.7ng/ml fgf2和30ng/ml bdn的基础培养基另持续3天。然后将细胞换至添加2.5ng/ml fgf2、30ng/ml bdnf、200mm抗坏血酸的基础培养基中另持续8天。对于少突胶质细胞分化，然后将培养基更换为添加10ng/ml fgf2、10ng/ml pdgf和10μm毛喉素的含有dmem/f12(1:1)以及1％n2的基础培养基持续4天，然后将培养基更换为添加10ng/ml fgf2、30ng/ml 3,3,5-三碘甲状腺原氨酸和200μm抗坏血酸的基础培养基另持续7天。对于星形胶质细胞分化(thermo scientific，santa clara，ca)，将培养基更换为含有1％fbs、1％n2和2mm glutamax的dmem持续10天。诱导培养基每3-4天进行更换。
[0277]
亚细胞分级和western印迹
[0278]
按照生产商的说明书，使用细胞核和细胞质提取试剂盒(pierce，rockford，il，usa)制备细胞核和细胞质级分。简言之，将处理过的p10 lnc在冰冷pbs中洗涤一次，并在500g下离心5min。
[0279]
通过涡旋将细胞沉淀物悬浮于含有蛋白酶抑制剂的100μl细胞质提取试剂i中。将悬浮液在冰上孵育10min，随后加入6μl的细胞质提取试剂ii，涡旋5s，在冰上孵育1min，并在16 000g下离心5min。将上清液级分(细胞质提取物)转移至预冷试管中。通过15s内涡旋三次将含有粗细胞核的不溶性沉淀物级分重悬在50μl的细胞核提取试剂中，各自在冰上孵育10min，然后在16 000g下离心10min。将构成核提取物的上清液用于后续实验。使用bca蛋白测定试剂盒(pierce)定量蛋白浓度。在各泳道中上样等量的蛋白质，在变性还原条件下用4-15％梯度的丙烯酰胺凝胶分离，进行western印迹分析。将蛋白质提取物转移到硝酸纤维素膜上，然后用含5％(w/v)脱脂牛奶的tbst溶液封闭。[50mm tris-hcl，ph 7.5，150mm nacl，0.05％(v/v)tween-20]，随后顺序孵育抗pax6、cxcr4、磷酸-smad1/5/8的特异性一抗及其各自的辣根过氧化物酶(hrp)缀合的二抗，使用β-肌动蛋白和组蛋白h3用于其各自的细胞质或细胞核级分的上样对照。通过western lighting化学发光法(perkinelmer，waltham，ma)检测免疫反应蛋白，并通过ge imagequant las 4000(ge healthcare biosciences，pittsburgh，pa)捕获图像。
[0280]
定量实时pcr
[0281]
根据生产商指示，用rneasy mini试剂盒(qiagen，valencia，ca)从扩增的lnc提取总rna，并使用applied biosystem
tm
高容量逆转录试剂盒(thermo fisher，santa clara，ca)，用引物将1-2μg的rna提取物逆转录为cdna。在quantstudio
tm 5实时pcr系统(thermo fisher，santa clara，ca)中用特异性taqman基因表达测定预混液和通用pcr预混液扩增所得cdna，实时rt-pcr配置由以下组成：在95℃下初始激活10min，然后在95℃下变性15s，共40轮，以及在60℃下退火和扩增1min。阈值设置为高于前15轮平均基线发射值的标准偏差的10倍。用quantstudio design and analysis v.1.4.3(thermo fisher，santa clara，ca)计算阈循环数(ct)。相关基因表达数据通过比较ct方法(δδct)进行分析。所有测定重复进行三次。将结果通过甘油醛3-磷酸脱氢酶(gapdh)作为内部对照进行归一化。
[0282]
免疫荧光染色
[0283]
在37℃下用0.05％胰蛋白酶和1mm edta处理10min收获不同代系的lnc或csc单细胞，使用cytofuge(statspin inc.，norwood，ma)以1000g离心8min将单细胞制备成细胞离心涂片。将细胞用4％甲醛ph 7.0在室温下固定15min，用0.2％triton x-100/pbs透化
15min，并用2％牛血清白蛋白(bsa)封闭1h，然后在4℃下与一抗孵育16h。在用pbs洗涤3次后，与对应的alexa fluor-缀合的二抗igg(全部以1:100稀释)孵育60min，并用pbs洗涤3次。在用pbs洗涤3次后，与第二一抗孵育60min，随后与对应的alex fluor-缀合的二抗igg孵育。核用hoechst 33342复染，然后用zeiss lsm 700共聚焦显微镜(carl zeiss,thornwood,ny)进行分析。对应的小鼠和兔血清分别用作单克隆和多克隆一抗的阴性对照。
[0284]
统计分析
[0285]
所有总结数据均报告为平均值
±
sd。计算每组的显著性，并且通过微软excel(microsoft,redmont,wa)利用双尾student’s t检验进行比较。检验结果报告为p值，其中p《0.05被视为具有统计学上显著性。实施例7：pax6控制角膜缘微环境细胞的神经嵴潜能以支持角膜缘上皮干细胞的自我更新
[0286]
在眼表面，角膜上皮干细胞(sc)位于角膜和结膜交界的角膜缘中。从角膜缘上皮sc下方的角膜缘基质来看，角膜缘微环境细胞(lnc)的亚群表达sc标志物(例如oct4、sox2、nanog、rex1、巢蛋白、n-cadherin和ssea4)并显示出具有分化为血管内皮细胞、周细胞、成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的潜能。从整个人角膜缘基质来看，其他基质也分离出可分化为神经元和视网膜感觉纤毛的祖细胞。已报道基质支持角膜缘上皮干(祖)细胞中的角膜缘微环境细胞(lnc)通过促进全克隆和防止角膜上皮分化而比中枢角膜基质细胞中的更好。值得注意的是，角膜基质细胞(csc)亚群也可以分离，从而具有形成球体和分化为除表达角膜蛋白的角膜细胞以外的脂肪细胞、神经元和软骨细胞的潜能。上述角膜缘和角膜基质祖细胞表达发育神经嵴基因，例如atp结合盒(abcg2)、巢蛋白、musashi-1、sox2、six2/3和sox9。这些结果表明角膜缘和角膜基质可能含有多能祖细胞。可以合理的推断，这些基质祖细胞是由于发育期间颅神经嵴的眼间质迁移产生的。
[0287]
成对盒同源异型基因6(pax6)是保守进化的转录因子，对于眼、中枢神经系统、颅面骨骼、嗅觉上皮和胰腺的正常发育是必需的。在眼中，pax6的主要功能是介导视泡头外胚层进入晶状体外胚层并促进晶状体泡的形成。纯合pax6缺陷小鼠胚胎表现出缺少眼和鼻，并且出生后不久即死亡。由于突变或缺失等位基因导致人先天无虹膜症及小鼠动物模型中小眼症(sey，pax6
/-)，因而pax6表达呈剂量依赖性。无虹膜症相关的角膜病变(ark)患者观察到角膜缘干细胞缺陷(lscd)的典型眼表疾病。然而，导致lscd的潜在病理生理机制仍有待研究。出生后pax6的表达仅限于角膜和角膜缘上皮细胞。研究报道人和小鼠中角膜表皮中pax6水平不足导致异常分化。值得注意的是，杂合成年小鼠的角膜基质和内皮中有严重的pax6
/-缺陷，但在愈合延迟的上皮细胞中这种影响较小。因为角膜基质在发育过程以及在前述角膜缘和角膜基质祖细胞中均发现了pax6的短暂表达，可以推断，pax6在角膜缘基质中的表达对维持角膜上皮稳态可能起到了独特的发育作用。本文发现，pax6的表达和核定位可区分lnc与csc，并在关于标志物表达、神经球形成和神经胶质分化方面与神经嵴祖细胞状态具有因果关系。此外，lnc之所以能通过抑制角膜上皮分化及保持全克隆形成来支持角膜缘上皮sc的自我更新，这种表型起到了至关重要的作用。
[0288]
结果
[0289]
46kda pax6在角膜缘微环境细胞中的独特核表达
[0290]
为了确定分离后lnc和csc在瞬时表达pax6中是否存在差异，使用胶原酶消化从相
同供体的含上皮角膜缘基质和剥去上皮的角膜缘基质中分离出lnc和csc。pax6和角蛋白(pck)免疫双染表明，如预期，pck( )上皮细胞中pax6的核染色呈阳性，但在新鲜分离的pck(-)lnc中也呈阳性(图29a，箭头所示)。相反，在pck(-)csc中观察到pax6细胞质染色较弱(图29a)。然后，在改良无血清esc培养基(mescm)中在包被的matrigel
tm
上扩增lnc和csc，并与在dmem/10％fbs中或在神经干细胞扩增培养基(nscm)中塑料上扩增的csc进行比较。相位图像显示，第4代(p4)培养物的细胞均显示了类似的纺锤体细胞(图29b)。与在mescm中包被的matrigel
tm
上培养的p4 csc相比，p4 lnc的pax6以及其他神经嵴标志物(例如p75
ntr
、musashi-1、sox2、巢蛋白、msx1和foxd3)的转录物表达明显更高(图29c，##p《0.05)。与在mescm中包被的matrigel
tm
上扩增的p4 csc相比，在nscm中培养的p4 csc中pax6、musashi-1、sox2和msx1的表达较高(图29c，*p《0.1，**p《0.05)，但p4 csc在dmem/10％fbs中培养时，p75
ntr
、巢蛋白、msx1和foxd3的表达下调(图29c，*p《0.1，**p《0.05)。
[0291]
免疫荧光染色证实了这些间质细胞普遍表达波形蛋白。但是，在mescm中包被的matrigel
tm
上培养时，p4 lnc中可观察到pax6的核染色，而p4 csc中主要观察到pax6的细胞质染色(图29d)。此外，p4 lnc表达p75
ntr
、musashi-1、sox2和sox10核表达以及巢蛋白的强胞质表达。相反，csc对应物弱表达或不表达pax6、p75
ntr
、musashi-1和sox2核染色，并且巢蛋白表现出弱胞质染色(图29d)。如前所述，在证实arpe-19细胞裂解物阳性对照中抗体识别46kda pax6蛋白的特异性后，然后通过western印迹分析证实46kda pax6蛋白由p4 lnc显著表达，高于p4 csc(图29e)。这些结果共同地表明46kda pax6有助于p4 lnc中pax6的核染色，并与其他神经嵴标志物的高表达相关。
[0292]
lnc中的核pax6在连续传代后丧失
[0293]
先前已报道，p4 lnc表现出分化为血管内皮细胞或周细胞的血管新生潜能，能够稳定血管形成，并且比人骨髓来源的间质干细胞更有效地分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。为了了解连续传代是否可能影响pax6的核定位和神经嵴标志物在lnc中的表达，从四个不同的角膜缘象限(标记为a-d)分离lnc，并从相同供体组织的中央角膜(标记为e)分离csc(图30a)，并且在mescm中包被的matrigel
tm
上连续扩增。lnc和csc两者在p4时具有相似的纺锤体细胞，在p10时表现为细胞逐渐增大(图30b)。a区(即，上角膜缘)的lnc达到p13，累积细胞倍增20.2倍，b-d区的lnc达到p8-p9，平均累积细胞倍增10.9
±
1.9倍，而csc达到p8，累积细胞倍增9.6倍(图30c)。p2后扩增的lnc不表达上皮标志物(例如细胞角蛋白12(ck12)和细胞角蛋白15(ck15))的转录物。在p4时周细胞标志物(例如α-sma、pdgfrβ)和间质干细胞标志物(例如cd105)的转录物表达较高(图30d)。还发现了flk-1(vegfr2)、cd31和cd73通过连续传代而连续表达(图30d，**p《0.01，n＝3)。与p4时的表达水平相比，连续传代降低了a区和b区lnc中pax6、p75
ntr
、musashi-1、sox2、巢蛋白、foxd3和msx1的表达(图30e，**p《0.01，n＝3)。
[0294]
免疫荧光染色进一步显示了p4 lnc的pax6核染色，而p10 lnc的染色几乎为零；p4时p75
ntr
和sox2的核染色在p10 lnc中已丧失(图30f)。观察到细胞增大时，p4时musashi-1和巢蛋白的细胞质和细胞核染色在p10时减少(图30f)。western印迹分析证实46kda pax6蛋白由p4 lnc显著表达，而在p10 lnc中几乎无表达(图29e)。a区中细胞核pax6( )lnc的百分比通过连续传代显示逐渐下降(图30g)。这些数据共同地表明lnc在mescm中包被的matrigel
tm
上连续传代导致核pax6逐渐丧失，伴随神经嵴标志物的表达降低以及血管新生
和msc标志物的表达增加。
[0295]
连续传代导致lnc中神经潜能下降
[0296]
体外神经球生长测定是神经干细胞的黄金标准。lnc的连续传代导致核pax6染色和其他神经嵴标志物的表达降低和丧失，因此我们想了解这种改变是否与由神经球形成和神经胶质分化潜能所确定的神经祖细胞状态的丧失相关。将4个区域的lnc和csc连续传代，并在含有1.6％甲基纤维素的神经球培养基中，以5
×
103/cm2的相同密度接种在包被聚hema的12孔板中7天。球体大小呈递增态(图31a，a区的代表性p4和p10 lnc)。活细胞和死细胞测定显示，这些来自p4 lnc的球体在第6天是活的，如钙黄绿素am染色呈阳性而溴乙啡锭二聚体染色呈阴性所证实(图31b)。第6天，对直径大于50μm的球体进行计数，结果表明在p2至p8之间，csc的球体形成效率为0.3
±
0.1％(图3c)。相反，所有4个区域的p2 lnc的效率明显较高，即为2.9
±
0.5％(
##
p＝0.0006，n＝3)，a区显著高于其他3个区域(图31c，**p＝0.003，n＝3)。对于所有角膜缘区域，连续传代后球体形成效率下降，在p10时达到0.8
±
0.4％(图31c)。p4 lnc神经球表达的p75
ntr
和musashi-1转录物水平显著高于p4 csc神经球(图31d，**p＝0.001，n＝3)。p4 csc神经球表达p75
ntr
和musashi-1水平显著降低(图3d，
#
p＝0.001，n＝3)，但巢蛋白和msx1的表达水平高于作为对照的在包被的matrigel
tm
上培养的p4 csc(图31d，
#
p＝0.001，n＝3)。免疫荧光染色证实p4 lnc神经球中pax6的核染色以及musashi-1的细胞质和细胞核染色呈阳性，但p4 csc神经球中pax6的细胞质染色较弱且musashi-1表达呈阴性，并且二者在巢蛋白的染色模式上没有差异(图31e)。在包被的matrigel
tm
上培养的p4 lnc可分化为表达神经微丝(nfm，红色)和β-iii微管蛋白(绿色)的神经元、表达o4的少突胶质细胞以及表达胶质纤维酸性蛋白(gfap)的星形胶质细胞(图31f)。相反，p10 lnc不能分化为星形胶质细胞，尽管它们仍然能够分化为神经元和具有较大细胞的少突胶质细胞(图31f)。这些结果共同地支持lnc连续传代导致神经嵴祖细胞状态丧失的观点，如通过神经球形成和神经胶质分化潜能降低所证实。
[0297]
p10 lnc中pax6的强制表达恢复神经嵴祖细胞状态
[0298]
pax6在p10 lnc中强制表达，表现为oct4、sox2、nanog和rex14转录物表达的逐渐丧失，pax6核染色的丧失以及神经嵴标志物的表达。已证实，在感染复数(moi)为100时，带有cmv启动子的腺病毒质粒构建体以及带/不带pax6的增强绿色荧光蛋白(gfp)(即ad-gfp-pax6(实验)和ad-gfp(对照)(图32a))具有最佳转染效率(图32b，*p《0.1和**p《0.05，n＝3)。与gfp转染细胞相比，gfp-pax6转染p10lnc上调esc标志物(oct4、sox2、nanog)和神经嵴标志物(p75
ntr
、musashi-1和foxd3)的转录物表达(图32c，**p《0.05，n＝3)。western印迹分析显示p10 lnc中的过表达增强了46kda pax6条带的强度(图32d)。46kda pax6过表达后，oct4(39kda)、p75
ntr
(30kda)和musashi-1(39kda)蛋白表达上调(图32d)。免疫荧光染色证实了pax6核染色是在gfp-pax6转染的p10 lnc中，而非在gfp转染的p10 lnc中(图32e)。pax6核染色与oct4和sox2的增强核染色共定位(图32e)。此外，pax6的强制表达也导致p75
ntr
在细胞核和细胞质中的表达增强以及musashi-1在细胞核中的表达增强(图32e)。
[0299]
与gfp转染细胞相比，gfp-pax6转染的p10 lnc中神经球形成(图33a)和神经球形成效率(图33b，*p＝0.001，n＝3)也显著提高。此外，gfp-pax6转染的p10 lnc在分别分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞期间其细胞尺寸减小(图33c)。gfp-pax6转染后，恢复p10 lnc分化为星形胶质细胞的潜能(图31f)，这也促进分化为具有nfm强表达的神经元
和具有o4表达的少突胶质细胞的潜能(图33c)。这些数据共同地表明pax6核定位和神经嵴祖细胞状态恢复有强因果关系。
[0300]
强制表达pax6的p10 lnc支持lepc的自我更新
[0301]
单个lepc与3d matrigel
tm
中的单个p4 lnc或p4 lnc聚集体重聚，从而防止角膜缘上皮祖细胞(lepc)的角膜命运决定过程/分化。此外，lepc和p4 lnc之间的重聚对角膜命运决定过程的阻碍大于lepc和p4 csc4之间的重聚。重复相同实验并发现与lepc和p4 lnc之间的重聚相比，lepc和p4 csc之间的重聚产生类似的细胞聚集体(图34a)，但δnp63α表达较高且ck12表达下降(图34b-34c)。在相同条件下，与与p4 lnc相比时，lepc和p10 lnc的重聚不改变转录物表达，但促进ck12蛋白的表达(图34b-34c)，这表明p10 lnc中pax6核染色的丧失与有利于lepc在角膜命运决定过程中起到推动作用有关。相反，与p10 lnc相比，与强制表达pax6的p10 lnc重聚后，bmi1的转录物表达显著提高，但ck12转录物和蛋白表达下调(图34b-34c)，这表明lnc中pax6表达的增加与lepc中角膜命运决定过程的抑制有关。
[0302]
在丝裂霉素处理的3t3成纤维细胞饲养层体外克隆形成实验中，在3d matrigel
tm
上lepc和p4 lnc重聚，使得全克隆细胞生长得更快(图34d)。本研究发现，在接种相同数量的pck 细胞时，lepc与p4lnc重聚产生的全克隆的集落形成效率(cfe)明显高于采用lepc或lep与p4 csc重聚的集落形成效率(图34e，*p＝0.02)。与lepc和p4 lnc的重聚相比，lepc和p10 lnc-gfp之间重聚产生的全克隆cfe明显降低(图34e，*p＝0.02)，这表明丧失pax6核染色的晚期传代lnc不支持lepc如p4 lnc一样强效的克隆生长，其维持pax6核染色。相反，与lepc和p10 lnc gfp重聚相比，lepc与强制表达pax6的p10lnc重聚产生的全克隆cfe显著提高(图34e，**p＝0.0001)，这表明pax6核染色使p10 lnc能够支持lepc的克隆生长。通过免疫荧光染色进一步表征所得全克隆，结果表明无论是否与p4 csc、p4 lnc或强制表达/不表达pax6的p10 lnc重聚，lepc中均存在有核p63α 全克隆(图34f)。然而，与p4 csc重聚后形成的全克隆中发现pax6 lepc，p4 lnc和p10 lnc gfp重聚后形成的全克隆中发现核pax6 和pax6-lepc，而与p10 lnc gfp-pax6重聚后形成的全克隆中发现核pax6-lepc(图34f)。与p4 csc和p10 lnc gfp重聚后形成的全克隆中发现ck12 基底和基底上层，与p4 lnc重聚后形成的全克隆中发现ck12 基底lepc，与p10 lnc gfp-pax6重聚后形成的全克隆中发现ck12-基底lepc(图34f)。总之，这些结果强烈表明pax6在p10 lnc中的过表达防止角膜命运决定过程，并促进3d matrigel
tm
中lepc形成全克隆。
[0303]
讨论
[0304]
在眼形态发生期间，表达pax6的颅神经嵴细胞参与晶状体基板、视网膜和前段的形成。在眼发育期间，角膜基质、睫状体、内皮和小梁网中可观察到pax6 核染色。本研究发现，新鲜分离的lnc(图29a)和早期传代(p4)的lnc(图30f)中有pax6 核染色，但其角膜对应物(即，p4 csc)中没有，其表现出pax6 的弱细胞质染色(图29d)。western印迹分析证实了46kda pax6负责p4 lnc的pax6核染色(图29e)。因为这种表型与esc标志物(例如oct4、sox2)和其他神经嵴标志物(例如p75
ntr
、musashi-1、sox2、巢蛋白、msx1和foxd3)的高表达(图30e)、神经球形成(图31a-31e)和分化成神经胶质谱系的潜能(图31f)有关，所以lnc中的46kda pax6核染色可作为表示神经嵴祖细胞状态的标志。其他研究也报道pax6在神经元分化中的作用。在容纳神经干/祖细胞的心室(生殖)区的放射状神经胶质细胞中也发现了较强的pax6 核染色。pax6-单倍体不足导致成年大鼠海马中形成的神经干/祖细胞减少。在
成人成纤维细胞中pax6和sox2的非病毒质粒转染直接使细胞重编程为神经前体细胞样状态。pax6-brg1/baf复合物是成年小鼠嗅球中将神经胶质转化为神经元的必要充分条件。因此，连续传代期间lnc中pax6核染色的逐渐丧失可能导致神经嵴标志物表达的逐渐丧失以及神经球形成和神经胶质分化潜能的降低(图31a-31f)。值得注意的是，连续传代期间神经嵴潜能的逐渐丧失与血管新生和msc标志物的表达增加相关，这表明lnc具有经历神经元和血管分化潜能的可塑性，成年哺乳动物神经嵴来源的颈动脉体中也发现这一点。需要进一步研究观察lnc是否在再生创伤愈合(需恢复神经和血管组织成分)起到了重要作用。
[0305]
46kda pax6在晚期传代lnc中的强制表达进一步证实了pax6在控制神经嵴祖细胞状态中的关键作用。强制表达腺病毒载体gfp-pax6的功能获得导致p10 lnc中重新出现46kda pax6核染色并重新表达神经嵴标志物(图32c-32e)，并且神经球形成和神经胶质分化潜能加强(图33a-33c)。新鲜分离的lnc中发现esc标志物(例如oct4、sox2、nanog和rex1)的表达，这些表达在连续传代期间也逐渐丧失。本文发现pax6在p10 lnc中的强制表达有助于恢复oct4和sox2以及神经嵴标志物的表达(图32c-32e)。染色质免疫沉淀测序研究表明pax6靶向神经祖细胞中的几个基因启动子。pax6与多能基因oct4和nanog直接结合以抑制其表达并促进人es细胞中的神经外胚层基因，并与sox2协同确保放射状胶质细胞向神经元分化的单向谱系定向。因此可以合理的推断，pax6的核定位可帮助增强核oct4、sox2和nanog以确保lnc中的神经嵴祖细胞状态。
[0306]
对于出生后角膜和角膜缘上皮，pax6与p63一起确定了表面外胚层的角膜缘上皮sc，并且与wnt7a一起通过促进角膜缘和角膜上皮细胞的ck12表达来控制角膜命运决定过程。为了证明lnc中pax6调节角膜缘上皮sc自我更新的重要作用，采用体外集落形成试验，该试验常用于测定单一sc的自我更新特性。上皮干(祖)细胞的证明标准为根据形态和表型特征将所得克隆细胞分类为全克隆、部分克隆和旁克隆。仅全克隆能够进行广泛增殖和自我更新，而部分克隆的增殖能力有限且不能自我更新，旁克隆不能进一步增殖。先前，遵循上述操作并采用相同的标准，并且报道p4 lnc与角膜缘上皮祖细胞(lepc)的重聚支持后者在3d matrigel
tm
中的自我更新，其证据是与单独使用lepc相比，未表达角膜上皮分化标志物细胞角蛋白12的全克隆产量更高。本文中通过成功建立lnc和lepc之间体外重聚测定，含有角膜缘上皮scs34的p10 lnc丧失pax6核染色(图30f)，其产生的全克隆比p4lnc少(图34e)。相反，lepc和具有强制表达pax6的p10 lnc重聚所生成的全克隆明显多于单独使用lepc或p10 lnc gfp与lepc之间的重聚(图34e)。lepc和p4 lnc之间的重聚阻碍角膜命运决定过程，其证据是，与单独使用lepc或lepc和p4 csc重聚相比，ck12的表达受抑制，lepc中的全克隆增强(图34b-34c)。尽管与p4 lnc或p10 lnc重聚时，lepc中上皮祖细胞标志物(例如bmi-1和δnp63α)和角膜命运标志物(例如ck12)的转录物表达无改变，但46kda pax6在p10lnc中的强制表达上调bmi-1转录物，下调ck12转录物和蛋白(图34b-34c)，这表明pax6在lnc防止lepc参与角膜命运决定过程中起到重要作用。该发现伴随全克隆cfe增大(图34e)，其中基底上皮单层独特表现出小而均匀的细胞核p63α 染色、pax6-核染色以及阴性ck12(图34f)。
[0307]
基于这些研究，pax6在lnc支持角膜缘上皮sc的自我更新中具有重要作用。上角膜缘(即a区)的lnc(图30a)保持最大传代数，以及pax6 核染色最高并表现出最大的神经球形成，该结果也支持上角膜缘包含角膜缘最突出的vogt栅栏，其确定角膜缘sc微环境的普遍
观点。
[0308]
材料和方法
[0309]
细胞分离和扩增
[0310]
在4℃下在optisol(chiron vision，irvine，ca)中保存小于7天的人角巩膜缘和中央角膜扣状体获自不同供体(florida lions eye bank，miami，fl)。组织用含有50μg/ml庆大霉素和1.25μg/ml两性霉素b的ph为7.4的pbs漂洗三次，除去多余的巩膜、结膜、虹膜、角膜内皮和小梁网直至角膜巩膜边缘的施瓦尔贝氏线，随后将组织切成1mm以内并超过解剖边缘的上、鼻、下和颞象限(图30a，用a至d区表示)。通过在在含5％co2的湿润培养箱中于4℃下在塑料皿中，用在改良胚胎干细胞培养基(mescm)中的10mg/ml分散酶消化各角膜缘象限16h，获得包括基底上皮细胞的完整上皮薄片，该mescm由补充有10％敲除血清、10ng/ml lif、4ng/ml bfgf、5mg/ml胰岛素、5mg/ml转铁蛋白、5ng/ml亚硒酸钠补充剂(its)、50μg/ml庆大霉素和1.25μg/ml两性霉素b的dulbecco改良eagle培养基(dmem)/f-12营养混合物(f-12)(1:1)制成。用2mg/ml胶原酶a在37℃下消化16h分离lnc以产生漂浮团状物。以相同方式分离csc，不同的是，在37℃下在mescm中用10mg/ml分散酶ii消化中央角膜上皮2h(图30a，表示为e区)以受限除去上皮层。
[0311]
对于扩增，在mescm中，将用0.25％胰蛋白酶和1mm edta(t/e)消化角膜缘团状物或csc生成的单细胞按1
×
104/cm2接种于预包被5％matrigel
tm
的6孔板中，并在5％co2湿润环境下培养，每3-4天更换培养基，共培养6-7天。在一些实例中，csc在神经干细胞无血清扩增培养基(nscm)中扩增，该培养基由补充2％神经补充物(由b-27和n-2组成)、20ng/ml人fgf-碱性重组体、20ng/ml人egf重组体的dmem/f-12(1:1)组成。csc在含有10％fbs、50μg/ml庆大霉素和1.25μg/ml两性霉素b的dmem中在塑料上扩增。细胞汇合达到80-90％时，以5
×
103/cm2的接种密度连续扩增至13代。通过细胞倍增数(ncd)测量总扩增的程度，计算公式：ncd＝log10(y/x)/log102，其中“y”是细胞的最终密度，“x”是细胞的初始接种密度。
[0312]
体外重聚测定
[0313]
进行体外重聚测定。简言之，将ad-gfp或ad-gfp-pax6转染的p4 lnc、p4 csc和p10 lnc在包被的matrigel
tm
上扩增，在mescm中以5
×
104细胞/cm2的密度接种于3d matrigel
tm
中24h以产生聚集物。将从分散酶分离的角膜缘上皮薄片得到的单个lepc以5
×
104细胞/cm2的密度接种于含/不含上述lnc或csc聚集物的3d matrigel
tm
中，保持6天。在37℃下，用10mg/ml分散酶ii消化matrigel
tm 2h，收获所得的球体，其中一些球体在制备用于离心涂片前通过t/e成单细胞。
[0314]
体外集落形成测定
[0315]
在补充激素上皮培养基(shem)中对丝裂霉素处理的3t3成纤维细胞饲养层进行体外上皮集落形成测定，该培养基由等体积的hepes缓冲的dmem和ham’s f-12制成，ham’s f-12含有碳酸氢盐、0.5％二甲亚砜、2ng/ml小鼠源表皮生长因子、5mg/ml胰岛素、5mg/ml转铁蛋白、5ng/ml亚硒酸钠、0.5mg/ml氢化可的松、30ng/ml霍乱毒素a亚基、5％胎牛血清(fbs)、50mg/ml庆大霉素和1.25mg/ml两性霉素b。简言之，将从与或不与gfp或gfp-pax6转染的p4 lnc、p4 csc和p10lnc重聚获得的总计2,000个单细胞接种于mmc处理的3t3成纤维细胞饲养层上10天。将所得克隆生长在4％多聚甲醛中固定，并通过标记克隆的1％罗丹明b染色溶液评估，计算克隆数除以接种pck 细胞总数(通过pck/vim免疫双染法测定)的百分比，由此测
量集落形成效率。根据皮肤角质细胞标准49，将克隆形态细分为全克隆、部分克隆和旁克隆。
[0316]
gfp-pax6的强制表达
[0317]
在mescm中包被的matrigel
tm
上的p10 lnc中进行强制表达实验，通过以0、4、20、100、500和2500的moi加入ad-gfp-pax6或ad-gfp持续1-5天，ad-gfp-pax6是巨细胞病毒(cmv)启动子控制下表达人增强gfp-pax6构建基因(pax6的ncbi参考序列是bc011953)的预封装人腺病毒5型载体(de1/e3)，ad-gfp是具有gfp启动子的空载体(二者均购自vector biolabs，malvern，pa)。
[0318]
神经球形成
[0319]
在神经干细胞培养基(nscm)中，将不同代系扩增的lnc或csc单细胞以5000/cm2的细胞密度铺板于12孔板中抗粘着聚hema上6天，nscm由20ng/ml egf、20ng/ml fgf2、2％nscm补充物和1.6％甲基纤维素组成。用相位显微镜监测球体形成，并在第6天用zeiss axio-overserver z1电动倒置显微镜(carl zeiss，thornwood，ny)对整个12孔板中直径大于50μm的球体进行计数。将球体的总数除以接种细胞的总数
×
100％来计算神经球形成效率。
[0320]
神经胶质分化
[0321]
在补充0.5％n2和1％b27的nscm中，将1
×
104/ml的p4或p10lnc接种于48孔板中包被50μg/ml聚-l-鸟氨酸和20μg/ml层粘连蛋白或胶原iv型的盖玻片上持续2天。对于神经元分化，将培养基更换为添加10ng/ml fgf2和20ng/ml bdnf的含有dmem/f12(1:3)以及0.5％n2和1％b27的神经元诱导基础培养基(培养基a)处理3天以及更换为添加6.7ng/ml fgf2和30ng/ml bdnf的基础培养基另持续3天。然后将细胞换至添加2.5ng/ml fgf2、30ng/ml bdnf、200mm抗坏血酸的基础培养基中另持续8天。对于少突胶质细胞分化，然后将培养基更换为添加10ng/ml fgf2、10ng/ml pdgf和10μm毛喉素的含有dmem/f12(1:1)以及1％n2的基础培养基持续4天，然后将培养基更换为添加10ng/ml fgf2、30ng/ml 3,3,5-三碘甲状腺原氨酸和200μm抗坏血酸的基础培养基另持续7天。对于星形胶质细胞分化(thermo scientific，santa clara，ca)，将培养基更换为含有1％fbs、1％n2和2mm glutamax的dmem持续10天。诱导培养基每3-4天进行更换。
[0322]
rna提取、逆转录和定量实时pcr
[0323]
在第6天，根据生产商指示，用rneasy mini试剂盒(qiagen，valencia，ca)从扩增的lnc、csc或神经球提取总rna，并使用高容量逆转录试剂盒(applied biosystems，foster city，ca)，用引物将1-2μg的rna提取物逆转录为cdna。在7300实时pcr系统(applied biosystems，foster city，ca)中用特异性taqman基因表达测定预混液和通用pcr预混液扩增所得cdna，实时rt-pcr配置由以下组成：在95℃下初始激活10min，然后在95℃下变性15s，共40轮，以及在60℃下退火和扩增1min。相关基因表达数据通过比较ct方法(δδct)进行分析。所有测定重复进行三次。将结果通过甘油醛3-磷酸脱氢酶(gapdh)作为内部对照进行归一化。
[0324]
免疫荧光染色
[0325]
在37℃下用0.05％胰蛋白酶和1mm edta处理10min收获具有/不具有pax6强制表达敲低的不同代系的lnc或csc单细胞及其神经球，使用cytofuge(statspin inc.，
norwood，ma)以1000rpm离心8min将其制备成细胞离心涂片。将细胞用4％甲醛ph 7.0在室温下固定15min，用0.2％triton x-100/pbs透化15min，并用2％牛血清白蛋白(bsa)封闭1h，然后与在4℃下与一抗孵育16h。在用pbs洗涤3次后，与对应的alexa fluor-缀合的二抗igg(全部以1:100稀释)孵育60min，并用pbs洗涤3次。计算核pax6阳性细胞百分比的方法基于通过共聚焦显微镜拍摄的pax6染色和hoechst 33342核复染的免疫荧光染色图像使用axiovision软件(carl zeiss，thornwood，ny)的核pax6阳性细胞的计数。相应的小鼠和兔血清分别作为单克隆抗体和多克隆一抗的阴性对照。在37℃下，将神经球在含有4μm ethd-1和2μm钙黄绿素am的nscm中培养30min，在共聚焦显微镜下，分别在494/517nm处荧光检测活细胞，在528/617nm处荧光检测死细胞。
[0326]
western印迹
[0327]
在第4天，用含有放射免疫沉淀测定缓冲剂、蛋白酶抑制剂混合物(100x)和1mm苯甲基磺酰氟(sigma-aldrich，st.louis，mo)的冷裂解缓冲剂从ad-pax6 gfp或ad-gfp转染的p10 lnc提取细胞裂解物。通过bca测定法(pierce，rockford，il)测量并归一化细胞裂解物的总蛋白，并将5μg蛋白裂解物上样于4-15％(w/v)梯度十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上，并用微型转印迹电泳转移仪(bio-rad，hercules，ca)将其转移到硝酸纤维素膜上。用ph为7.5，含150mm nacl，0.05％tween-20的50mm tris-hcl中的5％(w/v)脱脂牛奶封闭各膜1h，然后用含特异性一抗的5％(w/v)脱脂牛奶在4℃下孵育过夜，随后与其各自的辣根过氧化物酶缀合的二抗孵育，使用抗组蛋白3和β-肌动蛋白作为上样对照。通过western lightning化学发光法(perkinelmer，waltham，ma)使用imagequant las 4000数字成像系统(ge healthcare piscataway，nj)检测免疫反应条带。
[0328]
统计分析
[0329]
所有总结数据均均报告为平均值
±
sd。计算每组的显著性，并且通过微软excel(microsoft,redmont,wa)利用双尾student’s t检验和anova进行比较。检验结果报告为p值，其中p《0.05被视为具有统计学上显著性。实施例8：细胞中cxcr4的核移位
[0330]
将在年轻胎儿血液和骨髓间质干细胞(msc)的细胞质和细胞核中发现的内源性cxcr4与在成年msc中表达cxcr4的质膜进行比较。观察到sdf-1处理后，内化cxcr4与其他蛋白(例如铁蛋白、热激同源蛋白(hsc73)、网蛋白和肌球蛋白iia)相互作用。值得注意的是，内源cxcr4的内化由rac1通过胞外结构域2(ecl2)进行特异性调节，胞外结构域2控制cxcr4的构象异质性。抑制剂nsc23766或eht1864对rac1的抑制导致细胞表面cxcr4减少。针对该结构域的不同cxcr4抗体可以区分构象变化，从而影响细胞表面上的共同受体效率。这些数据使用抗cxcr4抗体(克隆44716.111)，已知该抗体特异性识别ecl2结构域，并在15min时移位至细胞核。先前的观察结果表明，rac1在5和15min被可溶性hc-ha/ptx3短暂激活，但在30min时活性下降，相比于ha的rac1 gtp酶活性逐渐下降(图37a-37c)。这可能表明cxcr4内化至细胞核与30min时rac1的减少相关。实施例9：确定在3d matrigel(mg)上由hc-ha/ptx3 lnc促进的pax p10 lnc神经嵴祖细胞的逆转是否可以保持角膜缘上皮祖细胞/干细胞的自我更新
[0331]
先前的研究已证明，在角膜缘上皮祖细胞(lepc)和p4 lnc之间的体外重聚测定中保持自我更新状态，防止角膜sc上皮在3d matrigel中分化，并促进它们在丝裂霉素c阻滞
的3t3成纤维细胞饲养层上的克隆形成潜能。已证实，固定的和可溶性hc-ha/ptx3在48h时逆转具有神经嵴表型的p10 lnc，并且cxcr4介导的信号传导是促进pax6 p10 lnc的必需条件。在本实施例中，欲了解逆转pax6p10 lnc是否支持lepc在3d mg上的自我更新。
[0332]
实验设计
[0333]
球体生长的上皮祖细胞状态通过在补充激素上皮培养基中3t3成纤维细胞饲养层上的克隆测定来确定，该培养基由等体积的hepes缓冲的dmem和ham’s f-12制成，ham’s f-12含有碳酸氢盐、0.5％二甲亚砜、2ng/ml小鼠源表皮生长因子、5mg/ml胰岛素、5mg/ml转铁蛋白、5ng/ml亚硒酸钠、0.5mg/ml氢化可的松、30ng/ml霍乱毒素a亚基、5％胎牛血清(fbs)、50mg/ml庆大霉素和1.25mg/ml两性霉素b。饲养层通过以下制备：在含10％新生牛血清的dmem中，用4mg/ml丝裂霉素c(mmc)在37℃下处理80％亚汇合的3t3成纤维细胞2小时，然后以2
×
104个细胞/mm2的密度接种。
[0334]
将p10和p4 lnc用或不用固定的hc-ha/ptx3或可溶性hc-ha/ptx3预处理48h。5
×
104/cm2处理的lnc与3d mg上5
×
104/cm2lepc重聚，在第6天用10mg/ml分散酶在37℃下收获球体生长2h。将收获的球体进行qpcr和集落形成测定。
[0335]
对于集落形成测定，将500lepc或重聚的1,000个单细胞球体生长接种在mmc处理的3t3成纤维细胞饲养层上另外8-10天。通过1％罗丹明b染色评估所得克隆生长，这允许通过计算克隆数除以用pck和vimentin免疫双染的初始接种的pck细胞总数的百分比而测量集落形成效率。基于针对皮肤角质细胞建立的标准，将克隆形态学细分为全克隆、部分克隆和旁克隆。
[0336]
结果
[0337]
在人角膜巩膜边缘的横切面中的发现证明，膜notch 1和notch 2受体主要在角膜和结膜上皮中强表达，但在角膜缘基底上皮中不存在。数据进一步表明，抗nicd抗体染色主要在角膜上基底和结膜上皮的核中发现，但在角膜缘上基底上皮的核中呈弱表达，并且在角膜缘基底上皮中不存在，这进一步表明在角膜缘基底上皮中nicd-notch信号传导被抑制(图38a)。此外，还发现notch3、jagged1和hes1在角膜缘基底上皮和其下层间充质细胞中强表达(图38a-38b)。一致地，胶原酶分离的角膜缘团状物显示弱核nicd表达的pck 细胞。值得注意的是，pck阴性群体(非上皮)含有核nicd( )细胞(非圆圈箭头)和nicd(-)细胞(图38b，圆圈箭头)的混合物。这些数据共同表明，notch3/jagged1在角膜缘上皮和间充质细胞中可能与notch1起不同的作用。
[0338]
最近，已报道hc-ha/ptx3上的p10 lnc促进细胞聚集和具有神经嵴表型和神经嵴潜能的核pax6。这些初步数据证明，(5)固定的hc-ha/ptx3(而非3d matrigel)上的p4 lnc上调notch2/3、notch配体、jagged1、dll和hes1信号传导的转录物表达(图39a)。不清楚hc-ha/ptx3促进notch3独特上调，将促进lnc成为尚未定向上皮的谱系阴性神经上皮(p63-)。
[0339]
通过dapt阻断notch信号传导不防止细胞聚集(图39b)，但进一步促进具有met上皮表型的notch1/2/3/jagged 1/hes1信号传导(p63a、pax6、sox9)(图39c)，这表明抑制阻断hc-ha/ptx3上lnc中的典型notch信号传导的α-分泌酶实际上促进上述基因表达。如果这种上调与notch信号传导(即核hes1)相关，则notch信号传导可以被非典型notch信号传导促进(图39a-39e)。western印迹证明，hc-ha/ptx3/4p或4g上的hcf促进e-钙粘蛋白(图39e)，这表明hc-ha/ptx3也可促进lnc中的met。若是如此，则似乎这种met由jagg1-notch3
信号传导介导是合理的，其可能不被典型notch信号传导抑制。尚不清楚上述信号传导是否需要notch 3/jagged 1维持。
[0340]
当在固定的hc-ha/ptx3上比较两种细胞类型lepc和lnc时，单独的lepc表达notch1、dll1、jag2、lfng和mfng，而单独的lnc表达notch2、notch3和jagged 1(图40a)。该数据与图39a中的notch配体和受体表达一致。当lepc与lnc在固定的hc-ha/ptx3上共培养时，notch2/3的转录物被进一步促进，这提示lepc lnc的共培养增强notch2/3的表达。
[0341]
先前已显示，lnc lepc在hc-ha/ptx3上的共培养促进bmp和pcp信号传导和静止标志物，lepc的bmi-1。尚不清楚bmp和pcp信号传导如何被激活的机制。这些初步数据表明，当在lepc lnc中通过dapt阻断notch信号传导时，显著下调静止上皮标志物(图41a)，并导致核psmad/1/5/8和c-jun的缺乏。因为dapt也抑制其他notch受体，所以需要notch3特异性抑制剂来验证这种发现证明bmp和c-jun需要notch3/jagged1特异性信号传导用于sc静止。实施例10：notch信号传导在人角膜、角膜缘和结膜中的体内表达
[0342]
在角膜中，已经报道notch信号传导在命运决定、分化和创伤愈合中调节角膜短暂扩增的角膜上皮(tac)的维持。notch 1-/-小鼠使角膜上皮导入过度增殖的皮肤样表皮中。在角膜上皮特异性k14 nicd转基因小鼠中过量表达促进角膜上皮创伤愈合。尽管notch1/2受体已被报道在人角膜上基底上皮主要表达，而在角膜缘基底上皮不存在，但其他研究小组报道了相反的发现，即在角膜缘基底和下层上基底上皮上存在膜notch1。notch蛋白配体delta i、jagged 1和jagged 2已表征为在整个角膜上皮中表达。hey和hes蛋白在抑制bhlh激活剂驱动的神经元分化和维持神经干细胞命运中彼此合作。本实施例的目的是确认和鉴定它们是否在角膜上皮和角膜、角膜缘和结膜中的下层基质之间发生多于一个的notch信号传导。
[0343]
实验设计
[0344]
从florida lions眼库获得少于5天的人角巩膜边缘，并且根据赫尔辛基宣言进行处理。简言之，在用50μg/ml庆大霉素和1.25μg/ml两性霉素b将边缘用pbs漂洗三次后；除去虹膜、小梁网和内皮。
[0345]
结果
[0346]
在人角膜巩膜边缘的横切面中的结果证明，膜notch 1和notch 2受体主要在角膜和结膜上皮中强表达，但在角膜缘基底上皮中不存在。这些数据进一步表明，抗nicd抗体染色主要在角膜上基底和结膜上皮的核中发现，但在角膜缘上基底上皮的核中呈弱表达，并且在角膜缘基底上皮中不存在，这进一步表明在角膜缘基底上皮中nicd-notch信号传导被抑制(图38a)。此外，发现notch3、jagged1和hes1在角膜缘基底上皮和其下层间充质细胞中强表达(图38a-38b)。实施例11：notch3/jagged1/hes1在基底上皮中的表达和来自新鲜分离的角膜缘团状物的pck-/波形蛋白 /pax6 lnc。
[0347]
先前已经证明，胶原酶a分离的团状物含有角膜缘上皮及其下层的间充质微环境。那些微环境细胞独特地表达神经嵴祖细胞定义的pck-/vim /pax6 间充质细胞表达的sox2、p75
ntr
、musashi-1和msx1。当与角膜基质和上皮细胞比较时，要质疑的是notch3/jagged1/hes1的表达是否确实在具有下层基质的角膜缘基底上皮中高表达。
[0348]
实验设计
[0349]
根据赫尔辛基宣言处理人组织。在本研究中，来自年龄为61岁的供体的人角膜巩膜缘由florida lions眼库提供。在中心角膜扣状物用于角膜移植后，立即将它们转移至optisol-gs(bausch&lomb；www.bausch.com))中，并且在4℃下运输至实验室。然后用含有50mg/ml庆大霉素和1.25mg/ml两性霉素b的ph值为7.4的pbsx1漂洗边缘三次。所有材料用于细胞培养。在除去多余的巩膜、结膜、虹膜和角膜内皮后，将组织切成12个one-clock-hour段，通过在解剖学边缘内和超出解剖学边缘1mm处进行切割，从该段获得角膜缘片段。通过用mescm消化每个角膜缘段，可以获得包括基底上皮细胞的完整上皮薄片。可选地，中央角膜含有由主要基底上皮细胞组成的完整上皮薄片，通过在37℃下分散酶消化2h获得，并且然后用在mescm中的1mg/ml胶原酶a在37℃下消化剩余的基质16h。平行地，每个角膜缘段，没有任何进一步修剪任何基质组织，直接用在shem中的1mg/ml胶原酶a在37℃下和湿润的5％co2下消化16h以产生称为“团状物”的细胞聚集体。
[0350]
结果
[0351]
结果示于图38b。pck阴性群(非上皮)含有核nicd( )细胞(白色箭头)和nicd(-)细胞(图38b，圆圈箭头)的混合物。实施例12：hc-ha/ptx3(而非基底膜3d matrigel)在lnc中独特地激活notch3
[0352]
一致地，胶原酶分离的角膜缘团状物显示弱核nicd表达的pck 细胞。实施例11中的初步数据共同表明，notch3/jagged1在角膜缘上皮和间充质细胞中可能与notch1起不同的作用。
[0353]
hc-ha/ptx3上(而非塑料或3d matrigel上)的p4 lnc，通过上调notch配体notch2、notch3、dll2和受体jagged 1和dll2以独特地促进notch信号传导。相反，3d matrigel独特地促进β-1,3-n-乙酰葡糖胺转移酶狂躁基因同源蛋白(mfng)(图42)。将lepc加入hc-ha/ptx3、notch2和notch3上的lnc中，在lnc中独特表达，其中notch1、dll1、jagged 1、jagged 2、边缘性精神错乱同源基因(lfng)和狂躁基因同源蛋白的上调具有lepc依赖性。lepc中的核bmi-1在角膜缘中表达，但在角膜或结膜中不表达。尚不清楚胶原酶分离的团状物是否以类似的方式表达。
[0354]
实验设计
[0355]
在mescm中，将1
×
105/ml的p10 lnc接种于三种基材(包被的matrigel、ha或hc-ha/ptx3)上48h。对于可溶性hc-ha/ptx3的时程研究，用hc-ha/ptx3处理p10 lnc 5min、15min、30min、60min、24h和48h。
[0356]
结果
[0357]
时程揭示，与3d matrigel上的转录物水平相比，早在15min时hc-ha/ptx3促进notch3/jag1和hes1的mrna表达，在120min时在p10 lnc中达到峰值千倍(图18a-18c，**《0.05，n＝3)。免疫荧光染色证实，早在5min时hc-ha/ptx3促进核hes-1，但在3d matrigel中弱表达。当使用识别核nicd结构域的抗体时，60min内在核中不存在notch1和notch3的表达，这表明核hes-1可能是通过非典型notch信号传导介导的notch。
[0358]
讨论
[0359]
已报道notch信号传导的激活对于将颅神经嵴来源的间充质细胞转化为血管周细胞是必需的。在小鼠胚胎成纤维细胞系或颅神经嵴间充质中，通过表达nicd而组成型激活notch通路足以促进细胞进入血管周细胞命运。配体结合notch的激活触发其细胞外结构域
被金属蛋白酶脱落。
[0360]
已经证明hes1的表达通过notch依赖和非依赖通路介导以促进血管新生和神经发生。hes1的振荡已经被证实具有notch非依赖性，并且通过es细胞中的bmp和lif信号传导、es衍生的神经祖细胞中的fgf2-jnk轴、具有hes1的持续表达以维持树突生成的ngf-nf-kb、用于视网膜祖细胞增殖和视网膜神经节细胞命运特化的vegf-flk-1-erk以及结合hes1的启动子以增强神经sc维持的pax3的乙酰化来介导。
[0361]
已知hes1调节神经干细胞祖细胞的未分化状态/维持，以促进适当的神经元分化和细胞间相互作用的侧抑制。hes1的表达通常以每2小时的振荡方式进行，已在成纤维细胞和神经祖细胞中所证实。在没有hes基因的情况下，祖细胞仅提前分化成某些类型的神经元，并且在它们对于其他神经元和神经胶质细胞类型充分增殖之前被耗尽。这些数据显示，当用hc-ha/ptx3处理时，5分钟内发生hes1的短暂核移位。hes1的持续表达增强对前神经元基因的抑制并维持细胞的低增殖或静止模式。notch-hes1介导负责激活hif1a信号传导以在tyr 416处磷酸化stat3。尚不清楚负责蛋白hes1核翻译但由转录后事件表达的机制事件。实施例13：hc-ha/ptx3(而非ha和3d mg)使p10 lnc逆转为具有血管新生表型的pax6(核阳性)神经嵴祖细胞
[0362]
从角膜缘分离的天然角膜缘微环境细胞已经显示具有神经嵴和血管新生潜能。最近，已报道在p10时lnc的连续传代导致神经嵴祖细胞状态的丧失，其通过神经嵴祖细胞标志物(例如p75
ntr
、musashi-1、sox2、巢蛋白、msx1和foxd3)的下调以及神经胶质分化表征。类似地，细胞还丧失血管新生祖细胞状态，其通过flk-1、pdgfrβ和cd31的下调表征。已经证明，通过在可溶性hc-ha/ptx3中接种，而非在3d基底膜matrigel中接种，可以实现老化的p10 lnc逆转为具有神经嵴潜能。因为从am纯化的hc-ha/ptx3复合物由与hc1共价连接的hmw ha(》3000kda)和紧密结合的ptx3组成，所以推测hc-ha/ptx3(而非ha)是否能将老化的lnc独特地逆转为它们的天然神经嵴祖细胞(p75
ntr
、musashi-1、sox2、巢蛋白、msx1和foxd3)和血管祖细胞表型(flk-1、pdgfrβ和cd31)。
[0363]
实验设计
[0364]
用0.25％胰蛋白酶和1mm edta(t/e)消化后，将源于角膜缘团状物的单细胞以1
×
104/cm2接种在mescm中预包被5％matrigel
tm
的6孔板中，并且在湿润的5％co2中培养，每3-4天更换培养基，共6-7天。
[0365]
裂解用hc-ha/ptx3、ha或包被的mg处理的细胞，并且收获用于rt-pcr。比较cxcr4、sdf-1在可溶性hc-ha/ptx3(25μg/ml)上15min、30min、60min、120min、240min、24h和48h的神经嵴标志物(p75
ntr
、ngf、sox2、musashi-1)和血管新生标志物(pdgfrβ、vegfr和cd31)的mrna表达。
[0366]
对于胞嘧啶，在48h时收获p10 lnc，并且针对p75
ntr
、sox2、pdgfrβ、cd31进行if。
[0367]
收集用hc-ha/ptx3处理后0h、1h、2h、4h、24h、48h的上清液，用于使用特异性elisa(quantikine人vegf免疫测定；r&d systems，minneapolis，mn)测量培养基样品中的vegf、pdgfrβ和ngf。该测定识别vegf165以及vegf121。酶免疫测定多孔读数器在450nm发射下的读数用于定量结果。测定间变异系数为8.5％，并且测定的灵敏度为5pg/ml。
[0368]
结果
[0369]
相差显微术显示，早在60min时可溶性hc-ha/ptx3(而非在ha或包被的mg中)促进细胞聚集(图44)。定量rt-pcr揭示，当与3d mg(图21a和21c-21i，##p《0.01，n＝3)相比时，可溶性hc-ha/ptx3(图21a和21c-21i，**#p《0.01)或可溶性ha显著上调神经嵴祖细胞标志物(p75
ntr
、ngf、sox2和musashi-1)转录物以及血管新生祖细胞标志物受体pdgfrα/β、vegfr1/2和配体vegf、pdgfb、ng2、igf-1和cd31。实施例14：通过逆转p10 lnc可以避免hc-ha/ptx3(而非ha和3d matrigel)促进huvec中的抗血管新生
[0370]
先前已经表明早期p4 lnc表达神经血管表型，例如具有msc三系分化的血管周细胞标志物(周细胞-ec)(例如，flk-1、cd34、cd31、α-sma、pdgfrβ和ng2)和神经嵴标志物(pax6、p75
ntr
、musashi-1、sox2、msx-1、foxd3)。已经证明，可溶性羊膜提取物或hc-ha可独立抑制内皮(huvec)活力(即cd44)，并且抑制细胞增殖和抑制huvec管形成(数据未示出)。已知周细胞稳定血管和内皮细胞的存活。间充质干细胞(msc)与发育中的血管内皮细胞的共培养降低内皮细胞的增殖和凋亡速率。尚不清楚hc-ha/ptx3对huvec的凋亡的抗血管新生作用是否可以通过逆转晚期传代lnc而被避免。
[0371]
实验设计
[0372]
在补充2％fbs的ecgm中，将5
×
105/ml huvec和p10 lnc(2:1)接种在matrigel上，并用pbs或25μg/ml ha或hc
·
ha/ptx3处理16h或更长时间。基于代表性的相差显微照片，在hc
·
ha处理的培养物中发现较少的管形成。记录5个随机100
×
视野中每个视野管形成的总长度并且与对照pbs比较。预期hc-ha/ptx3在16h或更长时间时抑制huvec而非ha或未处理的细胞在3d matrigel上的管形成。
[0373]
在补充2％fbs的ecgm中，将5
×
105/ml huvec和/或p10 lnc(2:1)接种在matrigel上，并用pbs或25μg/ml ha或hc
·
ha/ptx3处理0h、30min、1h、4h、24h和48h。caspase-9在细胞质中发现并且是起始胱天蛋白酶，其是内源性细胞凋亡途径的一部分。在激活时，其移位至线粒体。线粒体破坏后，细胞色素c从线粒体中释放并且与apaf-1相互作用，导致caspase前体(pro-caspase)二聚化。二聚化作用激活pro-caspase-9，导致caspase-3激活。因此，通过caspase比色测定9(abcam，ab65608)进行的caspase 9凋亡测定，检测hc-ha/ptx3在huvec或/和lnc中的抗血管新生作用。为了进行测定，将裂解缓冲剂加入样品中。孵育后，基于从标记的底物lehd-p-na上切割后发色团对硝基酰苯胺(p-na)的检测进行测定。用微板读数器在400nm下定量p-na光发射。该测定允许在时程研究中最早的时间激活caspase-9。
[0374]
因为膜联蛋白v在细胞膜上凋亡细胞的早期表达(早于caspase
‑ꢀ
9)，所以使用荧光探针的凋亡/坏死检测试剂盒来确定膜联蛋白v(应早于caspase 9)被hc-ha/ptx3表达的最早时间。在lnc存在下，gfp-huvec中的细胞凋亡在聚集细胞中尤其明显。
[0375]
结果
[0376]
在不存在lnc的情况下，hc-ha/ptx3(而非ha或3d matrigel)诱导huvec细胞凋亡中的抗血管新生，但在存在lnc的情况下增加huvec细胞存活(数据未示出)。实施例15：hc-ha/ptx3(而非ha和3d matrigel)促进p10 lnc中静止血管生成微环境。
[0377]
因为出芽式血管新生的主要驱动因素是尖端和茎细胞中内皮细胞的排列，所以尚
不清楚通过可溶性hc-ha/ptx3单独表达上述血管新生祖细胞标志物(pdgfrβ、vegr2、igf-1和cd31)的p10 lnc是否促进3d matrigel上的血管新生出芽或需要添加血管内皮细胞。预期hc-ha/ptx3(而非ha或3d mg)将促进静止血管生成微环境。
[0378]
实验设计
[0379]
在有或没有可溶性hc-ha/ptx3或可溶性ha的情况下，将单一的5
×
105/ml p10 lnc、gfp-huvec或p10 lnc gfp-huvec(1:2)接种于含有补充10ng/ml vegf和2％fbs的内皮细胞生长培养基2(egm2)的8孔腔室中4h、4天、13天和30天。从两个侵入边缘测量d13上的出芽直径。记录测量值的平均值。
[0380]
通过在下隔室中加入补充10ng/ml vegf和2％fbs的内皮细胞生长培养基2(egm2)，同时向包被matrigel的上隔室中加入在相同培养基中的0.1ml的p10 lnc和gfp-huvec以及pbs(溶媒对照)、ha(25μg/ml)或hc-ha/ptx3(25μg/ml)，在24孔transwell板(8μm孔径，costar，kennebunk，me)中进行迁移测定。在37℃下孵育24h后，用棉签除去未迁移通过孔隙的细胞，而面向下隔室的滤器上的细胞用5％戊二醛固定，用1％结晶紫染色，并且从每个对照或处理组的六个随机显微镜视野计数。预期在3d matrigel上ha或未处理的细胞(而非hc-ha/ptx3)将促进细胞侵入。
[0381]
edu测定是brdu测定的替代方案。edu(5-乙炔基-2
’‑
脱氧尿苷)是胸苷的核苷类似物，并且在活性dna合成期间被掺入到dna中。1基于链接反应，2-5叠氮化物和炔烃之间的铜催化的共价反应进行检测。
[0382]
使用click-ittm edu成像试剂盒(invitrogen，carlsbad，ca)根据生产商的方案进行edu染色。将细胞离心涂片在载玻片上，用磷酸盐缓冲液(pbs)中的4％多聚甲醛固定15min。用pbs中的3％牛血清白蛋白(bsa)洗涤两次后，切片用pbs中的0.5％triton x-100透化20min。切片再次用pbs中的3％bsa洗涤两次，然后与含有click-ittm反应缓冲液、cuso4、alexa594azide和反应缓冲液添加剂的click-ittm反应混合物孵育30min，同时避光。切片再用pbs中的3％bsa洗涤一次。对于随后的dna染色，切片用pbs洗涤一次，然后与5μg/ml hoechst 33342孵育30min。然后用pbs洗涤载玻片两次，用vectashield封片剂(vector laboratories inc，burlingame，ca)封片。所有步骤均在室温下进行。预期在hc-ha/ptx3处理组(而非ha或未处理组)中在d10时出芽式lnc和gfp-huvec细胞中均发生细胞增殖
[0383]
结果
[0384]
在有或没有可溶性ha或可溶性hc-ha/ptx3的情况下，将p10lnc、gfp-huvec或p10 lnc gfp-huvec接种在egm培养基中3d mg上。相差显微镜显示代表细胞形态在4h、4天和13天时重聚聚集体。(图45a，标尺＝100rim)在d13时，从侵入边缘的两侧测量出芽生长的直径。与未处理的对照lnc相比，出芽生长直径的正态分布平均值在75％(深灰色柱)和50％(浅灰色柱)。(**p《0.01，n＝20)(图45b)与未处理的对照lnc相比，gfp-huvec直径出芽生长的正态分布平均值在75％(深灰色柱)和50％(浅灰色柱n＝20)。(**p《0.01，n＝20)(图45c)。实施例16：cd44icd和非典型tgfβri的激活协同促进通过hc-ha/ptx3和tgfβ1的hif1α信号传导
[0385]
hif-1α是细胞过程的主要调节剂，该细胞过程包括调节氧浓度、有氧糖酵解、细胞
迁移和炎症。测定hc-ha/ptx3和tgfβ1对hif1α信号传导的影响。
[0386]
简言之，在有或没有固定的ha、hc-ha/ptx3复合物的情况下，在dmem 10％fbs中，将p3人角膜成纤维细胞(hcf)接种在塑料上72h，然后在dmem itx中24h，、然后在收获用于hif1α的mrna定量之前用或不用tgfβ1处理24h。
[0387]
如图46所示，当还加入tgfβ1(10ng/ml)24小时时，hc-ha/ptx3使hif1αmrna上调3倍(从左数第三个柱)和5倍(从左数第四个柱)。**p《0.01和***p《0.001。n＝3。数据表明，当用hc-ha/ptx3和tgfβ1处理时，hcf中hif1αmrna协同增加。此外，数据表明，hif1α信号传导参与cd44icd信号传导和非典型tgfβri信号传导。
[0388]
虽然已经在本文中示出和描述了本公开的优选实施方案，但是对于本领域技术人员显而易见的是仅以示例的方式提供这些实施方案。在不背离本公开的情况下本领域技术人员将想到许多变型、改变和替代。应理解，本文描述的本公开的实施方案的要素的各种替代方案可以用于实施本公开。以下权利要求旨在限定本公开的范围，并且旨在由此覆盖处于这些权利要求的范围内的方法和结构以及它们的等同方案。
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
