用于减弱抗病毒转移载体免疫应答的方法和组合物与流程

用于减弱抗病毒转移载体免疫应答的方法和组合物
1.相关申请的交叉引用
2.本技术根据35 u.s.c.
§
119要求于2019年5月28日提交的美国临时申请no.62/853,647的权益，其全部公开内容通过引用并入于此。
技术领域
3.本发明涉及用于向对象施用具有包含免疫抑制剂的合成纳米载体和皮质类固醇的病毒转移载体的方法和相关组合物。优选地，所述方法和组合物实现了针对病毒转移载体的提高的转基因表达和/或减弱的免疫应答，并且更优选地，针对病毒转移载体的提高的转基因表达和/或减弱的免疫应答在病毒转移载体、包含免疫抑制剂的合成纳米载体和皮质类固醇的多次(例如两次、三次或更多次)施用内维持。


技术实现要素：

4.在一方面中，提供了这样的方法，所述方法包括通过将包含免疫抑制剂的合成纳米载体、病毒转移载体和未与纳米载体偶联的皮质类固醇伴随施用于对象，在对象中建立抗病毒转移载体减弱应答。
5.在本文提供的任一种方法的一个实施方案中，抗病毒转移载体减弱应答是针对病毒转移载体的igg和/或igm应答。
6.在另一方面中，提供了这样的方法，所述方法包括通过向对象重复伴随施用包含免疫抑制剂的合成纳米载体、病毒转移载体和未与纳米载体偶联的皮质类固醇在对象中升高病毒转移载体的转基因表达。
7.在本文提供的任一种方法的一个实施方案中，重复(例如，1、2、3、4、或5次)伴随施用包含免疫抑制剂的合成纳米载体、病毒转移载体和未与纳米载体偶联的皮质类固醇。
8.在所提供的任一种方法、组合物或药盒的一个实施方案中，病毒转移载体是本文提供的任一种病毒转移载体，例如任一项权利要求中限定的这样的载体中的任一种。
9.在所提供的任一种方法、组合物或药盒的一个实施方案中，合成纳米载体是本文提供的任一种合成纳米载体，例如任一项权利要求中限定的这样的合成纳米载体中的任一种。
10.在所提供的任一种方法、组合物或药盒的一个实施方案中，皮质类固醇选自：倍他米松(bethamethasone)、可的松(cortisone)、地塞米松(dexamethasone)、ethamethasoneb、氢化可的松(hydrocortisone)、泼尼松(prednisone)、甲泼尼龙(methylprednisolone)、泼尼松龙(predinisolone)和曲安西龙(triamcinolone)。
11.在所提供的任一种方法、组合物或药盒的一个实施方案中，皮质类固醇被全身施用或被配制用于全身递送。
12.在另一个方面中，提供了药盒，其包含本文中提供的任一种组合物或组合物的组合。在所提供的任一种药盒的一个实施方案中，药盒还包含使用说明书。在所提供的任一种药盒的一个实施方案中，使用说明书包含用于实施本文中提供的任一种方法的说明书。
13.在另一个方面中，提供了如任一个实施例中所述的方法或组合物。
14.在另一个方面中，任一种组合物用于所提供的任一种方法中。
15.在另一个方面中，任一种方法或组合物用于治疗本文中所述的任一种疾病或病症。在另一个方面中，任一种方法或组合物用于减弱抗病毒转移载体应答(例如，igg和/或igm应答)、建立减弱的抗病毒转移载体应答(例如，igg和/或igm应答)、升高转基因表达和/或用于重复施用病毒转移载体。
16.在另一个方面中，提供了施用实施例的试剂的任意组合的方法。在另一个方面中，还提供了包含任一种这些试剂组合的组合物或药盒。
17.在任一种方法、组合物或药盒的一个实施方案中，除另一种免疫应答(例如体液或细胞免疫应答)之外，所述方法、组合物或药盒还用于减弱igg和/或igm应答。
18.在任一种方法、组合物或药盒的一个实施方案中，除提高转基因表达之外，所述方法、组合物或药盒还用于减弱igg和/或igm应答。
19.在任一种方法、组合物或药盒的一个实施方案中，除另一种免疫应答(例如体液或细胞免疫应答)之外，所述方法、组合物或药盒还用于减弱igg和/或igm应答，以及提高转基因表达。
附图说明
20.图1a至1b示出了血清seap表达。具有相同aav、immtor
tm
和地塞米松(dex)注射计划和类似放血计划的两项类似研究示出于图1a和图1b中。指示了每个时间点的表达水平vs.未经处理小鼠中每个时间点的表达水平(作为100)(顶部行)，作为加强后(post-boost)与加强前(pre-boost)的比率(底部行)。
21.图2a至2b示出了血清seap表达。具有相同aav、immtor
tm
和地塞米松(dex)注射计划和类似放血计划的两项类似研究示出于图2a和图2b中。指示了每个时间点的表达水平vs.未经处理小鼠中每个时间点的表达水平(作为100)(顶部行)，作为加强后与加强前的比率(底部行)。加强由箭头表示，并且在图2a中在d20所有组中的相对seap表达由虚线指示。
22.图3示出了针对aav的igm应答的动力学。进行了具有相同的aav、immtor
tm
和地塞米松(dex)注射计划和类似放血计划的两项类似研究，并且他们的igm分析数据统一。加强用箭头表示。
23.图4示出了针对aav的igg应答的动力学。来自与图1b所示的相同研究的样品在elisa中分析了它们针对aav的igg水平。加强用箭头表示。示出了到第104天(在总数中)用单独的immtor
tm
或用immtor
tm
与地塞米松组合处理的组中igg阳性小鼠的数目。
24.图5a示出了最高od(d6、13、20、34、49、62、69、76、90、104、142、154、161、168、182、196和231)的aav igm。图5b示出了最高od(d231)的aav igm。
25.图6示出了aav-seap、aav-seap immtor、aav-seap immtor/dex和aav-seap/dex的抗avv igg最高od(450至570)。
具体实施方式
26.在详细描述本发明之前，应理解，本发明不限于特别示例的材料或工艺参数，因为其当然可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅用于描述本发明的一些特定实施方案的
目的，并且不旨在限制使用替代术语来描述本发明。
27.本文(无论是上文还是下文)中引用的所有出版物、专利和专利申请，均通过引用整体并入本文以用于所有目的。通过引用的此类并入并不旨在承认本文中引用的任何并入的出版物、专利和专利申请构成现有技术。
28.除非另有明确规定，否则本说明书和所附权利要求书中使用的没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。例如，提及“聚合物”包括两种或更多种这样的分子的混合物或不同分子量的单一聚合物种类的混合物，提及“合成纳米载体”包括两种或更多种这样的合成纳米载体的混合物或多种这样的合成纳米载体，提及“dna分子”包括两种或更多种这样的dna分子的混合物或多种这样的dna分子，提及“免疫抑制剂”包括两种或更多种这样的免疫抑制剂分子的混合物或多种这样的免疫抑制剂分子等。
29.本文中使用的术语“包括”或其变化形式如“包含”或“含有”应解读为表示包括任何所列举的整体(例如特征、要素、特性、属性、方法/过程步骤或限制)或整体(例如特征、要素、特性、属性、方法/过程步骤或限制)的组，但不排除任何其他的整体或整体的组。因此，本文中使用的术语“包括”是包括性的，并且不排除另外的未列举的整体或方法/过程步骤。
30.在本文中提供的任一种组合物和方法的实施方案中，“包含”可以用“基本上由...组成”或“由...组成”代替。短语“基本上由...组成”在本文中用于要求指定的整体或步骤以及不会实质性影响要求保护之发明的特征或功能的那些。本文中使用的术语“由...组成”用于表示只存在列举的整体(例如特征、要素、特性、属性、方法/过程步骤或限制)或整体(例如特征、要素、特性、属性、方法/过程步骤或限制)的组。
31.a.介绍
32.病毒转移载体是用于多种应用(例如基因处理、基因编辑、基因表达调节和外显子跳读)的有前途的治疗剂。因此，病毒转移载体可包含编码治疗性蛋白质或核酸的转基因。遗憾的是，由于针对病毒转移载体的免疫应答，这些处理剂的前景在很大程度上尚未得到完全实现。
33.然而，由于针对病毒转移载体的免疫应答(例如igg和igm抗体应答)，病毒载体在基因治疗和其他应用中的使用受到限制。此外，这样的免疫应答可导致病毒载体效力降低，例如如转基因表达降低所示。针对病毒载体的细胞和体液免疫应答二者都可以减弱效力和/或降低使用这样的治疗的能力。这些免疫应答包括抗体应答，并且可以对病毒载体的病毒抗原(例如病毒衣壳或包被蛋白、或其肽)具有特异性。
34.本发明人出乎意料地发现，伴随施用包含免疫抑制剂的合成纳米载体和皮质类固醇(例如未与纳米载体偶联的皮质类固醇)与病毒转移载体可以实现减弱的免疫应答(例如降低的igg和/或igm抗体应答)，和/或改善的在对象中的转基因表达(例如相对于仅施用病毒转移载体的对象)。重要的是，该作用在病毒转移载体、包含免疫抑制剂的合成纳米载体和皮质类固醇的多次(例如，2、3或更多次)施用内维持。
35.本文提供的方法和组合物为有效使用病毒转移载体进行处理提供了障碍的解决方案。特别地，已出乎意料地发现，可用本文中提供的方法和相关组合物减弱单独的或与其他免疫应答组合的抗病毒转移载体免疫应答。所述方法和组合物也可提高用病毒转移载体处理的效力并提供免疫减弱，并且特别是当重复施用(例如施用两次、三次或更多次)病毒转移载体、包含免疫抑制剂的合成纳米载体和皮质类固醇时。
36.现在将在下面更详细地描述本发明。
37.b.定义
[0038]“施用”或其变化形式意指以药理学有用的方式向对象提供或分配物质。该术语旨在包括“导致施用(causing to be administered)”。“导致施用”意指直接或间接地导致、督促、鼓励、协助、诱导或指导另一方施用所述物质。本文中提供的任一种方法可包括或还包括伴随施用病毒转移载体、包含免疫抑制剂的合成纳米载体以及皮质类固醇的步骤。在一些实施方案中，伴随施用重复进行。在另一些实施方案中，伴随施用是同时施用。
[0039]
在如本文中提供的用于施用于对象的组合物或剂型的情况下，“有效量”是指在该对象中产生一种或更多种期望结果(例如降低或消除针对病毒转移载体的免疫应答(例如igg或igm应答)或者产生抗病毒转移载体减弱应答)的组合物或剂型的量。有效量可用于体外或体内目的。对于体内目的，该量可以是临床医生会认为对于可能由于施用病毒转移载体而经历不期望免疫应答的对象可能具有临床益处的量。在本文中提供的任一种方法中，所施用的组合物可以为本文中提供的任一种有效量。
[0040]
有效量可涉及降低不期望的免疫应答的水平，尽管在一些实施方案中，其涉及完全阻止不期望的免疫应答。有效量还可以涉及延迟不期望的免疫应答的发生。有效量也可以是导致期望的治疗终点或期望的治疗结果的量。有效量优选地导致在对象中针对抗原(例如病毒转移载体抗原)的致耐受性免疫应答。有效量还可优选地导致转基因表达提高(转基因由病毒转移载体递送)。这可以通过在对象中测量多种目的组织或系统中的转基因表达来确定。这种提高的表达可以局部或全身地测量。有效量也可以是实现本文所述的一种或更多种结果的量。有效量也可以是导致有益于对象的治疗效力的任何期望结局的量。可以通过常规方法来监测前述任一项的实现。
[0041]
在所提供的任一种组合物和方法的一些实施方案中，有效量是其中期望的免疫应答(例如降低或消除针对病毒转移载体的免疫应答或产生抗病毒转移载体减弱应答)在对象中持续至少1周、至少2周或至少1个月的量。在所提供的任一种组合物和方法的一些实施方案中，有效量是其中期望的免疫应答在对象中持续组合物或剂型的至少2、至少3、至少4、至少5次施用的量。在所提供的任一种组合物和方法的另一些实施方案中，有效量是产生可测量的期望的免疫应答(例如降低或消除针对病毒转移载体的免疫应答或产生抗病毒转移载体减弱应答)的量。在一些实施方案中，有效量是在至少1周、至少2周或至少1个月内产生可测量的期望免疫应答(例如，针对特定病毒转移载体抗原)的量。在一些实施方案中，有效量是在组合物或剂型的至少2、至少3、至少4、至少5次施用产生可测量的期望免疫应答的量。
[0042]
当然，有效量将取决于所处理的特定对象；病症、疾病或障碍的严重程度；个体患者参数包括年龄、身体状况、身材大小和体重；处理的持续时间；并行治疗(如果有的话)的性质；具体施用途径以及在健康从业者的知识和专业之内的类似因素。这些因素是本领域普通技术人员公知的并且仅用常规实验就可解决。
[0043]“抗病毒转移载体免疫应答”或“针对病毒转移载体的免疫应答”等是指针对病毒转移载体的任何不期望的免疫应答。在一些实施方案中，不期望的免疫应答是针对病毒转移载体或其抗原的抗原特异性免疫应答。在一些实施方案中，免疫应答对病毒转移载体的病毒抗原具有特异性。免疫应答可以是抗病毒转移载体抗体应答，例如igg或igm应答。当抗
病毒转移载体免疫应答在对象中或者与在所述对象或另一对象中的预期或测量的应答相比以某种方式被降低或消除时，其被称为是“抗病毒转移载体减弱应答”。在一些实施方案中，对象中的抗病毒转移载体减弱应答包括：相比于在没有伴随施用包含免疫抑制剂的合成纳米载体和皮质类固醇的情况下将病毒转移载体施用于另一对象(例如受试对象)之后使用获自该另一对象的生物样品所测量的抗病毒转移载体免疫应答，在如本文中提供的伴随施用之后使用获自该对象的生物样品所测量的降低的抗病毒转移载体免疫应答(例如igg或igm抗体应答)。在一些实施方案中，抗病毒转移载体减弱应答是：相比于在没有伴随施用包含免疫抑制剂的合成纳米载体和皮质类固醇的情况下将病毒转移载体施用于另一对象(例如受试对象)之后对获自该另一对象的生物样品进行病毒转移载体体外攻击之后所检测的抗病毒转移载体免疫应答，在如本文中提供的伴随施用之后对该对象的生物样品进行随后的病毒转移载体体外攻击之后获自该对象的生物样品中的降低的抗病毒转移载体免疫应答(例如igg或igm抗体应答)。
[0044]“抗原”意指b细胞抗原或t细胞抗原。“抗原的类型”意指具有相同或基本上相同的抗原特征的分子。在一些实施方案中，抗原可以是蛋白质、多肽、肽、脂蛋白、糖脂、多核苷酸、多糖等。
[0045]“连接”或“连接的”或“偶联”或“偶联的”(等等)意指一个实体(例如部分)与另一实体化学地缔合。在一些实施方案中，该连接是共价的，意指在两个实体之间存在共价键的情况下发生连接。在一些非共价实施方案中，非共价连接由非共价相互作用介导，所述非共价相互作用包括但不限于电荷相互作用、亲和相互作用、金属配位、物理吸附、主客体相互作用(host-guest interaction)、疏水相互作用、tt堆积相互作用、氢键键合相互作用、范德华相互作用(van der waals interaction)、磁性相互作用、静电相互作用、偶极-偶极相互作用、和/或其组合。在一些实施方案中，包封是连接的一种形式。
[0046]
除非另有说明，否则本文中使用的“平均”是指算术平均值。
[0047]
本文中使用的“皮质类固醇”是指类固醇激素(例如在脊椎动物的肾上腺皮质中产生的)以及这些激素的合成类似物。皮质类固醇可以影响身体的所有组织并产生多种细胞效应。例如，这些类固醇可以调节碳水化合物、脂质、蛋白质生物合成和代谢，以及水和电解质的平衡。影响细胞生物合成或代谢的皮质类固醇称为糖皮质激素，而影响水和电解质平衡的皮质类固醇称为盐皮质激素。糖皮质激素和盐皮质激素均从肾上腺皮质释放。皮质类固醇是一类治疗剂，可用于例如治疗炎性病症，包括由感染、移植排斥和自身免疫病症造成的炎性病症。皮质类固醇的特征通常在于存在四个稠环的类固醇核，例如如在胆固醇、二羟基胆固醇、豆固醇和羊毛固醇结构中存在的。对皮质类固醇的任何提及都包括那些天然存在的、合成或半合成来源的。本文中使用的“皮质类固醇”包括对可从皮质类固醇形成的盐或其衍生物的提及。可能的盐或衍生物的实例包括：钠盐、磺基苯甲酸盐、磷酸盐、异烟酸盐、乙酸盐、丙酸盐、磷酸二氢盐、棕榈酸盐、新戊酸盐(pivaiate)、法呢酸盐(farnesylate)、乙酸-丙酸盐(aceponate)、磺庚酸盐(suleptanate)、泼尼卡松(prednicarbate)、糠酸盐或缩丙酮化合物(acetonide)。在某些情况下，皮质类固醇也可能以其水合物的形式存在。
[0048]“伴随地”意指以在时间上相关，优选地在时间上充分相关以在免疫应答中提供调节的方式向对象施用两种或更多种物质/试剂，并且甚至更优选地，组合施用所述两种或更
多种物质/试剂。在一些实施方案中，伴随施用可包括在指定时间段内，优选在1个月内，更优选在1周内，还更优选在1天内，并且甚至更优选在1小时内对两种或更多种物质/试剂的施用。在一些实施方案中，物质/试剂可重复地伴随施用；即，在多于一次时机下进行伴随施用。
[0049]“剂型”意指在适合于向对象施用的介质、载体、载剂或装置中的药理和/或免疫活性物质。本文中提供的任一种组合物或剂量可以是剂型。
[0050]“包封”意指将物质的至少一部分封装在合成纳米载体内。在一些实施方案中，物质完全封装在合成纳米载体内。在另一些实施方案中，被包封的物质中的大部分或全部不暴露于合成纳米载体外部的局部环境。在另一些实施方案中，物质的不超过50％、40％、30％、20％、10％或5％(重量/重量)暴露于局部环境。包封不同于吸收，吸收是将物质的大部分或全部置于合成纳米载体的表面上，并使物质暴露于合成纳米载体外部的局部环境。
[0051]“升高的转基因表达”是指提高对象中病毒转移载体的转基因表达产物的水平，该转基因由病毒转移载体递送。在一些实施方案中，转基因表达产物的水平可通过在对象中测量多种目的组织或系统中的转基因表达来确定。在一些实施方案中，转基因表达产物是蛋白质。在另一些实施方案中，转基因表达产物是核酸。升高的转基因表达可例如通过在获自对象的样品中测量转基因表达产物的量并将其与先前样品进行比较来确定。样品可以是组织样品。在一些实施方案中，转基因表达产物可使用流式细胞术来测量。
[0052]“外显子跳读转基因”意指编码反义寡核苷酸或可产生外显子跳读的其他试剂的任何核酸。“外显子跳读”是指在蛋白质产生期间在前mrna水平上被跳跃和去除的外显子。反义寡核苷酸可干扰外显子内的剪接位点或调控元件。尽管存在基因突变，但这仍可导致截短的、部分功能的蛋白质。通常，反义寡核苷酸可以是突变特异性的，并与前信使rna中的突变位点结合以诱导外显子跳读。
[0053]
对象可以是患有其中外显子跳读会有益的疾病或病症的对象。对象可患有本文中提供的其中产生外显子跳读会有益的任一种疾病或病症，例如营养不良。另外，外显子跳读转基因可编码在任何内源蛋白表达期间可产生外显子跳读的试剂，外显子跳读的结果将为其带来益处。这样的蛋白质的实例是与本文中提供的疾病或病症相关的蛋白质，例如本文中提供的任何营养不良。在一些实施方案中，蛋白质还可以是本文中提供的任一种治疗性蛋白质的内源性形式。
[0054]“基因编辑转基因”意指编码参与基因编辑过程的试剂或组分的任何核酸。“基因编辑”通常是指对基因组dna进行的持久或永久的修饰，例如靶向dna插入、置换、诱变或去除。基因编辑可靶向编码部分或全部表达蛋白质的dna序列，或者靶向影响靶基因表达的dna的非编码序列。基因编辑可包括递送编码目的dna序列的核酸，并使用内切核酸酶将目的序列插入基因组dna的靶位点。内切核酸酶可在基因组中的期望位置处在双链dna中产生断裂，并使用宿主细胞的机制使用同源重组、非同源末端连接等修复断裂。可用于基因编辑的内切核酸酶种类包括但不限于：大范围核酸酶、锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，talen)、成簇规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat，crispr)和归巢内切核酸酶。
[0055]
本文中提供的对象可以是患有本文中提供的任一种疾病或病症的对象，并且转基
因是编码可用于纠正本文中提供的任一种蛋白质或其内源性形式中的缺陷的基因编辑剂的转基因。作为替代地，在一些实施方案中，基因编辑病毒转移载体还可包括编码如本文中提供的治疗性蛋白质或其部分或核酸的转基因。在一些实施方案中，可将基因编辑病毒转移载体与具有编码本文中提供的治疗性蛋白质或其部分或核酸的转基因的病毒转移载体一起施用于对象。
[0056]“基因表达调节转基因”是指编码基因表达调节剂的任何核酸。“基因表达调节剂”是指可增强、抑制或调节一个或更多个内源基因的表达的分子。因此，基因表达调节剂包括dna结合蛋白质(例如，人工转录因子)以及介导rna干扰的分子。基因表达调节剂包括rnai分子(例如，dsrna或ssrna)、mirna和三链体形成寡核苷酸(triplex-forming oligonucleotide，tfo)。基因表达调节剂还可包括经修饰的rna，包括任何前述rna分子的经修饰形式。
[0057]
本文中提供的对象可以是患有本文中提供的任一种疾病或病症的对象，并且转基因是编码可用于控制本文中提供的任一种蛋白质的表达的基因表达调节剂的转基因。在一些实施方案中，对象患有疾病或病症，其中对象的内源性形式的蛋白质有缺陷或以有限量产生或完全不产生，并且基因表达调节剂可控制这样的蛋白质的表达。因此，在一些实施方案中，基因表达调节剂可控制如本文中提供的任一种蛋白质或其内源性形式(例如如本文中提供的治疗性蛋白质的内源性形式)的表达。
[0058]“基因治疗转基因”是指编码表达产物例如蛋白质或核酸并且当被引入到细胞中时可以指导蛋白质或核酸的表达的核酸。在一些实施方案中，该蛋白质可以是治疗性蛋白质。在本文中提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，通过病毒转移载体施用基因治疗转基因的对象患有疾病或病症，其中对象的内源性形式的蛋白质有缺陷或以有限量产生或完全不产生。在一些实施方案中，编码的蛋白质没有人对应物，但是被预测在疾病或病症的治疗中提供治疗上有益的作用。
[0059]“免疫抑制剂”意指引起致耐受性作用的化合物，优选地通过其对apc的作用。致耐受性作用通常是指由apc或其他免疫细胞全身和/或局部地进行的调节，其以持久的方式降低、抑制或防止针对抗原的不期望免疫应答。在一个实施方案中，免疫抑制剂是引起apc促进一种或更多种免疫效应细胞中的调节性表型的免疫抑制剂。例如，调节性表型的特征可以是：抑制抗原特异性cd4 t细胞或b细胞的产生、诱导、刺激或募集；抑制抗原特异性抗体的产生，treg细胞(例如，cd4 cd25高foxp3 treg细胞)的产生、诱导、刺激或募集等。这可以是cd4 t细胞或b细胞转化为调节性表型的结果。这也可以诱导是其他免疫细胞(例如cd8 t细胞、巨噬细胞和inkt细胞)中foxp3的结果。在一个实施方案中，免疫抑制剂是在apc加工抗原之后影响apc的应答的免疫抑制剂。在另一个实施方案中，免疫抑制剂不是干扰抗原加工的免疫抑制剂。在另一个实施方案中，免疫抑制剂不是凋亡信号传导分子。在另一个实施方案中，免疫抑制剂不是磷脂。
[0060]
在一些实施方案中，免疫抑制剂是除组成合成纳米载体的结构的物质之外的要素。例如，在一个实施方案中，当合成纳米载体由一种或更多种聚合物组成时，免疫抑制剂是作为补充的且在一些实施方案中与一种或更多种聚合物连接的化合物。作为另一个实例，在一个实施方案中，当合成纳米载体由一种或更多种脂质组成时，免疫抑制剂又是一种或更多种脂质的补充，并且在一些实施方案中，与一种或更多种脂质连接。在另一些实施方
案中，当合成纳米载体的物质也引起致耐受性作用时，免疫抑制剂是除引起致耐受性作用的合成纳米载体的物质之外所存在的要素。
[0061]
免疫抑制剂包括但不限于：他汀类；mtor抑制剂，例如雷帕霉素(rapamycin)或雷帕霉素类似物(即rapalog)；tgf-β信号传导剂；tgf-β受体激动剂；组蛋白脱乙酰酶抑制剂，例如曲古抑菌素a(trichostatina)；线粒体功能抑制剂，例如鱼藤酮(rotenone)；p38抑制剂；nf-κβ抑制剂，例如6bio、tcpa-1、ikk vii；腺苷受体激动剂；前列腺素e2激动剂(pge2)，例如米索前列醇(misoprostol)；磷酸二酯酶抑制剂，例如磷酸二酯酶4抑制剂(pde4)，例如咯利普兰(rolipram)；蛋白酶体抑制剂；激酶抑制剂；g蛋白偶联受体激动剂；g蛋白偶联受体拮抗剂；类视黄醇；细胞因子抑制剂；细胞因子受体抑制剂；细胞因子受体激活剂；过氧化物酶体增殖物激活受体拮抗剂；过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂；组蛋白脱乙酰酶抑制剂；钙调磷酸酶抑制剂；磷酸酶抑制剂；pi3kb抑制剂，例如tgx-221；自噬抑制剂，例如3-甲基腺嘌呤；芳烃受体抑制剂；蛋白酶体抑制剂i(psi)；和氧化的atp，例如p2x受体阻断剂。免疫抑制剂还包括：ido、维生素d3、视黄酸、环孢素例如环孢素a、芳烃受体抑制剂、白藜芦醇(resveratrol)、硫唑嘌呤(aza)、6-巯基嘌呤(6-mp)、6-硫鸟嘌呤(6-tg)、fk506、萨菲菌素a、沙美特罗、霉酚酸酯(mmf)、阿司匹林和其他cox抑制剂、尼氟酸、雌三醇和雷公藤内酯。另一些示例性免疫抑制剂包括但不限于：小分子药物、天然产物、抗体(例如抗cd20、cd3、cd4的抗体)、基于生物制剂的药物、基于碳水化合物的药物、rnai、反义核酸、适配体、甲氨蝶呤、nsaid；芬戈莫德(fingolimod)；那他珠单抗(natalizumab)；阿仑单抗(alemtuzumab)；抗cd3；他克莫司(fk506)、阿巴西普(abatacept)、贝拉西普(belatacept)等。“雷帕霉素类似物(rapalog)”是指在结构上与雷帕霉素(的类似物)(西罗莫司)相关的分子。雷帕霉素类似物的实例包括但不限于：坦罗莫司(cci-779)、依维莫司(rad001)、地磷莫司(ap-23573)和佐他莫司(abt-578)。雷帕霉素类似物的一些另外的实例可见于例如wo公开wo 1998/002441和美国专利no.8,455,510，其雷帕霉素类似物通过引用整体并入本文。
[0062]
另外的免疫抑制剂是本领域技术人员已知的，并且本发明不限于此方面。在一些实施方案中，免疫抑制剂可包含如本文中提供的任一种试剂。
[0063]
当与合成纳米载体偶联时，“负载”是基于整个合成纳米载体中物质的总干配方重量与合成纳米载体偶联的免疫抑制剂的量(重量/重量)。通常，这样的负载计算为合成纳米载体群体的平均值。在一个实施方案中，合成纳米载体的平均负载为0.1％至50％。在另一个实施方案中，负载为0.1％至20％。在另一个实施方案中，负载为0.1％至10％。在另一个实施方案中，负载为1％至10％。在另一个实施方案中，负载为7％至20％。在另一个实施方案中，合成纳米载体群体的平均负载为至少0.1％、至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％、至少0.5％、至少0.6％、至少0.7％、至少0.8％、至少0.9％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％或至少25％。在另一个实施方案中，合成纳米载体群体的平均负载为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在任一个以上实施方案中的一个实施方案中，合成纳米载体群体的平均负载不超过25％、30％、35％或40％。在一些实施方案
中，使用本领域已知的任何方法来计算负载。合成纳米载体中包含的免疫抑制剂的负载可以是本文中提供的任一种负载。
[0064]“合成纳米载体的最大尺寸”意指沿合成纳米载体的任何轴测量的纳米载体的最大尺寸。“合成纳米载体的最小尺寸”意指沿合成纳米载体的任何轴测量的合成纳米载体的最小尺寸。例如，对于球形合成纳米载体，合成纳米载体的最大尺寸和最小尺寸将基本上相同，并且将是其直径的尺寸。类似地，对于立方形合成纳米载体，合成纳米载体的最小尺寸将是其高度、宽度或长度中的最小者，而合成纳米载体的最大尺寸将是其高度、宽度或长度中的最大者。在一个实施方案中，基于样品中合成纳米载体的总数，该样品中合成纳米载体中的至少75％、优选至少80％、更优选至少90％的最小尺寸等于或大于100nm。在一个实施方案中，基于样品中合成纳米载体的总数，该样品中合成纳米载体中的至少75％、优选至少80％、更优选至少90％的最大尺寸等于或小于5μm。优选地，基于样品中合成纳米载体的总数，该样品中合成纳米载体中的至少75％、优选至少80％、更优选至少90％的最小尺寸大于110nm、更优选大于120nm、更优选大于130nm并且更优选还大于150nm。合成纳米载体的最大尺寸与最小尺寸的纵横比可根据实施方案而变化。例如，合成纳米载体的最大尺寸与最小尺寸的纵横比可以是1∶1至1,000,000∶1、优选1∶1至100,000∶1、更优选1∶1至10,000∶1、更优选1∶1至1000∶1、还更优选1∶1至100∶1并且还更优选1∶1至10∶1不等。优选地，基于样品中合成纳米载体的总数，该样品中合成纳米载体中的至少75％、优选至少80％、更优选至少90％的最大尺寸等于或小于3μm、更优选等于或小于2μm、更优选等于或小于1μm、更优选等于或小于800nm、更优选等于或小于600nm并且更优选还等于或小于500nm。在一些优选的实施方案中，基于样品中合成纳米载体的总数，该样品中合成纳米载体中的至少75％、优选至少80％、更优选至少90％的最小尺寸等于或大于100nm、更优选等于或大于120nm、更优选等于或大于130nm、更优选等于或大于140nm，并且更优选还等于或大于150nm。在一些实施方案中，可通过将合成纳米载体悬浮在液体(通常为水性)介质中并使用动态光散射(dynamic light scattering，dls)(例如，使用brookhaven zetapals仪器)来获得合成纳米载体尺寸(例如，有效直径)的测量。例如，可将合成纳米载体的悬浮液从水性缓冲液稀释到纯水中，以实现约0.01至0.1mg/ml的最终合成纳米载体悬浮液浓度。经稀释的悬浮液可直接在合适的吸收池内制备或转移到合适的吸收池中用于dls分析。然后，可以将吸收池放置在dls中，使其平衡至受控温度，并随后基于介质黏度和样品折射率的合适输入扫描足够的时间以获得稳定且可再现的分布。然后，报告有效直径或分布的平均值。确定高纵横比或非球形合成纳米载体的有效尺寸可能需要放大技术(例如电子显微术)以获得更准确的测量。合成纳米载体的“尺寸”或“大小”或“直径”意指例如使用动态光散射获得的颗粒尺寸分布的平均值。
[0065]“非甲氧基封端的聚合物”意指至少一个末端以除甲氧基之外的部分结尾的聚合物。在一些实施方案中，聚合物的至少两个末端以除甲氧基之外的部分结尾。在另一些实施方案中，聚合物不具有以甲氧基结尾的末端。“非甲氧基封端的普朗尼克聚合物”意指除在两个末端均具有甲氧基的线性普朗尼克聚合物之外的聚合物。在一些实施方案中，如本文中提供的聚合物纳米粒可包含非甲氧基封端的聚合物或非甲氧基封端的普朗尼克聚合物。在另一些实施方案中，聚合物纳米粒不包含这样的聚合物。
[0066]“可药用赋形剂”或“可药用载体”意指与药理学活性物质一起使用以配制组合物的药理学惰性物质。可药用赋形剂包括本领域中已知的多种物质，包括但不限于糖类(例如
葡萄糖、乳糖等)、防腐剂(例如抗微生物剂)、重构助剂、着色剂、盐水(例如磷酸盐缓冲盐水)和缓冲剂。
[0067]“方案”意指对对象进行的施用方式并且包括对对象进行的一种或更多种物质的任何给药方案。方案由要素(或变量)组成；因此，方案包含一个或更多个要素。方案的这样的要素可包含给药量(剂量)、给药频率、施用途径、给药持续时间、给药速率、给药之间的间隔、任意前述的组合等。在一些实施方案中，方案可用于将一种或更多种本发明组合物施用于一个或更多个受试对象。然后可以评估这些受试对象中的免疫应答以确定该方案在产生期望或期望水平的免疫应答或治疗作用方面是否有效。可以评估任何治疗和/或免疫作用。方案的一个或更多个要素可能先前已在受试对象(例如非人对象)中得到证明，并随后转换成人类方案。例如，在非人对象中证明的给药量可以使用已建立的技术(例如等量缩放(alimetric scaling)或其他缩放方法)缩放为人类方案的要素。可以使用本文中提供的或本领域已知的任何方法来确定方案是否具有期望的作用。例如，可以从已根据特定方案施用了本文中提供的组合物的对象获得样品以确定特异性免疫细胞、细胞因子、抗体等是否降低、产生、活化等。示例性的方案是先前已证明导致针对病毒转移载体抗原的耐受性免疫应答或实现本文中所述的任一种有益结果的方案。可用于检测免疫细胞的存在和/或数目的方法包括但不限于流式细胞术方法(例如，facs)、elispot、增殖反应、细胞因子产生和免疫组织化学方法。用于免疫细胞标志物的特异性染色的抗体和其他结合试剂是可商购的。这样的试剂盒通常包括用于抗原的染色试剂，其允许基于facs的检测、分离和/或定量来自异质细胞群的期望细胞群。在一些实施方案中，如果预期所选择的一种或多种要素在对象中实现期望的结果，则使用一种或更多种或所有或基本上所有构成方案的要素将本文中提供的组合物施用于对象。这样的期望可以基于在受试对象中确定的方案并且按比例缩放，如果需要的话。本文中提供的任一种方法可包括或还包括以下步骤：根据已显示减弱抗病毒转移载体免疫应答和/或允许重复施用病毒转移载体和/或导致针对病毒转移载体的一种或更多种其他免疫应答的减弱和/或导致转基因表达提高的方案，将一定剂量的病毒转移载体与本文中所述的包含免疫抑制剂的合成纳米载体以及皮质类固醇组合施用。本文中提供的任一种方法可包括或还包括确定实现本文中所述的任一种或更多种有益结果的这样的方案。本文中提供的任一种方法可包括或还包括根据实现本文中所述的任一种或更多种有益结果的方案进行施用的步骤。
[0068]“重复剂量”或“重复给药”等意指在相同物质的较早剂量或给药之后向对象施用的至少一个另外的剂量或给药。例如，病毒转移载体的重复剂量是在相同物质的先前剂量之后病毒转移载体的至少一个另外的剂量。虽然物质可以相同，但是重复剂量中物质的量可能与早前剂量不同。可以如本文中提供的那样，例如以实施例的间隔来施用重复剂量。如果重复给药对对象产生有益作用，则认为重复给药是有效的。优选地，有效的重复给药与减弱的抗病毒转移载体应答相结合产生有益作用，例如治疗作用。
[0069]“同时”意指在同一时间或基本上在同一时间施用，其中临床医生将考虑施用之间对期望的治疗结果的影响几乎为零或可忽略不计的任何时间。在一些实施方案中，同时意味着施用以5、4、3、2、1或更少的分钟进行。
[0070]“对象”意指动物，包括温血哺乳动物，例如人和灵长类；禽类；驯养的家养或农场动物，例如猫、狗、绵羊、山羊、牛、马和猪；实验动物，例如小鼠、大鼠和豚鼠；鱼；爬行动物；
动物园动物和野生动物；等。本文中使用的对象可以是需要本文中提供的任一种方法或组合物的对象。
[0071]“合成纳米载体”意指在自然界中未发现并且至少一个维度的尺寸小于或等于5微米的离散物体。一般来说包含白蛋白纳米粒作为合成纳米载体，然而在某些实施方案中，合成纳米载体不包含白蛋白纳米粒。在一些实施方案中，合成纳米载体不包含壳聚糖。在另一些实施方案中，合成纳米载体不是基于脂质的纳米粒。在另一些实施方案中，合成纳米载体不包含磷脂。
[0072]
合成纳米载体可以是但不限于以下一种或多种：基于脂质的纳米粒(在本文中也称为脂质纳米粒，即构成其结构的大部分物质是脂质的纳米粒)、聚合物纳米粒、金属纳米粒、基于表面活性剂的乳剂、树枝状聚合物、巴基球、纳米线、病毒样颗粒(即主要由病毒结构蛋白构成但不具有感染性或感染性低的颗粒)、基于肽或蛋白质的颗粒(在本文中也称为蛋白质颗粒，即构成其结构的大部分物质是肽或蛋白质的颗粒)(例如白蛋白纳米粒)和/或使用纳米材料的组合产生的纳米粒(例如脂质-聚合物纳米粒)。合成纳米载体可以是多种不同的形状，包括但不限于球形、立方形、棱锥形、长方形、圆柱形、环形等。根据本发明的合成纳米载体包含一个或更多个表面。可适用于本发明实践的示例性合成纳米载体包括：(1)gref等的美国专利5,543,158中公开的生物可降解纳米粒，(2)saltzman等的公开的美国专利申请20060002852的聚合物纳米粒，(3)desimone等的公开的美国专利申请20090028910的光刻法构建的纳米粒，(4)von andrian等的wo 2009/051837的公开内容，(5)penades等的公开的美国专利申请2008/0145441中公开的纳米粒，(6)de los rios等的公开的美国专利申请20090226525中公开的蛋白质纳米粒，(7)sebbel等的公开的美国专利申请20060222652中公开的病毒样颗粒，(8)bachmann等的公开的美国专利申请20060251677中公开的核酸连接的病毒样颗粒，(9)wo2010047839a1或wo2009106999a2中公开的病毒样颗粒，(10)p.paolicelli等，“surface-modified plga-based nanoparticles that can efficiently associate and deliver virus-like particles”nanomedicine.5(6)：843-853(2010)中公开的纳米沉淀纳米粒，(11)美国公开2002/0086049中公开的凋亡细胞、凋亡小体或者合成或半合成模拟物，或(12)look等，nanogel-based delivery of mycophenolic acid ameliorates systemic lupus erythematosus in mice”j.clinical investigation 123(4)：1741-1749(2013)的那些。
[0073]
最小尺寸等于或小于约100nm、优选等于或小于100nm的根据本发明的合成纳米载体不包含具有激活补体之羟基的表面，或者作为替代包含基本上由不是激活补体之羟基的部分组成的表面。在一个优选的实施方案中，最小尺寸等于或小于约100nm、优选等于或小于100nm的根据本发明的合成纳米载体不包含显著激活补体的表面，或者作为替代包含基本上由不会显著激活补体的部分组成的表面。在一个更优选的实施方案中，最小尺寸等于或小于约100nm、优选等于或小于100nm的根据本发明的合成纳米载体不包含激活补体的表面，或者作为替代包含基本上由不会激活补体的部分组成的表面。在一些实施方案中，合成纳米载体排除病毒样颗粒。在一些实施方案中，合成纳米载体的纵横比可大于或等于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7或大于或等于1∶10。
[0074]“治疗性蛋白质”意指可由如本文中提供的基因治疗转基因表达的任何蛋白质。治疗性蛋白质可以是用于蛋白质替代或蛋白质补充的蛋白质。治疗性蛋白质包括但不限于
酶、酶辅因子、激素、凝血因子、细胞因子、生长因子等。其他治疗性蛋白质的实例在本文中其他地方提供。对象可以是需要用本文中提供的任一种治疗性蛋白质进行处理的对象。
[0075]“病毒转移载体的转基因”是指使用病毒转移载体转运到细胞中的核酸物质，并且一旦在细胞中，其可被表达以产生蛋白质或核酸分子，例如用于如本文中所述的治疗应用。转基因可以是基因治疗转基因、基因编辑转基因、调节基因表达的转基因或外显子跳读转基因。“表达的”或“表达”等是指在将转基因转导入细胞并由转导细胞加工之后，合成功能性(即，对于期望目的具有生理活性)基因产物。这样的基因产物在本文中也称为“转基因表达产物”。因此，表达的产物包括由转基因编码的所得蛋白质或核酸，例如反义寡核苷酸或治疗性rna。
[0076]“病毒转移载体”意指已适于递送如本文中提供的核酸(例如转基因)的病毒载体并且包括这样的核酸。“病毒载体”是指病毒转移载体的所有病毒组分。因此，“病毒抗原”是指以下的抗原：病毒转移载体的病毒组分(例如衣壳蛋白或外壳蛋白)，而不是指其递送的核酸(例如转基因)或其编码的任何产物。“病毒转移载体抗原”是指以下的任何抗原：病毒转移载体，包括其病毒组分以及递送的核酸(例如转基因)或其任何表达产物。转基因可以是基因治疗转基因、基因编辑转基因、调节基因表达的转基因或外显子跳读转基因。在一些实施方案中，转基因是编码本文中提供的蛋白质(例如治疗性蛋白质、dna结合蛋白质或内切核酸酶)的转基因。在另一些实施方案中，转基因是编码指导rna、反义核酸、snrna、rnai分子(例如，dsrna或ssrna)、mirna或三链体形成寡核苷酸(tfo)等的转基因。病毒载体可以基于但不限于：逆转录病毒(例如，鼠逆转录病毒、禽逆转录病毒、莫洛尼鼠白血病病毒(momulv)、哈维鼠肉瘤病毒(hamusv)、鼠乳腺肿瘤病毒(mumtv)、长臂猿白血病病毒(galv)和劳斯肉瘤病毒(rous sarcoma virus，rsv))、慢病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒、甲病毒等。其他实例在本文中其他地方提供或是本领域中已知的。病毒载体可基于病毒的天然变体、毒株或血清型，例如本文中所提供的那些的任一种。病毒载体也可基于通过分子进化选择的病毒。病毒载体还可以是经改造载体、重组载体、突变体载体或杂交体载体。在一些实施方案中，病毒载体是“嵌合病毒载体”。在这样的一些实施方案中，这意味着病毒载体由源自多于一种病毒或病毒载体的病毒组分构成。
[0077]
c.用于本发明方法的组合物
[0078]
重要的是，已发现本文中提供的方法和组合物减弱了针对病毒转移载体的免疫应答，例如igg或igm应答。另外，已发现本文中提供的方法和组合物改善转基因表达。重要的是，这样的作用在要求保护的组合物的重复(例如两次、三次或更多次)施用中维持。本文中提供的方法和组合物可用于用病毒转移载体处理对象。病毒转移载体可用于递送核酸(例如转基因)用于多种目的，包括用于基因治疗、基因编辑、基因表达调节和外显子跳读，本文中提供的方法和组合物也是适用的。
[0079]
转基因
[0080]
本文中提供的病毒转移载体的转基因可以是基因治疗转基因，并且可编码对对象(例如患有疾病或病症的对象)有益的任何蛋白质或其部分。所述蛋白质可以是胞外、胞内或膜结合蛋白质。所述蛋白质可以是治疗性蛋白质，并且通过病毒转移载体施用基因治疗转基因的对象可能患有疾病或病症，其中对象的内源性形式的蛋白质有缺陷或以有限量产生或完全不产生。因此，对象可以是患有如本文中提供的任一种疾病或病症的对象，并且转
基因可以是编码如本文中提供的任一种治疗性蛋白质或其部分的转基因。
[0081]
治疗性蛋白质的实例包括但不限于：可输注或可注射的治疗性蛋白质、酶、酶辅因子、激素、血液或凝血因子、细胞因子和干扰素、生长因子、脂肪因子等。
[0082]
可输注或可注射的治疗性蛋白质的实例包括：例如，托珠单抗(roche/)、α-1抗胰蛋白酶(kamada/aat)、(affymax和takeda，合成肽)、白蛋白干扰素α-2b(novartis/zalbin
tm
)、(pharming group，c1抑制剂替代治疗)、替莫瑞林(tesamorelin)(theratechnologies/egrifta，合成生长激素释放因子)、奥美珠单抗(ocrelizumab)(genentech，roche和biogen)、belimumab(glaxosmithkline/)、培戈洛酶(pegloticase)(savient pharmaceuticals/krystexxa
tm
)、他利苷酶α(taligluceraseα)(protalix/uplyso)、阿加糖酶α(shire/)和维拉苷酶α(shire)。
[0083]
酶的实例包括溶菌酶、氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、天冬酰胺酶、尿酸酶、糖苷酶、蛋白酶、核酸酶、胶原酶、透明质酸酶、肝素酶、类肝素酶、激酶、磷酸酶、溶素和连接酶。酶的另一些实例包括用于酶替代治疗的那些，包括但不限于：伊米苷酶(imiglucerase)(例如，cerezyme
tm
)、α-半乳糖苷酶a(α-gal a)(例如，阿加糖酶β，fabryzyme
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)、酸性α-葡糖苷酶(gaa)(例如，葡糖苷酶α，lumizyme
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，myozyme
tm
)和芳基硫酸酯酶b(例如，拉罗尼酶(laronidase)，aldurazyme
tm
，艾杜硫酶(idursulfase)，elaprase
tm
，芳基硫酸酯酶b(arylsulfatase b)，naglazyme
tm
)。
[0084]
激素的实例包括但不限于促性腺激素、促甲状腺激素、黑皮质素、垂体激素、加压素、催产素、生长激素、催乳素、食欲肽、利尿钠激素、甲状旁腺激素、降钙素、红细胞生成素和胰激素。
[0085]
血液或凝血因子的实例包括：因子i(纤维蛋白原)、因子ii(凝血酶原)、组织因子、因子v(前加速素，不稳定因子)、因子vii(稳定因子，前转化素)、因子viii(抗血友病球蛋白)、因子ix(克雷司马斯因子或血浆促凝血酶原激酶组分)、因子x(stuart-prower因子)、因子xa、因子xi、因子xii(hageman因子)、因子xiii(纤维蛋白稳定因子)、von willebrand因子、von heldebrant因子、前激肽释放因子(fletcher因子)、高分子量激肽原(hmwk)(fitzgerald因子)、纤连蛋白、纤维蛋白、凝血酶、抗凝血酶(例如抗凝血酶iii)、肝素辅因子ii、蛋白c、蛋白s、蛋白z、蛋白z相关蛋白酶抑制剂(protein z-related protease inhibitot，zpi)、纤溶酶原、α2-纤溶酶抑制剂、组织纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator，tpa)、尿激酶、纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1，pai1)、纤溶酶原激活物抑制剂-2(plasminogen activator inhibitor-2，pai2)、癌症促凝剂和依伯汀α(epogen，procrit)。
[0086]
细胞因子的实例包括淋巴因子、白介素和趋化因子、1型细胞因子(例如ifn-γ、tgf-β)和2型细胞因子(例如il-4、il-10和il-13)。
[0087]
生长因子的实例包括：肾上腺髓质素(adrenomedullin，am)、血管生成素(angiopoietin，ang)、自分泌运动因子、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，bmp)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，bdnf)、表皮生长因子(epidermal growth factor，egf)、红细胞生成素(erythropoietin，epo)、成纤维细胞生长
因子(fibroblast growth factor，fgf)、胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，gdnf)、粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，g-csf)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor，gm-csf)、生长分化因子-9(growth differentiation factor-9，gdf9)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，hgf)、肝癌源性生长因子(hepatoma-derived growth factor，hdgf)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，igf)、迁移刺激因子、肌生成抑制蛋白(gdf-8)、神经生长因子(nerve growth factor，ngf)以及其他神经营养因子、血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，pdgf)、血小板生成素(thrombopoietin，tpo)、转化生长因子α(transforming growth factor alpha，tgf-α)、转化生长因子β(transforming growth factor beta，tgf-β)、肿瘤坏死因子-α(tumour necrosis factor-alpha，tnf-α)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，vegf)、wnt信号传导途径、胎盘生长因子(placental growth factor，plgf)、[(胎牛促生长素)](foetal bovine somatotrophin，fbs)、il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6和il-7。
[0088]
脂肪因子的实例包括瘦素和脂连蛋白。
[0089]
治疗性蛋白质的另外的实例包括但不限于：受体、信号传导蛋白、细胞骨架蛋白、支架蛋白、转录因子、结构蛋白、膜蛋白、胞质蛋白、结合蛋白、核蛋白、分泌蛋白、高尔基蛋白、内质网蛋白、线粒体蛋白和囊泡蛋白等。
[0090]
本文中提供的基因治疗病毒转移载体的转基因可编码任何蛋白质的功能形式，其通过对象中该蛋白质的内源性形式的某些缺陷(包括内源性形式的表达缺陷)在对象中导致疾病或病症。这样的疾病或病症的实例包括但不限于：溶酶体贮积病/症，例如santavuori-haltia病(婴儿神经元蜡样质脂褐质沉积症1型(infantile neuronal ceroid lipofuscinosis type 1))、詹-比二氏病(jansky-bielschowsky disease)(晚期婴儿神经元蜡样质脂褐质沉积症2型)、巴藤病(batten disease)(青少年神经元蜡样质脂褐质沉积症3型)、库夫斯病(kufs disease)(神经元蜡样质脂褐质沉积症4型)、方基盖氏病(von gierke disease)(糖原贮积症ia型)、糖原贮积症ib型、庞贝病(pompe disease)(糖原贮积症ii型)、福布斯或科里病(forbes or cori disease)(糖原贮积症iii型)、黏脂贮积症ii(i-细胞病)、黏脂贮积症iii(假性hurler多种营养不良(pseudo-hurler polydystrophy))、黏脂贮积症iv(唾液脂血症(sialolipidosis))、胱氨酸病(成人非肾病型)、胱氨酸病(婴儿肾病型)、胱氨酸病(青少年或青春期肾病)、萨拉病(salla disease)/婴儿唾液酸贮积症和saposin缺乏症；脂质和鞘脂降解病症，例如gm1神经节苷脂贮积症(婴儿、晚期婴儿/青少年和成人/慢性)，泰-萨克斯病(tay-sachs disease)，山德霍夫氏病(sandhoff disease)，gm2神经节苷脂贮积症，ab变异型，法布里病(fabry disease)，戈谢病i、ii和iii型(gaucher disease，types i，ii and iii)，异染性脑白质营养不良(metachromatic leukidystrophy)，克拉伯病(krabbe disease)(早期和晚期发病)，尼曼-皮克病a、b、c1和c2型(neimann-pick disease，types a，b，c1，and c2)，farber病和沃尔曼病(wolman disease)(胆固醇酯贮积病(cholesteryl esther storage disease))；黏多糖降解病症，例如hurler综合征(mpsi)、scheie综合征(mps is)、hurler-scheie综合征(mps ih/s)、亨特综合征(hunter syndrome)(mps ii)、sanfillippo a综合征(mps iiia)、
sanfillippo b综合征(mps iiib)、sanfillippo c综合征(mps iiic)、sanfillippo d综合征(mps iiid)、morquio a综合征(mps iva)、morquio b综合征(mps ivb)、maroteaux-lamy综合征(mps vi)和斯赖综合征(sly syndrome)(mps vii)；糖蛋白降解病症，例如α甘露糖苷贮积症、β甘露糖苷贮积症、岩藻糖苷贮积症、天冬氨酰基葡糖胺尿症(asparylglucosaminuria)、黏脂贮积症i(唾液酸贮积症)、半乳糖唾液酸贮积症、辛德勒病(schindler disease)和辛德勒病ii型/kanzaki病；以及脑白质营养不良疾病/病症，例如无β脂蛋白血症、新生儿肾上腺脑白质营养不良(neonatal adrenoleukodystrophy)、卡纳万病(canavan disease)、脑腱黄瘤病(cerebrotendinous xanthromatosis)、佩利措伊斯-梅茨巴赫病(pelizaeus merzbacher disease)、丹吉尔病(tangier disease)、婴儿refum病(refum disease，infantile)和经典refum病(refum disease，classic)。
[0091]
如本文中提供的对象的这样的疾病/病症的另外的实例包括但不限于：酸性麦芽糖酶缺乏症(例如，庞贝病、糖原贮积病2型、溶酶体贮积病)；肉碱缺乏症；肉碱棕榈酰基转移酶缺乏症；脱支酶缺乏症(例如，科里或福布斯病(cori or forbes disease)，糖原贮积病3型)；乳酸脱氢酶缺乏症(例如，糖原贮积病11型)；肌腺苷酸脱氨酶缺乏症；磷酸果糖激酶缺乏症(例如，tarui病，糖原贮积病7型)；磷酸甘油酸激酶缺乏症(例如，糖原贮积病9型)；磷酸甘油酸变位酶缺乏症(例如，糖原贮积病10型)；磷酸化酶缺乏症(例如，麦卡德尔病(mcardle disease)、肌磷酸化酶缺乏症、糖原贮积病5型)；戈谢病(gaucher’s disease)(例如，1号染色体，酶葡糖脑苷脂酶受影响)；软骨发育不全(例如，4号染色体，成纤维细胞生长因子受体3受影响)；亨廷顿病(huntington’s disease)(例如，4号染色体，亨廷顿蛋白)；血色素沉着症(例如，6号染色体，hfe蛋白)；囊性纤维化(例如，7号染色体，cftr)；弗里德赖希共济失调(friedreich’s ataxia)(染色体9，共济蛋白)；贝斯特病(best disease)(11号染色体，vmd2)；镰状细胞病(11号染色体，血红蛋白)；苯丙酮尿症(染色体12，苯丙氨酸羟化酶)；马凡综合征(marfan’s syndrome)(15号染色体，原纤蛋白)；强直性肌营养不良(myotonic dystophy)(19号染色体，肌营养不良性肌强直蛋白激酶(dystophia myotonica protein kinase))；肾上腺脑白质营养不良(x染色体，过氧化物酶体中的木质素酰辅酶a连接酶)；迪谢内肌营养不良(duchene’s muscular dystrophy)(x染色体，肌养蛋白)；雷特综合征(rett syndrome)(x染色体，甲基cpg结合蛋白2)；莱伯遗传性视神经病变(leber’s hereditary optic neuropathy)(线粒体，呼吸蛋白质)；线粒体脑病、乳酸性酸中毒和中风(mitochondria encephalopathy，lactic acidosis and stroke，melas)(线粒体，转移rna)；以及尿素循环的酶缺乏。
[0092]
这样的疾病或病症的另外的实例包括但不限于：镰状细胞性贫血、肌管性肌病(myotubular myopathy)、血友病b、脂蛋白脂酶缺乏、鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症(ornithine transcarbamylase defciency)、克里格勒-纳贾尔综合征(crigler-najjar syndrome)、黏脂贮积症iv、尼曼-皮克a(niemann-pick a)、sanfilippo a、sanfilippo b、sanfilippo c、sanfilippo d、b-地中海贫血和迪谢内肌营养不良。疾病或病症的另一些实例包括为以下中缺陷的结果的那些：脂质和鞘脂降解、黏多糖降解、糖蛋白降解、脑白质营养不良等。
[0093]
本文中提供的任一种疾病或病症的缺陷蛋白的功能形式都可由基因治疗病毒转移载体的转基因编码并且也被认为是治疗性蛋白质。因此，治疗性蛋白质还包括：肌磷酸化酶、葡糖脑苷脂酶、成纤维细胞生长因子受体3、亨廷顿蛋白、hfe蛋白、cftr、共济蛋白、
vmd2、血红蛋白、苯丙氨酸羟化酶、原纤蛋白、肌营养不良性肌强直蛋白激酶、木质素酰辅酶a连接酶、肌养蛋白、甲基cpg结合蛋白2、β血红蛋白、肌微管蛋白、组织蛋白酶a、因子ix、脂蛋白脂肪酶、β半乳糖苷酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、酸-α葡糖苷酶、udp-葡糖醛酸基转移酶1-1、glcnac-1-磷酸转移酶、glcnac-1-磷酸转移酶、黏脂蛋白-1(mucolipin-1)、微粒体甘油三酯转移蛋白、鞘磷脂酶、酸性神经酰胺酶、溶酶体酸性脂肪酶、α-l-艾杜糖醛酸酶、乙酰肝素n-硫酸酯酶、α-n-乙酰葡糖胺糖苷酶、乙酰辅酶aα-氨基葡萄糖苷乙酰转移酶(acetyl-coa alpha-glucosaminide acetyltransferase)、n-乙酰氨基葡萄糖6-硫酸酯酶、n-乙酰半乳糖胺-6硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶a、囊性纤维化传导跨膜调节剂、和呼吸道蛋白质。
[0094]
作为另一些实例，治疗性蛋白质还包括与以下相关的蛋白质的功能形式：脂质和鞘脂降解障碍(例如，β-半乳糖苷酶-1、β-氨基己糖苷酶a、β-氨基己糖苷酶a和b、gm2激活蛋白、8-半乳糖苷酶a、葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶a、半乳糖神经酰胺酶、鞘磷脂酶、鞘磷脂酶、npc1、he1蛋白(胆固醇运输缺陷)、酸性神经酰胺酶、溶酶体酸性脂肪酶)；黏多糖降解障碍(例如，l-艾杜糖醛酸酶、l-艾杜糖醛酸酶、l-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、乙酰肝素n-硫酸酯酶、n-乙酰葡糖胺糖苷酶、乙酰辅酶a-葡萄糖苷酶、乙酰转移酶、乙酰氨基葡萄糖6-硫酸酯酶、半乳糖胺-6硫酸酯酶、芳基硫酸酯酶b、葡糖醛酸酶)；糖蛋白降解障碍(例如，甘露糖苷酶、甘露糖苷酶、l-岩藻糖苷酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、神经氨酸酶、溶酶体保护蛋白、溶酶体8-n-乙酰氨基半乳糖苷酶、溶酶体8-n-乙酰氨基半乳糖苷酶)；溶酶体贮积障碍(例如，棕榈酰蛋白硫酯酶(至少4个亚型)、溶酶体膜蛋白(未知)、葡萄糖6磷酸酶、葡萄糖6磷酸转位酶、酸性麦芽糖酶、脱支酶淀粉-1，6葡糖苷酶、n-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶、n-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶、神经节苷脂唾液酸酶(神经氨酸酶)、溶酶体胱氨酸转运蛋白、溶酶体胱氨酸转运蛋白、溶酶体胱氨酸转运蛋白、唾液酸转运蛋白saposin a、b、c、d)以及脑白质营养不良(例如，微粒体甘油三酯转移蛋白/载脂蛋白b、过氧化物酶体膜转移蛋白、peroxin、天冬氨酸酰化酶、甾醇-27-羟化酶、蛋白脂质蛋白、abc1转运蛋白、过氧化物酶体膜蛋白3或过氧化物酶体生物发生因子1、植酸氧化酶)。
[0095]
本文中提供的病毒转移载体可用于基因编辑。在这样的一些实施方案中，病毒转移载体的转基因是基因编辑转基因。这样的转基因编码基因编辑过程中涉及的试剂或组分。通常，这样的过程导致对基因组dna的持久或永久修饰，例如靶向dna插入、置换、诱变或去除。基因编辑可包括递送编码目的dna序列的核酸，并使用内切核酸酶将目的序列插入基因组dna的靶位点。因此，基因编辑转基因可包含编码用于插入的目的dna序列的这些核酸。在一些实施方案中，用于插入的dna序列是编码本文中提供的任一种治疗性蛋白质的dna序列。作为替代或补充，基因编辑转基因可包含编码可单独或与其他组分组合进行基因编辑过程的一种或更多种组分的核酸。本文中提供的基因编辑转基因可编码内切核酸酶和/或指导rna等。
[0096]
内切核酸酶可在基因组中的期望位置处在双链dna中产生断裂，并使用宿主细胞的机制使用同源重组、非同源末端连接等修复断裂。可用于基因编辑的内切核酸酶种类包括不限于：大范围核酸酶、锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应物核酸酶(talen)、成簇规律间隔的短回文重复序列(crispr)和归巢内切核酸酶。本文中提供的病毒转移载体的基
因编辑转基因可编码本文中提供的任一种内切核酸酶。
[0097]
大范围核酸酶通常以其识别和切割dna序列(约14至40个碱基对)的能力为特征。另外，可使用已知技术(例如诱变和高通量筛选和组合装配)来创建定制的大范围核酸酶，在此可将蛋白质亚基缔合或融合。大范围核酸酶的实例可见于美国专利no.8,802,437、8,445,251和8,338,157；以及美国公开no.20130224863、20110113509和20110033935，其大范围核酸酶通过引用并入本文。
[0098]
锌指核酸酶通常包含锌指结构域，其结合核酸分子内的特定靶位点；和核酸切割结构域，其在通过结合域结合的靶位点内或附近切割核酸分子。典型的经改造锌指核酸酶包含具有3至6个单独的锌指基序的结合域，和长度为9个碱基对至18个碱基对的结合靶位点。锌指核酸酶可设计成靶向给定核酸分子中的几乎任何期望序列以进行切割。例如，可以通过将已知特异性的单独的锌指基序组合来设计具有期望特异性的锌指结合域。与dna结合的锌指蛋白zif268的结构已为该领域的许多工作提供了信息，并且为64个可能的碱基对三联体中的每一个获取锌指并随后将这些模块化锌指进行混合和匹配以设计具有任何期望的序列特异性的蛋白质，这一构思已被描述(pavletich np，pabo co(1991年5月).“zinc finger-dna recognition：crystal structure of a zif268-dna complex at 2.1 a”.science 252(5007)：809-17，其全部内容并入本文)。在一些实施方案中，采用细菌或噬菌体展示来开发识别期望的核酸序列(例如，期望的内切核酸酶靶位点)的锌指结构域。在一些实施方案中，锌指核酸酶包含通过接头(例如，多肽接头)彼此融合或以其他方式缀合的锌指结合域和切割结构域。接头的长度可确定切割与被锌指结构域结合的核酸序列的距离。锌指核酸酶的实例可见于美国专利no.8,956,828、8,921,112、8,846,578、8,569,253，其锌指核酸酶通过引用并入本文。
[0099]
转录激活因子样效应物核酸酶(talen)是通过将特定的dna结合域与通用的dna切割结构域融合而产生的人工限制性酶。可设计成结合任何期望dna序列的dna结合域来自转录激活因子样(tal)效应物，由感染植物的某些细菌分泌的dna结合蛋白。转录激活因子样效应物(tale)可改造成结合几乎任何dna序列，或与dna切割结构域组合在一起形成阵列。talen可类似地用于设计锌指核酸酶。talens的实例可见于美国专利no.8,697,853以及美国公开no.20150118216、20150079064和20140087426，其talens通过引用并入本文。
[0100]
crispr(成簇规律间隔的短回文重复序列)/cas系统也可用于基因编辑。在crispr/cas系统中，指导rna(grna)是基因组或游离基因编码的(例如在质粒上)。转录之后，grna与内切核酸酶(例如cas9内切核酸酶)形成复合物。然后，通过grna的特异性确定序列(specificity determining sequence，sds)将复合物引导至通常位于细胞基因组中的dna靶序列。cas9或cas9内切核酸酶是指包含cas9蛋白或其片段(例如，包含cas9的活性或无活性dna切割结构域或部分无活性dna切割结构域(例如，cas9切口酶)和/或cas9的grna结合域的蛋白质)的rna引导的内切核酸酶。cas9识别crispr重复序列中的短基序(pam或前间区序列邻近基序(protospacer adjacent motif))以帮助区分自身与非自身。cas9内切核酸酶序列和结构是本领域技术人员公知的(参见，例如，“complete genome sequence of an m1 strain of streptococcus pyogenes.”ferretti j.j.，mcshan w.m.，ajdic d.j.，savic d.j.，savic g.，lyon k.，primeaux c.，sezate s.，suvorov a.n.，kenton s.，lai h.s.，lin s.p.，qian y.，jia h.g.，najar f.z.，ren q.，zhu h.，song l.展开/折叠作者
engineering via cas9.science 339，823-826(2013)；hwang，w.y.等efficient genome editing in zebrafish using a crispr-cas system.nature biotechnology 31，227-229(2013)；jinek，m.等rna-programmed genome editing in human cells.elife 2，e00471(2013)；dicarlo，j.e.等genome engineering in saccharomyces cerevisiae using crispr-cas systems.nucleic acids research(2013)；jiang，w.等rna-guided editing of bacterial genomes using crispr-cas systems.nature biotechnology 31，233-239(2013))。
[0104]
归巢内切核酸酶可在数个或单个位置处催化用于合成它们的基因组dna的水解，从而在宿主内水平传递其基因，提高其等位基因频率。归巢内切核酸酶通常具有长的识别序列，因此它们具有低的随机切割可能性。一个等位基因在传递之前携带该基因(归巢内切核酸酶基因 ，heg )，而另一个则不携带(heg-)，并且容易被酶切割。该酶一旦合成，就会破坏heg-等位基因中的染色体，并利用包含内切核酸酶的基因的重组的、未受损的dna等位基因heg 引发细胞dna修复系统的响应，该系统采取相反的模式。因此，该基因被复制到最初没有该基因的另一个等位基因，并连续传播。归巢内切核酸酶的实例可见于例如美国公开no.20150166969和美国专利no.9,005,973，其归巢内切核酸酶通过引用并入本文。
[0105]
本文中提供的病毒转移载体可用于基因表达调节。在这样的一些实施方案中，病毒转移载体的转基因是调节基因表达的转基因。这样的转基因编码可增强、抑制或调节一个或更多个内源基因的表达的基因表达调节剂。内源基因可编码本文中提供的任一种蛋白质，前提是该蛋白质是对象的内源性蛋白质。因此，该对象可以是患有本文中提供的任一种疾病或病症的对象，在该疾病或病症中通过基因表达调节将提供益处。
[0106]
基因表达调节剂包括dna结合蛋白(例如，人工转录因子，例如美国公开no.20140296129的那些，其人工转录因子通过引用并入本文；以及美国公开no.20030125286的转录沉默子蛋白nrf，其转录沉默子蛋白nrf通过引用并入本文)以及治疗性rna。治疗性rna包括但不限于：mrna翻译抑制剂(反义)、rna干扰剂(rnai)、催化活性rna分子(核酶)、转移rna(trna)以及结合蛋白质和其他分子配体的rna(适配体)。基因表达调节剂包括前述任何试剂并且包括反义核酸、rnai分子(例如，双链rna(dsrna)、单链rna(ssrna)、微rna(mirna)、短干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna))和三链体形成寡核苷酸(tfo)。基因表达调节剂还可包括任何前述rna分子的经修饰形式，并因此包括经修饰mrna，例如合成的经化学修饰rna。
[0107]
基因表达调节剂可以是反义核酸。反义核酸可提供基因表达(例如，突变蛋白、显性活性基因产物、与毒性相关的蛋白质或被传染因子(例如病毒)引入到细胞中的基因产物的表达)的靶向抑制。因此，调节基因表达的病毒转移载体可用于治疗与显性负或功能获得性致病机制相关的疾病或病症、癌症或感染。本文中提供的任一种方法的对象可以是患有病毒感染、炎性病症、心血管疾病、癌症、遗传疾病或自身免疫病的对象。反义核酸还可干扰mrna剪接机制并破坏正常细胞mrna加工。因此，调节基因表达的转基因可编码与剪接体蛋白相互作用的元件。反义核酸(和相关构建体)的实例可见于例如美国公开no.20050020529和20050271733，其反义核酸和构建体通过引用并入本文。
[0108]
基因表达调节剂还可以是核酶(即，可切割其他rna例如单链rna的rna分子)。这样的分子可改造成识别rna分子中的特定核苷酸序列并对其进行切割(cech，
j.amer.med.assn.，260：3030，1988)。例如，核酶可改造成使得仅使具有与包含核酶的构建体互补的序列的mrna失活。核酶的类型以及如何制备相关构建体是本领域已知的(hasselhoff等，nature，334：585，1988；和美国公开no.20050020529，其与这样的核酶和方法相关的教导通过引用并入本文)。
[0109]
基因表达调节剂可以是干扰rna(rnai)。rna干扰是指由干扰rna介导的序列特异性转录后基因沉默的过程。通常，dsrna的存在可触发rnai应答。已经在多种系统中研究了rnai。fire等，1998，nature，391，806，rnai in c.elegans；bahramian和zarbl，1999，molecular and cellular biology，19，274-283以及wianny和goetz，1999，nature cell biol.，2，70，rnai mediated by dsrna in mammalian systems；hammond等，2000，nature，404，293，rnai in drosophila cells；elbashir等，2001，nature，411，494，rnai induced by introduction of duplexes of synthetic 21-nucleotide rnas in cultured mammalian cells。这样的工作以及其他工作已经提供了有关在rnai分子构建中有用以介导rnai活性的长度、结构、化学组成和序列的指导。多个出版物提供了可用作基因表达调节剂的rnai分子的实例。这样的出版物包括美国专利no.8,993,530、8,877,917、8,293,719、7,947,659、7,919,473、7,790,878、7,737,265、7,592,322；以及美国公开no.20150197746、20140350071、20140315835、20130156845和20100267805，与rnai分子类型及其产生相关的教导通过引用并入本文。
[0110]
适配体可结合多种蛋白质靶标并破坏那些蛋白质与其他蛋白质的相互作用。因此，基因表达调节剂可以是适配体，并且调节基因表达的转基因可编码这样的适配体。适配体可根据其通过特异性结合调节蛋白质的dna结合位点来阻止基因转录的能力进行选择。pct公开no.wo 98/29430和wo 00/20040提供了用于调节基因表达的适配体的实例；并且美国公开no.20060128649也提供了这样的适配体的实例，其各自的适配体均通过引用并入本文。
[0111]
作为另一个实例，基因表达调节剂可以是三链体寡聚物。这样的分子可以使转录停滞。通常，这被称为三链体策略，因为寡聚物围绕双螺旋dna缠绕，形成三链螺旋。这样的分子可设计成识别所选基因上的独特位点(maher等，antisense res.and dev.，1(3)：227，1991；helene，c.，anticancer drug design，6(6)：569，1991)。
[0112]
本文中提供的病毒转移载体也可用于外显子跳读。在这样的一些实施方案中，病毒转移载体的转基因是外显子跳读转基因。这样的转基因编码可产生外显子跳读的反义寡核苷酸或其他试剂。尽管存在基因突变，反义寡核苷酸仍可干扰外显子内的剪接位点或调控元件，导致截短的、部分功能的蛋白质。另外，反义寡核苷酸可以是突变特异性的，并与前信使rna中的突变位点结合以诱导外显子跳读。用于外显子跳读的反义寡核苷酸在本领域中是已知的并且通常称为aon。这样的aon包括snrna。反义寡核苷酸、其设计方法和相关制备方法的实例可见于例如美国公开no.20150225718、20150152415、20150140639、20150057330、20150045415、20140350076、20140350067和20140329762，其aon以及所描述的相关方法，例如设计和产生aon的方法，通过引用整体并入本文。
[0113]
本文中提供的任一种方法可用于在有此需要的对象的细胞中得到外显子跳读。该对象可患有其中外显子跳读会提供益处的任何疾病或病症，并且反义寡核苷酸可基于与这样的疾病或病症相关的适当蛋白质(其中在其表达过程中外显子跳读会是有益的)来设计。
本文中提供了疾病和病症以及相关蛋白质的实例。在本文中提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，对象患有本文中所述的任一种营养不良，例如肌营养不良症(例如，迪谢内肌营养不良)。因此，在本文中提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，外显子跳读转基因编码反义寡核苷酸或其他试剂，其可导致与本文中还提供的任一种营养不良相关的本文中提供的任一种蛋白质中的外显子跳读。在本文中提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，反义寡核苷酸或其他试剂可导致肌养蛋白中的外显子跳读。
[0114]
转基因的序列还可包含表达控制序列。表达控制dna序列包含启动子、增强子和操纵子，并且一般基于其中利用表达构建体的表达系统进行选择。在一些实施方案中，选择启动子和增强子序列用于提高基因表达的能力，同时可选择操纵子序列用于调节基因表达的能力。转基因还可包含有助于并优选地促进宿主细胞中同源重组的序列。转基因还可包含在宿主细胞中复制所必需的序列。
[0115]
示例性表达控制序列包括启动子序列，例如巨细胞病毒启动子；劳斯肉瘤病毒启动子；和猿猴病毒40启动子；以及在本文中其他地方公开或本领域中已知的任何其他类型的启动子。通常来说，启动子有效地连接编码期望表达产物的序列的上游(即，5
′
)。转基因还可包含可操作地连接编码序列的下游(即，3
′
)的合适的多腺苷酸化序列(例如，sv40或人生长激素基因多腺苷酸化序列)。
[0116]
病毒载体
[0117]
病毒已经进化出了专门的机制以将它们的基因组转运到它们所感染的细胞内；基于这样的病毒的病毒载体可以定制以转导用于特定应用的细胞。本文中提供的可使用的病毒载体的实例是本领域中已知的或记载于本文中。合适的病毒载体包括例如：逆转录病毒载体、慢病毒载体、基于单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，hsv)的载体、基于腺病毒的载体、基于腺相关病毒(aav)的载体和aav-腺病毒嵌合载体。
[0118]
本文中提供的病毒转移载体可以基于逆转录病毒。逆转录病毒是能够感染多种宿主细胞的单链正义rna病毒。感染之后，逆转录病毒基因组整合到其宿主细胞的基因组中，利用其自身的逆转录酶从其rna基因组产生dna。然后，病毒dna与宿主细胞dna一起复制，后者翻译并转录病毒和宿主基因。可以操作逆转录病毒载体以使病毒不能复制。因此，认为逆转录病毒载体特别可用于体内稳定的基因转移。逆转录病毒载体的实例可见于例如美国公开no.20120009161、20090118212和20090017543，病毒载体及其制备方法通过引用整体并入本文。
[0119]
慢病毒载体是可用于产生如本文中提供的病毒转移载体的逆转录病毒载体的实例。慢病毒具有感染非分裂细胞的能力，这是构成基因递送载体的更有效方法的一种特性(参见例如durand等，viruses.2011年2月；3(2)：132-159)。慢病毒的实例包括：hiv(人)、猿猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，siv)、猫免疫缺陷病毒(feline immunodeficiency virus，fiv)、马感染性贫血病毒(equine infectious anemia virus，eiav)和绵羊髓鞘脱落病毒(visna virus)(绵羊慢病毒)。与其他逆转录病毒不同，已知基于hiv的载体将其乘客基因(passenger gene)并入到非分裂细胞中。慢病毒载体的实例可见于例如美国公开no.20150224209、20150203870、20140335607、20140248306、20090148936和20080254008，病毒载体及其制备方法通过引用整体并入本文。
[0120]
基于单纯疱疹病毒(hsv)的病毒载体也适合于本文中提供的用途。许多复制缺陷
型hsv载体包含缺失，以去除一个或更多个立即早期基因以阻止复制。疱疹载体的优势在于其进入潜伏期(可导致长期dna表达)的能力，以及其大病毒dna基因组(可容纳高至25kb的外源dna)。对于基于hsv的载体的描述，参见例如美国专利no.5,837,532、5,846,782、5,849,572和5,804,413，以及国际专利申请wo 91/02788、wo 96/04394、wo 98/15637和wo 99/06583，其对病毒载体及其制备方法的描述通过引用整体并入。
[0121]
腺病毒(ad)是非包膜病毒，其可将dna在体内转移至多种不同的靶细胞类型。通过使病毒复制所需的选择基因缺失可以使病毒成为复制缺陷型。还经常使消耗性的非复制必需e3区缺失以允许为更大的dna插入留出另外的空间。病毒转移载体可以基于腺病毒。腺病毒转移载体可以高滴度产生并且可将dna有效地转移至复制和非复制细胞。与慢病毒不同，腺病毒dna不会整合到基因组中，并因此不会在细胞分裂过程中复制，而是利用宿主的复制机制在宿主细胞的核中复制。
[0122]
可作为病毒转移载体基础的腺病毒可以来自任何来源、任何亚组、任何亚型、亚型混合物或任何血清型。例如，腺病毒可以是亚组a(例如，血清型12、18和31)、亚组b(例如，血清型3、7、11、14、16、21、34、35和50)、亚组c(例如，血清型1、2、5和6)、亚组d(例如，血清型8、9、10、13、15、17、19、20、22-30、32、33、36-39和42-48)、亚组e(例如，血清型4)、亚组f(例如，血清型40和41)、未分类的血清组(例如，血清型49和51)或任何其他腺病毒血清型。腺病毒血清型1至51可从美国典型培养物保藏中心(american type culture collection)(atcc，manassas，va.)获得。非组c腺病毒以及甚至非人腺病毒可用于制备复制缺陷型腺病毒载体。非组c腺病毒载体、产生非组c腺病毒载体的方法和使用非组c腺病毒载体的方法公开于例如，美国专利no.5,801,030、5,837,511和5,849,561，以及国际专利申请wo 97/12986和wo 98/53087。任何腺病毒、甚至嵌合腺病毒可以用作腺病毒载体的病毒基因组的来源。例如，人腺病毒可以用作复制缺陷型腺病毒载体的病毒基因组的来源。腺病毒载体的另一些实例可见于美国公开no.20150093831、20140248305、20120283318、20100008889、20090175897和20090088398，其对病毒载体及其制备方法的描述通过引用整体并入。
[0123]
本文中提供的病毒转移载体还可以基于腺相关病毒(aav)。aav载体对于用于治疗应用(例如本文所述的那些)特别令人感兴趣。aav是dna病毒，已知其不会导致人疾病。通常，aav需要与辅助病毒(例如，腺病毒或疱疹病毒)共感染，或表达辅助基因以用于有效复制。aav具有在特定位点稳定感染宿主细胞基因组的能力，使其比逆转录病毒更容易预测；然而，一般来说，载体的克隆能力为4.9kb。已用于基因治疗应用的aav载体通常已缺失了约96％的亲本基因组，因此仅保留了包含dna复制和包装识别信号的末端重复序列(itr)。对于基于aav的载体的描述，参见例如美国专利no.8,679,837、8,637,255、8,409,842、7,803,622和7,790,449，以及美国公开no.20150065562、20140155469、20140037585、20130096182、20120100606和20070036757，其病毒载体和制备方法通过引用整体并入本文。aav载体可以是重组aav载体。aav载体还可以是自互补(self-complementary，sc)aav载体，其描述于例如美国专利公开2007/01110724和2004/0029106以及美国专利no.7,465,583和7,186,699，其载体和制备方法通过引入并入本文。
[0124]
作为病毒转移载体基础的腺相关病毒可以是任何血清型或血清型混合物。aav血清型包括aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10和aav11。例如，当病毒转移载体基于血清型的混合物时，病毒转移载体可包含取自一种aav血清型(例如选自aav
血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11中的任一种)的衣壳信号序列和来自不同血清型(例如选自aav血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11中的任一种)的包装序列。因此，在本文中提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，aav载体是aav 2/8载体。在本文中提供的任一种方法或组合物的另一些实施方案中，aav载体是aav 2/5载体。
[0125]
本文中提供的病毒转移载体也可以基于甲病毒。甲病毒包括：辛德毕斯(sindbis)(和veev)病毒、奥拉病毒(aura virus)、巴班肯病毒(babanki virus)、巴马森林病毒(barmah forest virus)、贝巴鲁病毒(bebaru virus)、卡巴斯欧病毒(cabassou virus)、基孔肯雅病毒(chikungunya virus)、东部马脑炎病毒(eastern equine encephalitis virus)、沼泽地病毒(everglades virus)、摩根堡病毒(fort morgan virus)、盖塔病毒(getah virus)、高地j病毒(highlands j virus)、孜拉加奇病毒(kyzylagach virus)、马亚罗病毒病毒(mayaro virus)、me tri病毒(me tri virus)、米德尔堡病毒(middelburg virus)、莫斯达斯佩德拉斯病毒(mosso das pedras virus)、穆坎布病毒(mucambo virus)、恩杜穆病毒(ndumu virus)、奥尼永尼永病毒(o
′
nyong-nyong virus)、那皮舒纳病毒(pixuna virus)、里奥内格罗病毒(rio negro virus)、罗斯河病毒(ross river virus)、鲑鱼胰腺病病毒(salmon pancreas disease virus)、塞姆利基森林病毒(semliki forest virus)、南方象海豹病毒(southern elephant seal virus)、图那特病毒(tonate virus)、特罗卡拉病毒(trocara virus)、乌纳病毒(una virus)、委内瑞拉马脑炎病毒(venezuelan equine encephalitis virus)、西部马脑炎病毒(western equine encephalitis virus)和瓦塔罗阿病毒(whataroa virus)。通常，这样的病毒的基因组编码可在宿主细胞的细胞质中翻译的非结构性(例如，复制子)和结构性蛋白质(例如，衣壳和包膜)。罗斯河病毒、辛德毕斯病毒(sindbis virus)、塞姆利基森林病毒(sfv)和委内瑞拉马脑炎病毒(veev)已全部用于开发病毒转移载体以用于转基因递送。假型病毒(pseudotyped virus)可通过将甲病毒包膜糖蛋白和逆转录病毒衣壳组合而形成。甲病毒载体的实例可见于美国公开no.20150050243、20090305344和20060177819；载体及其制备方法通过引用整体并入本文。
[0126]
皮质类固醇
[0127]
皮质类固醇是类固醇激素，例如在脊椎动物的肾上腺皮质中产生，以及这些激素的合成类似物。皮质类固醇包括糖皮质激素和盐皮质激素。
[0128]
皮质类固醇的实例包括但不限于：阿氯米松(alclometasone)、安西奈德(amcinonide)、倍氯米松(beclometasone)、倍他米松(betamethasone)、布地奈德(budesonide)、环索奈德(ciclesonide)、氯倍他索(clobetasol)、氯倍他松(clobetasone)、氯可托龙(clocortolone)、氯泼尼醇(cloprednol)、可的发唑(cortivazol)、地氟可特(deflazacort)、脱氧皮质酮(deoxycorticosterone)、地奈德去羟米松(desonide desoximetasone)、地塞米松(dexamethasone)、二氟拉松(diflorasone)、二氟可龙(diflucortolone)、二氟泼尼酯(difluprednate)、氟氯奈德(fluclorolone)、氟氢可的松(fludrocortisone)、氟氢缩松(fludroxycortide)、氟米松(flumetasone)、氟尼缩松(flunisolide)、氟轻松乙酸酯(fluocinolone acetonide)、氟轻松乙酸酯(fluocinonide)、氟可丁(fluocortin)、氟可龙(fluocortolone)、氟米龙(fluorometholone)、氟培龙(fluperolone)、氟替卡松(fluticasone)、氟替卡松丙酸酯
二酮环16α，17α-乙缩醛与丙酮；氟轻松乙酸酯＝6α，9α-二氟-11β，16α，17α，21-四羟基孕-1，4-二烯-3，20-二酮环16α，17α-乙缩醛与丙酮；氟轻松乙酸酯＝6α，9α-二氟-11β，16α，17α，21-四羟基孕-1，4-二烯-3，20-二酮环16α，17α-乙缩醛与丙酮，21-乙酸酯；哈西奈德＝9α-氟-11β，16α，17α-三羟基-21-氯孕-4-烯-3，20-二酮环16α，17α-乙缩醛与丙酮；和曲安奈德＝9α-氟-11β，16α，17α，21-四羟基孕-1，4-二烯-3，20-二酮环16α，17α-乙缩醛与丙酮)；和其他(例如，可的发唑＝6，16α-二甲基-11β，17α，21-三羟基-2
′‑
苯基[3，2-c]吡唑并孕-4，6-二烯-20-酮21-乙酸酯；和ru-28362＝6-甲基-11β，17β-二羟基-17α-(1-丙炔基)雄甾-1，4，6-三烯-3-酮)。
[0130]
在本文提供的任何一种方法、组合物或药盒的一些实施方案中，皮质类固醇不与合成纳米载体偶联。
[0131]
包含免疫抑制剂的合成纳米载体
[0132]
根据本发明，可以使用广泛多种的合成纳米载体。在一些实施方案中，合成纳米载体是球体或球状体。在一些实施方案中，合成纳米载体是平的或片状的。在一些实施方案中，合成纳米载体是立方体或立方体的。在一些实施方案中，合成纳米载体是卵形体或椭圆形体。在一些实施方案中，合成纳米载体是圆柱体、锥体或棱锥形体。
[0133]
在一些实施方案中，期望使用在大小或形状方面相对均匀的合成纳米载体群体，使得每个合成纳米载体具有相似的特性。例如，基于合成纳米载体的总数，所提供的任一种组合物或方法的合成纳米载体的至少80％、至少90％或至少95％的最小尺寸或最大尺寸落在合成纳米载体的平均直径或平均尺寸的5％、10％或20％内。
[0134]
合成纳米载体可以是实心的或中空的，并且可包含一个或更多个层。在一些实施方案中，每个层相对于另外的层具有独特的组成和独特的特性。仅给出一个实例，合成纳米载体可具有核/壳结构，其中核是一个层(例如聚合物核)，并且壳是第二层(例如脂质双层或单层)。合成纳米载体可包含多个不同的层。
[0135]
在一些实施方案中，合成纳米载体可任选地包含一种或更多种脂质。在一些实施方案中，合成纳米载体可包含脂质体。在一些实施方案中，合成纳米载体可包含脂质双层。在一些实施方案中，合成纳米载体可包含脂质单层。在一些实施方案中，合成纳米载体可包含胶束。在一些实施方案中，合成纳米载体可包含由脂质层(例如脂质双层、脂质单层等)包围的包含聚合物基质的核。在一些实施方案中，合成纳米载体可包含由脂质层(例如，脂质双层、脂质单层等)包围的非聚合物的核(例如，金属颗粒、量子点、陶瓷颗粒、骨颗粒、病毒颗粒、蛋白质、核酸、碳水化合物等)。
[0136]
在另一些实施方案中，合成纳米载体可包含金属颗粒、量子点、陶瓷颗粒等。在一些实施方案中，非聚合物合成纳米载体是非聚合物组分的聚集体，例如金属原子(例如金原子)的聚集体。
[0137]
在一些实施方案中，合成纳米载体可任选地包含一种或更多种两亲性实体。在一些实施方案中，两亲性实体可以促进具有提高的稳定性、改善的均一性或提高的黏度的合成纳米载体的产生。在一些实施方案中，两亲性实体可以与脂质膜(例如，脂质双层、脂质单层等)的内表面缔合。本领域中已知的许多两亲性实体适合用于制备根据本发明的合成纳米载体。这样的两亲性实体包括但不限于：磷酸甘油酯；磷脂酰胆碱；二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)；二油基磷脂酰乙醇胺(dope)；二油基丙基三乙基铵(dotma)；二油酰磷脂酰胆碱；胆
固醇；胆固醇酯；二酰基甘油；琥珀酸二酰基甘油酯；二磷脂酰甘油(dppg)；己烷癸醇；脂肪醇例如聚乙二醇(peg)；聚氧乙烯-9-月桂醚；表面活性脂肪酸，例如棕榈酸或油酸；脂肪酸；脂肪酸单甘油酯；脂肪酸甘油二酯；脂肪酸酰胺；脱水山梨糖醇三油酸酯(85)甘胆酸盐；脱水山梨糖醇单月桂酸酯(20)；聚山梨酯20(20)；聚山梨酯60(60)；聚山梨酯65(65)；聚山梨酯80(80)；聚山梨酯85(85)；聚氧乙烯单硬脂酸酯；表面活性素；泊洛沙姆；脱水山梨糖醇脂肪酸酯，例如脱水山梨醇三油酸酯；卵磷脂；溶血卵磷脂；磷脂酰丝氨酸；磷脂酰肌醇；鞘磷脂；磷脂酰乙醇胺(脑磷脂)；心磷脂；磷脂酸；脑苷脂；磷酸二鲸蜡酯；二棕榈酰磷脂酰甘油；硬脂胺；十二烷基胺；十六烷基胺；乙酰棕榈酸酯；甘油蓖麻油酸酯；硬脂酸十六烷基酯；豆蔻酸异丙酯；泰洛沙泊；聚(乙二醇)5000-磷脂酰乙醇胺；聚(乙二醇)400单硬脂酸酯；磷脂；具有高表面活性剂性质的合成和/或天然洗涤剂；脱氧胆酸盐；环糊精；离液盐；离子配对剂；及其组合。两亲性实体组分可以是不同的两亲性实体的混合物。本领域技术人员将认识到，这是具有表面活性剂活性的物质的示例性而非全面的列举。任何两亲性实体均可用于产生根据本发明使用的合成纳米载体。
[0138]
在一些实施方案中，合成纳米载体可任选地包含一种或更多种碳水化合物。碳水化合物可以是天然的或合成的。碳水化合物可以是衍生化的天然碳水化合物。在某些实施方案中，碳水化合物包括单糖或二糖，其包括但不限于：葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺和神经氨酸。在某些实施方案中，碳水化合物是多糖，其包括但不限于：短梗霉聚糖(pullulan)、纤维素、微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素(hpmc)、羟基纤维素(hc)、甲基纤维素(mc)、葡聚糖、环葡聚糖、糖原、羟乙基淀粉、角叉菜胶、糖基(glycon)、直链淀粉(amylose)、壳聚糖、n，o-羧甲基壳聚糖、藻胶和藻酸、淀粉、壳多糖、菊粉、魔芋、葡甘露聚糖、石耳葡聚糖、肝素、透明质酸、凝胶多糖和黄原胶。在一些实施方案中，合成纳米载体不包含(或特别排除)碳水化合物，例如多糖。在某些实施方案中，碳水化合物可包括碳水化合物衍生物，例如糖醇，其包括但不限于：甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇和乳糖醇。
[0139]
在一些实施方案中，合成纳米载体可包含一种或更多种聚合物。在一些实施方案中，合成纳米载体包含为非甲氧基封端的普朗尼克聚合物的一种或更多种聚合物。在一些实施方案中，构成合成纳米载体的聚合物的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％(重量/重量)是非甲氧基封端的普朗尼克聚合物。在一些实施方案中，构成合成纳米载体的所有聚合物是非甲氧基封端的普朗尼克聚合物。在一些实施方案中，合成纳米载体包含为非甲氧基封端的聚合物的一种或更多种聚合物。在一些实施方案中，构成合成纳米载体的聚合物的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％(重量/重量)是非甲氧基封端的聚合物。在一些实施方案中，构成合成纳米载体的所有聚合物是非甲氧基封端的聚合物。在一些实施方案中，合成纳米载体包含不含普朗尼克聚合物的一种或更多种聚合物。在一些实施方案中，构成合成纳米载体的聚合物的至少1％、2％、3％、4％、
5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％(重量/重量)不包含普朗尼克聚合物。在一些实施方案中，构成合成纳米载体的所有聚合物不包含普朗尼克聚合物。在一些实施方案中，这样的聚合物可以被涂层(例如脂质体、脂质单层、胶束等)包围。在一些实施方案中，合成纳米载体的要素可以与聚合物连接。
[0140]
可以通过多种方法中的任一种将免疫抑制剂与合成纳米载体偶联。通常来说，连接可以是免疫抑制剂与合成纳米载体之间结合的结果。这种结合可导致免疫抑制剂与合成纳米载体的表面连接和/或被包含(包封)在合成纳米载体内。然而，在一些实施方案中，由于合成纳米载体的结构，免疫抑制剂被合成纳米载体包封，而不是与合成纳米载体结合。在一些优选的实施方案中，合成纳米载体包含本文中提供的聚合物，并且免疫抑制剂与聚合物连接。
[0141]
当由于免疫抑制剂和合成纳米载体之间的结合而发生连接时，连接可通过偶联部分来发生。偶联部分可以是免疫抑制剂通过其与合成纳米载体结合的任何部分。这样的部分包括使免疫抑制剂与合成纳米载体(共价或非共价地)结合的共价键(例如酰胺键或酯键)以及单独分子。这样的分子包括接头或聚合物或其单元。例如，偶联部分可以包含免疫抑制剂与其静电结合的带电聚合物。作为另一个实例，偶联部分可以包含与其共价结合的聚合物或其单元。
[0142]
在一些优选的实施方案中，合成纳米载体包含本文中提供的聚合物。这些合成纳米载体可以是完全聚合物，或者其可以是聚合物与其他物质的混合物。
[0143]
在一些实施方案中，合成纳米载体的聚合物缔合以形成聚合物基质。在这些实施方案的一些中，组分(例如免疫抑制剂)可以与聚合物基质的一种或更多种聚合物共价缔合。在一些实施方案中，共价缔合由接头介导。在一些实施方案中，组分可以与聚合物基质的一种或更多种聚合物非共价缔合。例如，在一些实施方案中，组分可以包封在聚合物基质内、被聚合物基质包围和/或分散在整个聚合物基质中。作为替代或补充，组分可通过疏水相互作用、电荷相互作用、范德华力等与聚合物基质中的一种或更多种聚合物缔合。用于由此形成聚合物基质的广泛多种的聚合物和方法是常规已知的。
[0144]
聚合物可以是天然或非天然(合成)聚合物。聚合物可以是均聚物或包含两种或更多种单体的共聚物。就序列而言，共聚物可以是随机的、嵌段的、或包含随机和嵌段序列的组合。通常来说，根据本发明的聚合物是有机聚合物。
[0145]
在一些实施方案中，聚合物包含聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、或聚醚、或其单元。在另一些实施方案中，聚合物包含聚(乙二醇)(peg)、聚丙二醇、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物、或聚己内酯、或其单元。在一些实施方案中，优选地，聚合物是生物可降解的。因此，在这些实施方案中，优选地，如果聚合物包含聚醚，例如聚(乙二醇)或聚丙二醇或其单元，则聚合物包含聚醚和生物可降解聚合物的嵌段共聚物，使得聚合物是生物可降解的。在另一些实施方案中，聚合物不仅仅包含聚醚或其单元，例如聚(乙二醇)或聚丙二醇或其单元。
[0146]
适用于本发明的聚合物的其他实例包括但不限于：聚乙烯、聚碳酸酯(例如聚(1，3-二氧六环-2酮))、聚酸酐(例如聚(癸二酸酐))、聚富马酸丙酯(polypropylfumerate)、聚酰胺(例如聚己内酰胺)、聚缩醛、聚醚、聚酯(例如，聚丙交酯、聚乙交酯、聚丙交酯-乙交酯
共聚物、聚己内酯、聚羟基酸(例如聚(β-羟基链烷酸酯)))、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、和聚胺、聚赖氨酸、聚赖氨酸-peg共聚物和聚(乙烯亚胺)、聚(乙烯亚胺)-peg共聚物。
[0147]
在一些实施方案中，根据本发明的聚合物包含已由美国食品和药物管理局(food and drug administration，fda)根据21 c.f.r.
§
177.2600批准用于人的聚合物，包括但不限于：聚酯(例如，聚乳酸、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物、聚己内酯、聚戊内酯、聚(1，3-二氧六环-2酮))；聚酸酐(例如，聚(癸二酸酐))；聚醚(例如，聚乙二醇)；聚氨酯；聚甲基丙烯酸酯；聚丙烯酸酯；和聚氰基丙烯酸酯。
[0148]
在一些实施方案中，聚合物可以是亲水的。例如，聚合物可包含阴离子基团(例如磷酸根基团、硫酸根基团、羧酸根基团)；阳离子基团(例如季铵基团)；或极性基团(例如，羟基、巯基、胺基)。在一些实施方案中，包含亲水性聚合物基质的合成纳米载体在合成纳米载体内产生亲水性环境。在一些实施方案中，聚合物可以是疏水性的。在一些实施方案中，包含疏水性聚合物基质的合成纳米载体在合成纳米载体内产生疏水性环境。聚合物的亲水性或疏水性的选择可对并入合成纳米载体内的物质的性质产生影响。
[0149]
在一些实施方案中，聚合物可用一个或更多个部分和/或官能团进行修饰。根据本发明可使用多种部分或官能团。在一些实施方案中，聚合物可用聚乙二醇(peg)、用碳水化合物和/或用衍生自多糖的非环状聚缩醛进行修饰(papisov，2001，acs symposium series，786：301)。某些实施方案可使用gref等的美国专利no.5543158或von andrian等的wo公开wo 2009/051837的一般教导来进行。
[0150]
在一些实施方案中，聚合物可以用脂质或脂肪酸基团修饰。在一些实施方案中，脂肪酸基团可以是丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸或木蜡酸中的一种或更多种。在一些实施方案中，脂肪酸基团可以是棕榈油酸、油酸、反型异油酸、亚油酸、α-亚油酸、γ-亚油酸、花生四烯酸、鳕油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸或芥酸中的一种或更多种。
[0151]
在一些实施方案中，聚合物可以是聚酯，包括：包含乳酸和乙醇酸单元的共聚物，例如聚(乳酸-乙醇酸)共聚物和聚(丙交酯-乙交酯)共聚物，在本文中统称为“plga”；和包含乙醇酸单元的均聚物，在本文中称为“pga”，以及包含乳酸单元的均聚物，例如聚-l-乳酸、聚-d-乳酸、聚-d，l-乳酸、聚-l-丙交酯、聚-d-丙交酯和聚-d，l-丙交酯，在本文中统称为“pla”。在一些实施方案中，示例性聚酯包括例如：聚羟基酸；peg共聚物以及丙交酯和乙交酯的共聚物(例如pla-peg共聚物、pga-peg共聚物、plga-peg共聚物)及其衍生物。在一些实施方案中，聚酯包括例如：聚(己内酯)、聚(己内酯)-peg共聚物、聚(l-丙交酯-l-赖氨酸)共聚物、聚(丝氨酸酯)、聚(4-羟基-l-脯氨酸酯)、聚[α-(4-氨基丁基)-l-乙醇酸]、及其衍生物。
[0152]
在一些实施方案中，聚酯可以是plga。plga是乳酸和乙醇酸的生物相容性和生物可降解的共聚物，并且多种形式的plga特征在于乳酸：乙醇酸的比例。乳酸可以是l-乳酸、d-乳酸或d，l-乳酸。plga的降解速率可以通过改变乳酸：乙醇酸的比例来调节。在一些实施方案中，根据本发明待使用的plga特征在于约85∶15、约75∶25、约60∶40、约50∶50、约40∶60、约25∶75或约15∶85的乳酸∶乙醇酸比例。
[0153]
在一些实施方案中，聚合物可以是一种或更多种丙烯酸类聚合物。在某些实施方
案中，丙烯酸类聚合物包括例如：丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙酯、甲基丙烯酸氰基乙酯、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、甲基丙烯酸烷基酰胺共聚物、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸酐)、甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)共聚物、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚物、聚氰基丙烯酸酯，以及包含一种或更多种前述聚合物的组合。丙烯酸聚合物可以包括具有低含量的季铵基团的丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的完全聚合的共聚物。
[0154]
在一些实施方案中，聚合物可以是阳离子聚合物。通常来说，阳离子聚合物能够缩合和/或保护核酸的带负电荷的链。含胺聚合物例如聚(赖氨酸)(zauner等，1998，adv.drug del.rev.，30：97；和kabanov等，1995，bioconjugate chem.，6：7)、聚(乙烯亚胺)(pei；boussif等，1995，proc.natl.acad.sci.，usa，1995，92：7297)和聚(酰氨基胺)树枝状聚合物(kukowska-latallo等，1996，proc.natl.acad.sci.，usa，93：4897；tang等，1996，bioconjugate chem.，7：703；和haensler等，1993，bioconjugate chem.，4：372)在生理ph下带正电荷，与核酸形成离子对。在一些实施方案中，合成纳米载体可不包含(或可排除)阳离子聚合物。
[0155]
在一些实施方案中，聚合物可以是带有阳离子侧链的可降解聚酯(putnam等，1999，macromolecules，32：3658；barrera等，1993，j.am.chem.soc.，115：11010；kwon等，1989，macromolecules，22：3250；lim等，1999，j.am.chem.soc.，121：5633；和zhou等，1990，macromolecules，23：3399)。这些聚酯的实例包括：聚(l-丙交酯-l-赖氨酸)共聚物(barrera等，1993，j.am.chem.soc.，115：11010)、聚(丝氨酸酯)(zhou等，1990，macromolecules，23：3399)、聚(4-羟基-l-脯氨酸酯)(putnam等，1999，macromolecules，32：3658；和lim等，1999，j.am.chem.soc.，121：5633)和聚(4-羟基-l-脯氨酸酯)(putnam等，1999，macromolecules，32：3658；和lim等，1999，j.am.chem.soc.，121：5633)。
[0156]
这些和其他聚合物的特性及其制备方法是本领域中公知的(参见例如美国专利6,123,727；5,804,178；5,770,417；5,736,372；5,716,404；6,095,148；5,837,752；5,902,599；5,696,175；5,514,378；5,512,600；5,399,665；5,019,379；5,010,167；4,806,621；4,638,045和4,946,929；wang等，2001，j.am.chem.soc.，123：9480；lim等，2001，j.am.chem.soc.，123：2460；langer，2000，acc.chem.res.，33：94；langer，1999，j.control.release，62：7；和uhrich等，1999，chem.rev.，99：3181)。更一般地，用于合成某些合适聚合物的多种方法描述于concise encyclopedia of polymer science and polymeric amines and ammonium salts，由goethals编辑，pergamon press，1980；odian，john wiley&sons的principles of polymerization，第四版，2004；allcock等的contemporary polymer chemistry，prentice-hall，1981；deming等，1997，nature，390：386；以及美国专利6,506,577、6,632,922、6,686,446和6,818,732中。
[0157]
在一些实施方案中，聚合物可以是直链或支链聚合物。在一些实施方案中，聚合物可以是树枝状聚合物。在一些实施方案中，聚合物可以基本上彼此交联。在一些实施方案中，聚合物可以基本上不交联。在一些实施方案中，聚合物可以无需进行交联步骤来根据本发明使用。还应理解，合成纳米载体可包含前述任一种嵌段共聚物、接枝共聚物、共混物、混合物和/或加合物以及其他聚合物。本领域技术人员将认识到，本文中列出的聚合物代表可
根据本发明使用的聚合物的示例性而非全面的列举。
[0158]
在一些实施方案中，合成纳米载体不包含聚合物组分。在一些实施方案中，合成纳米载体可包含金属颗粒、量子点、陶瓷颗粒等。在一些实施方案中，非聚合物合成纳米载体是非聚合物组分的聚集体，例如金属原子(例如金原子)的聚集体。
[0159]
在一些实施方案中，如本文中提供的任何免疫抑制剂可与合成纳米载体偶联。免疫抑制剂包括但不限于：他汀类；mtor抑制剂，例如雷帕霉素或雷帕霉素类似物(“rapalog”)；tgf-β信号传导剂；tgf-β受体激动剂；组蛋白脱乙酰酶(hdac)抑制剂；线粒体功能抑制剂，例如鱼藤酮；p38抑制剂；nf-κb抑制剂；腺苷受体激动剂；前列腺素e2激动剂；磷酸二酯酶抑制剂，例如磷酸二酯酶4抑制剂；蛋白酶体抑制剂；激酶抑制剂；g蛋白偶联受体激动剂；g蛋白偶联受体拮抗剂；类视黄醇；细胞因子抑制剂；细胞因子受体抑制剂；细胞因子受体激活剂；过氧化物酶体增殖物激活受体拮抗剂；过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂；组蛋白脱乙酰酶抑制剂；钙调磷酸酶抑制剂；磷酸酶抑制剂和氧化的atp。免疫抑制剂还包括：ido、维生素d3、环孢素a、芳烃受体抑制剂、白藜芦醇、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、阿司匹林、尼氟酸、雌三醇、雷公藤甲素(tripolide)、白介素(例如il-1、il-10)、环孢素a、靶向细胞因子或细胞因子受体的sirna等。
[0160]
mtor抑制剂的实例包括：雷帕霉素及其类似物(例如，ccl-779、rad001、ap23573、c20-甲代烯丙基雷帕霉素(c20-marap)、c16-(s)-丁基磺酰氨基雷帕霉素(c16-bsrap)、c16-(s)-3-甲基吲哚雷帕霉素(c16-irap)(bayle等chemistry&biology 2006，13：99-107))、azd8055、bez235(nvp-bez235)、大黄根酸(大黄酚)、地磷莫司(mk-8669)、依维莫司(rad0001)、ku-0063794、pi-103、pp242、替西罗莫司和wye-354(可从selleck，houston，tx，usa获得)。
[0161]
nf(例如nk-κβ)抑制剂的实例包括：ifrd1、2-(1，8-萘啶-2-基)-苯酚、5-氨基水杨酸、bay 11-7082、bay 11-7085、cape(咖啡酸苯乙酯)、马来酸二乙酯、ikk-2抑制剂iv、imd0354、乳胞素、mg-132[z-leu-leu-leu-cho]、nfκb激活抑制剂iii、nf-κb激活抑制剂ii、jsh-23、小白菊内酯(parthenolide)、苯基胂氧化物(pao)、ppm-18、吡咯烷二硫代氨基甲酸铵盐、qnz、ro 106-9920、楝酰胺(rocaglamide)、楝酰胺al、楝酰胺c、楝酰胺i、楝酰胺j、洛克米兰醇(rocaglaol)、(r)-mg-132、水杨酸钠、雷公藤内酯(pg490)和蟛蜞菊内酯(vedelolactone)。
[0162]
本文中使用的“雷帕霉素类似物”是指在结构上与雷帕霉素(西罗莫司)(的类似物)相关的分子。雷帕霉素类似物的实例包括但不限于：坦罗莫司(cci-779)、依维莫司(rad001)、地磷莫司(ap-23573)和佐他莫司(abt-578)。雷帕霉素类似物的一些另外的实例可见于例如wo公开wo 1998/002441和美国专利no.8,455,510，其雷帕霉素类似物通过引用整体并入本文。
[0163]
另外的免疫抑制剂是本领域技术人员已知的，并且本发明不限于此方面。在所提供的任一种方法、组合物或药盒的一些实施方案中，免疫抑制剂可包含如本文中提供的任一种药剂。
[0164]
根据本发明的组合物可包含可药用赋形剂，例如防腐剂、缓冲剂、盐水或磷酸缓冲盐水。可使用常规药物制造和复配技术制备组合物以获得可用的剂型。在一个实施方案中，将组合物与防腐剂一起悬浮在无菌注射用盐水溶液中。
laboratory manual，cold spring harbor press，cold spring harbor，n.y。类似地，产生raav病毒粒子的方法是公知的，并且合适方法的选择不是对本发明的限制。参见例如，k.fisher等，j.virol.，70：520-532(1993)和美国专利no.5,478,745。
[0171]
在一些实施方案中，可以使用三重转染方法(例如，如美国专利no.6,001,650中详细描述的，其涉及三重转染方法的内容通过引用并入本文)来产生重组aav载体。通常来说，通过用待包装入aav颗粒的重组aav载体(包含转基因)、aav辅助功能载体和附属功能载体转染宿主细胞来产生重组aav。一般来说，aav辅助功能载体编码aav辅助功能序列(rep和cap)，其反式地作用于多产的aav复制和衣壳化。优选地，aav辅助功能载体支持高效的aav载体产生，而不产生任何可检出的野生型aav病毒粒子(即，包含功能rep和cap基因的aav病毒粒子)。附属功能载体可以编码用于非aav来源的病毒和/或细胞功能的核苷酸序列，aav依赖于所述功能进行复制。附属功能包括aav复制所需的那些功能，包括但不限于参与aav基因转录激活、阶段特异性aav mrna剪接、aav dna复制、cap表达产物的合成和aav衣壳组装的那些部分。基于病毒的附属功能可以来源于任何已知的辅助病毒，例如腺病毒、疱疹病毒(除了单纯疱疹病毒1型)和痘苗病毒。
[0172]
可以使用本领域已知的许多方法中的任一种来产生慢病毒载体。慢病毒载体和/或其制备方法的实例可见于例如美国公开no.20150224209、20150203870、20140335607、20140248306、20090148936和20080254008，这样的慢病毒载体和制备方法通过引用并入本文。例如，当慢病毒载体不具有整合能力时，慢病毒基因组还包含复制起点(ori)，其序列取决于在其中必须表达慢病毒基因组的细胞的性质。所述复制起点可以来自真核起源，优选哺乳动物起源，最优选人起源。由于慢病毒基因组没有整合到细胞宿主基因组中(由于整合酶缺陷)，因此慢病毒基因组可能会在经历频繁细胞分裂的细胞中丢失；在免疫细胞(例如b或t细胞)中尤其如此。在一些情况下，复制起点的存在可能是有益的。在通过所述质粒或通过其他方法转染合适的细胞(例如293t细胞)之后，可以产生载体颗粒。在用于表达慢病毒颗粒的细胞中，所有或一些质粒可用于稳定表达其编码多核苷酸，或瞬时或半稳定表达其编码多核苷酸。
[0173]
用于产生如本文中提供的其他病毒载体的方法是本领域已知的，并且可与以上示例性方法相似。此外，病毒载体可商购获得。
[0174]
在一些实施方案中，当制备包含免疫抑制剂的某些合成纳米载体时，用于将免疫抑制剂连接至合成纳米载体的方法可能是有用的。
[0175]
在某些实施方案中，连接可以是共价接头。在一些实施方案中，根据本发明的免疫抑制剂可以通过由叠氮化物基团与包含炔基团的免疫抑制剂的1，3-偶极环加成反应或通过炔与包含叠氮化物基团的免疫抑制剂的1，3-偶极环加成反应所形成的1，2，3-三唑接头共价连接至外表面。这样的环加成反应优选在cu(i)催化剂以及合适的cu(i)-配体和还原剂的存在下进行以将cu(ii)化合物还原为催化活性cu(i)化合物。这种cu(i)催化的叠氮化物-炔环加成(cu(i)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition，cuaac)也可以称为点击反应。
[0176]
另外，共价偶联可包含共价接头，包括酰胺接头、二硫接头、硫醚接头、腙接头、酰肼接头、亚胺或肟接头、脲或硫脲接头、脒接头、胺接头和磺酰胺接头。
[0177]
酰胺接头通过一种组分(例如免疫抑制剂)上的胺与第二组分(例如纳米载体)上
的羧酸基团之间的酰胺键来形成。接头中的酰胺键可以使用任何常规的酰胺键形成反应用适当保护的氨基酸和活化羧酸(例如n-羟基琥珀酰亚胺活化的酯)来制备。
[0178]
二硫接头通过在例如r1-s-s-r2形式的两个硫原子之间形成二硫(s-s)键来制备。二硫键可以通过包含巯基/硫醇基团(-sh)的组分与另一活化的巯基或者包含巯基/硫醇基团的组分与包含活化巯基的组分的巯基交换而形成。
[0179]
三唑接头(特别是其中r1和r2可以是任何化学实体的形式的1，2，3-三唑)通过连接到第一组分的叠氮化物与连接到第二组分(例如免疫抑制剂)的末端炔的1，3-偶极环加成反应来制备。1，3-偶极环加成反应在具有或不具有催化剂下(优选具有cu(i)-催化剂下)进行，其通过1，2，3-三唑官能团连接两种组分。该化学由sharpless等，angew.chem.int.ed.41(14)，2596，(2002)和meldal等，chem.rev.，2008，108(8)，2952-3015详细描述，并且通常被称为“点击”反应或cuaac。
[0180]
硫醚接头通过形成例如r1-s-r2形式的硫-碳(硫醚)键来制备。硫醚可以通过用第二组分上的烷基化基团(例如卤化物或环氧化物)使一种组分上的巯基/硫醇(-sh)基团烷基化来制备。硫醚接头也可以通过一种组分上的巯基/硫醇基团与包含作为迈克尔受体的马来酰亚胺基团或乙烯基砜基团的第二组分上的缺电子烯基团的迈克尔加成(michael addition)形成。在另一种方式中，硫醚接头可以通过一种组分上的巯基/硫醇基团与第二组分上的烯基的自由基巯基-烯反应来制备。
[0181]
腙接头通过一种组分上的酰肼基团与第二组分上的醛/酮基团的反应来制备。
[0182]
酰肼接头通过一种组分上的肼基团与第二组分上的羧酸基团的反应形成。这样的反应通常使用类似于形成酰胺键的化学进行，其中羧酸用活化试剂活化。
[0183]
亚胺或肟接头通过一种组分上的胺或n-烷氧基胺(或氨氧基)基团与第二组分上的醛基或酮基的反应形成。
[0184]
脲或硫脲接头通过一种组分上的胺基与第二组分上的异氰酸酯或硫代异氰酸酯基团的反应来制备。
[0185]
脒接头通过一种组分上的胺基与第二组分上的酰亚胺酯基团的反应来制备。
[0186]
胺接头通过一种组分上的胺基与第二组分上的烷基化基团(例如卤化物、环氧化物或磺酸酯基)的烷基化反应来制备。或者，胺接头也可以通过用合适的还原剂(例如氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠)将一种组分上的胺基与第二组分上的醛基或酮基还原胺化来制备。
[0187]
磺酰胺接头通过一种组分上的胺基与第二组分上的磺酰卤(例如磺酰氯)基团的反应来制备。
[0188]
砜接头通过亲核试剂与乙烯基砜的迈克尔加成制备。乙烯基砜或亲核试剂可以在纳米载体的表面上或与组分连接。
[0189]
组分也可以通过非共价缀合方法缀合。例如，带负电荷的免疫抑制剂可以通过静电吸附与带正电荷的组分缀合。包含金属配体的组分也可以通过金属-配体配合物与金属配合物缀合。
[0190]
在一些实施方案中，在组装合成纳米载体之前，组分可以与聚合物(例如聚乳酸-嵌段-聚乙二醇)连接，或者合成纳米载体可以在其表面上形成具有反应性或可活化基团。在后一种情况下，组分可以制备有与合成纳米载体的表面所呈递的连接化学物质相容的基团。在另一些实施方案中，可以使用合适的接头使肽组分与vlp或脂质体连接。接头是能够使两个分子偶联在一起的化合物或试剂。在一个实施方案中，接头可以是如hermanson 2008中所述的同双官能或异双官能试剂。例如，可以在edc的存在下用同双官能接头己二酸二酰肼(adh)处理表面上包含羧基的vlp或脂质体合成纳米载体，以形成具有adh接头的相应合成纳米载体。然后使所得的adh连接的合成纳米载体通过纳米载体上的adh接头的另一端与包含酸基团的肽组分缀合，以产生相应的vlp或脂质体肽缀合物。
[0191]
在一些实施方案中，制备了在聚合物链末端包含叠氮化物或炔基团的聚合物。然后以多个炔或叠氮化物基团位于纳米载体表面的方式用该聚合物制备合成纳米载体。或者，合成纳米载体可以通过其他途径制备，并且随后用炔或叠氮化物基团官能化。在炔(如果聚合物包含叠氮化物)或叠氮化物(如果聚合物包含炔)基团的存在下制备组分。然后使组分在有或者没有催化剂的情况下通过1，3-偶极环加成反应与纳米载体反应，所述催化剂通过1，4-二取代的1，2，3-三唑接头使组分与颗粒共价连接。
[0192]
如果组分是小分子，则在组装合成纳米载体之前使组分与聚合物连接可能是有利的。在一些实施方案中，还可能有利的是制备具有表面基团的合成纳米载体，其用于通过使用这些表面基团使组分与合成纳米载体连接，而不是使组分与聚合物连接然后在合成纳米载体的构建中使用该聚合物缀合物。
[0193]
对于可用的缀合方法的详细描述，参见hermanson g t“bioconjugate techniques”，第二版，academic press，inc.出版，2008。除了共价连接之外，组分可以通过吸附连接至预先形成的合成纳米载体，或者其可以在形成合成纳米载体期间通过包封连接。
[0194]
可使用本领域中已知的广泛多种方法制备合成纳米载体。例如，合成纳米载体可通过例如以下的方法形成：纳米沉淀、使用流体通道的流聚焦、喷雾干燥、单和双乳液溶剂蒸发、溶剂萃取、相分离、研磨、微乳化操作、微米制造、纳米制造、牺牲层、简单和复杂的凝聚、以及本领域普通技术人员公知的其他方法。作为替代或补充，已经描述了用于单分散半导体、传导性、磁性、有机和其他纳米材料的水性和有机溶剂合成(pellegrino等，2005，small，1：48；murray等，2000，ann.rev.mat.sci.，30：545；和trindade等，2001，chem.mat.，13：3843)。文献中已经描述了另外的方法(参见例如doubrow编辑，“microcapsules and nanoparticles in medicine and pharmacy，”crc press，boca raton，1992；mathiowitz等，1987，j.control.release，5：13；mathiowitz等，1987，reactive polymers，6：275；和mathiowitz等，1988，j.appl.polymer sci.，35：755；美国专利5578325和6007845；p.paolicelli等，“surface-modified plga-based nanoparticles that can efficiently associate and deliver virus-like particles”nanomedicine.5(6)：843-853(2010))。
[0195]
可使用多种方法如所期望地将物质包封到合成纳米载体中，所述方法包括但不限于：c.astete等，“synthesis and characterization of plga nanoparticles”j.biomater.sci.polymer edn，第17卷，第3期，第247-289页(2006)；k.avgoustakis“pegylated poly(lactide)and poly(lactide-co-glycolide)nanoparticles：preparation，properties and possible applications in drug delivery”current drug delivery 1：321-333(2004)；c.reis等，“nanoencapsulation i.methods for preparation of drug-loaded polymeric nanoparticles”nanomedicine 2：8-21(2006)；p.paolicelli等，“surface-modified plga-based nanoparticles that can efficiently associate and deliver virus-like particles”nanomedicine.5(6)：843-853(2010)。可使用适合于将物质包封到合成纳米载体中的其他方法，包括但不限于2003年10月14日授予unger的美国专利6,632,671中公开的方法。
[0196]
在某些实施方案中，合成纳米载体通过纳米沉淀法或喷雾干燥制备。可改变用于制备合成纳米载体的条件以产生期望尺寸或特性(例如，疏水性、亲水性、外部形态、“黏性”、形状等)的颗粒。制备合成纳米载体的方法和使用的条件(例如，溶剂、温度、浓度、空气流量等)可取决于待与合成纳米载体连接的物质和/或聚合物基质的组成。
[0197]
如果通过任何上述方法制备的合成纳米载体的尺寸范围在所期望范围之外，则可以例如使用筛子对合成纳米载体的尺寸进行调整。
[0198]
合成纳米载体的要素可以例如通过一个或更多个共价键与整个合成纳米载体连接，或者可以通过一个或更多个接头连接。合成纳米载体官能化的其他方法可以修改自saltzman等的公开的美国专利申请2006/0002852、desimone等的公开的美国专利申请2009/0028910或murthy等的公开的国际专利申请wo/2008/127532a1。
[0199]
作为替代或补充，合成纳米载体可以通过非共价相互作用直接或间接地连接至组分。在一些非共价实施方案中，非共价连接由非共价相互作用介导，所述非共价相互作用包括但不限于电荷相互作用、亲和相互作用、金属配位、物理吸附、主客体相互作用、疏水相互作用、tt堆积相互作用、氢键键合相互作用、范德华相互作用、磁性相互作用、静电相互作用、偶极-偶极相互作用、和/或其组合。这样的连接可布置在合成纳米载体的外表面或内表面上。在一些实施方案中，包封和/或吸收是连接形式。
[0200]
本文中提供的组合物可包含无机或有机缓冲剂(例如，磷酸、碳酸、乙酸或柠檬酸的钠盐或钾盐)和ph调节剂(例如，盐酸、氢氧化钠或氢氧化钾、柠檬酸盐或乙酸盐、氨基酸及其盐)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、α-生育酚)、表面活性剂(例如，聚山梨酯20、聚山梨酯80、聚氧乙烯9-10壬基酚、脱氧胆酸钠)、溶液和/或冷冻/冻干稳定剂(例如，蔗糖、乳糖、甘露糖醇、海藻糖)、渗透调节剂(例如，盐或糖)、抗菌剂(例如，苯甲酸、酚、庆大霉素)、消泡剂(例如，聚二甲基硅氧烷(polydimethylsilozone))、防腐剂(例如，硫柳汞、2-苯氧基乙醇、edta)、聚合物稳定剂和黏度调节剂(例如，聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆488、羧甲基纤维素)和共溶剂(例如，甘油、聚乙二醇、乙醇)。
[0201]
根据本发明的组合物可以包含可药用赋形剂。可使用常规药物制造和复配技术制备组合物以获得可用的剂型。适用于实施本发明的技术可见于handbook of industrial mixing：science and practice，edward l.paul编辑，victor a.atiemo-obeng和suzanne m.kresta，2004 john wiley&sons，inc.；和pharmaceutics：the science of dosage form design，第2版.m.e.auten编辑，2001，churchill livingstone。在一个实施方案中，将组合物与防腐剂悬浮在无菌注射用盐水溶液中。
[0202]
应理解，本发明的组合物可以以任何合适的方式制备，并且本发明决不限于可以
使用本文中所述的方法产生的组合物。选择合适的制造方法可能需要注意相关的特定部分的特性。
[0203]
在一些实施方案中，组合物在无菌条件下制备或者在最终进行灭菌。这可以确保所得组合物是无菌且非感染性的，因此当与非无菌组合物相比时提高安全性。这提供了有价值的安全措施，尤其是当接受组合物的对象具有免疫缺陷、患有感染和/或易感于感染时。
[0204]
根据本发明的施用可以通过多种途径，包括但不限于皮下、鼻内、经口、静脉内、腹膜内、肌内、经黏膜、经黏膜、舌下、经直肠、经眼、经肺、皮内、经皮(transdermal)、经皮肤(transcutaneous)或皮内或通过这些途径的组合。施用途径还包括通过吸入或肺气雾剂施用。制备气雾剂递送系统的技术是本领域技术人员公知的(参见，例如，sciarra和cutie，“aerosols，”于reminaton’s pharmaceutical sciences，第18版，1990，第1694-1712页；通过引用并入)。在一些实施方案中，病毒转移载体、包含免疫抑制剂的纳米载体和皮质类固醇通过相同途径(例如，静脉内)施用。在另一个实施方案中，病毒转移载体和包含免疫抑制剂的纳米载体通过与皮质类固醇不同的途径施用。例如，病毒转移载体和包含免疫抑制剂的纳米载体可以静脉内施用，而皮质类固醇可以经口施用。可以制造和制备本文中提及的组合物用于使用常规方法施用，例如伴随施用。
[0205]
本发明的组合物可以以有效量(例如本文中其他地方描述的有效量)施用。在一些实施方案中，病毒转移载体和/或包含免疫抑制剂的合成纳米载体和/或皮质类固醇以有效减弱抗病毒转移载体免疫应答(例如igg和/或igm应答)和/或允许将病毒转移载体再施用于对象和/或提高病毒转移载体的转基因表达的量的剂型存在。剂型可以以多种频率施用。在一些实施方案中，将病毒转移载体与包含免疫抑制剂的合成纳米载体以及皮质类固醇一起重复施用。在更优选的实施方案中，使用本发明组合物(例如，病毒转移载体、包含免疫抑制剂的纳米载体和皮质类固醇)的至少两次施用、至少三次施用、至少四次施用或至少五次施用。在一些实施方案中，皮质类固醇与病毒转移载体和包含免疫抑制剂的纳米载体同时施用。
[0206]
本发明的一些方面涉及确定用于本文中提供的施用方法的方案。可以通过至少改变病毒转移载体、包含免疫抑制剂的合成纳米载体和/或皮质类固醇的频率、剂量并随后评估期望或不期望的免疫应答来确定方案。用于实施本发明的优选方案减弱针对病毒转移载体的免疫应答(例如igg和/或igm应答)和/或减弱针对病毒转移载体的另一种不期望的免疫应答和/或提高转基因表达。在一些实施方案中，所述方案可至少包括病毒转移载体、包含免疫抑制剂的合成纳米载体以及皮质类固醇的施用频率和剂量。
[0207]
本公开内容的另一个方面涉及药盒。在一些实施方案中，药盒包含本文中提供的任一种或更多种组合物或本文中提供的组合物的任一种组合。在一些实施方案中，药盒包含含有病毒转移载体的一种或更多种组合物和/或含有包含免疫抑制剂的合成纳米载体的一种或更多种组合物和/或含有皮质类固醇的一种或更多种组合物。优选地，组合物是提供本文中提供的任一种或更多种剂量的量。组合物可在药盒中的一个容器中或多于一个容器中。在所提供的任一种药盒的一些实施方案中，容器是小瓶或安瓿。在所提供的任一种药盒的一些实施方案中，组合物各自以冻干形式在单独的容器中或在同一容器中，使得其可在随后的时间重构。在所提供的任一种药盒的一些实施方案中，药盒还包含用于重构、混合、
施用等的说明书。在所提供的任一种药盒的一些实施方案中，说明书包含本文中所述的任一种方法的描述。说明书可以是任何合适的形式，例如印刷插页或标签。在本文中提供的任一种药盒的一些实施方案中，药盒还包含一个或更多个注射器或者可将组合物体内递送至对象的其他装置。
[0208]
实施例
[0209]
为了更充分地理解本文所述的发明，提出以下实施例。提供本技术中描述的实施例以举例说明本文提供的系统和方法，并且不应以任何方式将其解释为限制它们的范围。
[0210]
实施例1：包含免疫抑制剂的合成纳米载体
[0211]
包含免疫抑制剂(例如雷帕霉素或雷帕霉素类似物)的合成纳米载体可以使用本领域普通技术人员已知的任何方法来制备。优选地，在本文中提供的任一种方法、组合物或药盒的一些实施方案中，包含免疫抑制剂的合成纳米载体通过美国公开no.us 2016/0128986 a1和美国公开no.us 2016/0128987 a1中的任一种方法制备，所描述的这样的产生的方法和所得合成纳米载体通过引用整体并入本义。在本文中提供的任一种方法、组合物或药盒中，包含免疫抑制剂的合成纳米载体是这样并入的合成纳米载体。
[0212]
在本文提供的任何一种方法或组合物中，包含免疫抑制剂的合成纳米载体是这样并入的合成纳米载体。immtor，生物可降解的pla pla-peg纳米粒包封雷帕霉素，是指这样的合成纳米载体的实例(kishimoto tk，maldonado ra.nanoparticles for the induction of antigen-specific immunological tolerance.front immunol.2018；9：230.sands e，kivitz aj，dehaan w，et al.update of sel-212 phase 2 clinical data in symptomatic gout patients：svp-rapamycin combined with pegadricase mitigates immunogenicity and enables sustained reduction of serum uric acid levels，low rate of gout flares and monthly dosing.海报展示于：2018年美国风湿病学院/生殖健康专业人员协会(american college of rheumatology/association of reproductive health professionals，acr/arhp)年会；october 19-24，chicago，il。海报#2254)。
[0213]
包含雷帕霉素或雷帕霉素类似物的合成纳米载体用至少类似于这些并入方法的方法产生并用于以下实施例。
[0214]
实施例2：通过单次或多次注射纳米粒包封的雷帕霉素和全身性地塞米松的组合协同增强体内aav驱动的转基因表达。
[0215]
将三组c57bl/6雌性小鼠(每组6只小鼠)在第0天和第56天注射(r.o.)1
×
10
10
vg的aav8-seap(不含任何纳米粒(一组)或含有100μg雷帕霉素下的immtor
tm
(包含雷帕霉素的合成纳米载体，例如实施例1中产生的那些；两组))。在前两组中，一组未经处理并且另一组在注射第0天和第56天用全身性地塞米松处理(i.p.，每次注射100μl中的200μg)。
[0216]
在图1a和1b中指示的时间(第14、35、49、63和71天或第13、19、33、48、62和69天)，对小鼠进行放血，从全血中分离血清，并储存在-20
±
5℃下直至分析。使用来自thermofisher scientific(waltham，ma，usa)的测定试剂盒测量血清中的seap水平。简而言之，将血清样品和阳性对照在稀释缓冲液中稀释，在65℃下孵育30分钟，然后冷却至室温，并接种到96孔形式中。然后，添加测定缓冲液(5分钟)和底物(20分钟)，并将板在照度计(477nm)上读数。
[0217]
将该实验重复两次，结果相似(图1a和1b)。未处理组与仅用immtor
tm
(包含雷帕霉素的合成纳米载体)处理的组之间的初始seap表达水平(分别为图1a和1b中的d13和d14)存在直接差异。然而，在另外用地塞米松处理的组中观察到了强得多的差异，差异随后变得更加显著(分别在图1a和1b中的d48和d49)，在那时单独的immtor
tm
的作用已消退。在第56天加强之后观察到类似的作用，因为用与全身性地塞米松组合的immtor
tm
处理的小鼠中的seap表达水平显示出seap表达为未经处理小鼠的约2倍高，而单独的immtor
tm
的作用更温和(高50％至70％)。
[0218]
这保证了一系列进一步的研究，其中将四组c57bl/6雌性小鼠(每组6只小鼠)在第0、56和140或147天注射(r.o.)1
×
10
10
vg的aav8-seap(不含任何纳米粒(两组)或含有100μg雷帕霉素下的immtor
tm
(包含雷帕霉素的合成纳米载体；两组)。在两组(未经处理或用immtor
tm
处理)中，一组未接受任何另外的处理，而另一组在注射第0、56和140或147天另外用全身性地塞米松(i.p.，每次注射100μl中的200μg)处理。在如图2a和2b指示的时间(第13、20、49、62、69、76、142、154、161182和196天或第13、20、48、62、69、77、104、146、153和174天)对小鼠进行放血并如上所述分析血清用于seap表达。
[0219]
将该实验重复两次，结果相似(图2a和2b)。同样，未经处理组和用immtor
tm
处理的组之间的初始seap表达(d13)存在直接差异，在另外地用地塞米松处理的组中观察到更大的差异，差异随后(d48/d49)变得更加显著，那时单独的immtor
tm
的作用已消退。在第56天加强之后观察到类似的作用。单独的地塞米松也提供了改善的seap表达，但它小于或等于单独immtor
tm
的组，并且不如由immtor
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和地塞米松的组合提供的seap表达。这在d140(图2a)或d147(图2b)的第二次加强之后变得甚至更加显著，在该点可以看到用单独地塞米松的适度益处(与未经处理相比10％至80％)并且用单独immtor
tm
表现出更强的作用(与未经处理相比40％至110％)。引人注目的是，在该点immtor
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和地塞米松的组合提供了更高的seap表达水平，并且这种作用通常是协同的：用与全身性地塞米松组合的immtor
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处理的组的seap水平升高高于用单独的immtor
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和地塞米松处理达到的升高的和，例如图2a中d196115％vs.53％或图2b中231％vs.176％。总的来说，在第二次加强之后用immtor
tm
和地塞米松组合处理的组中观察到seap表达是与未经处理的小鼠的2.1至3.3倍高。
[0220]
实施例3：通过纳米粒包封的雷帕霉素(immtor
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)和全身性地塞米松的组合协同降低针对aav的igm和igg。
[0221]
在与实施例2相同系列的研究中，如下使用elisa测量针对aav的igm和igg抗体：将96孔板用aav包被过夜，在第二天洗涤并封闭。然后，将稀释的血清样品(1∶40)添加至板并孵育；洗涤板，并添加驴抗小鼠igm或山羊抗小鼠igg特异性hrp。在另一次孵育和洗涤之后，通过添加tmb底物并在450nm的吸光度(570nm的参考波长)下测量来检测针对aav的igm或igg抗体的存在(信号强度表示为最高光密度，od，与样品中igm/igg抗体的量成正比)。
[0222]
如前所示，与aav共施用的immtor
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抑制了aav igm的早期诱导并延迟了其出现，尤其是在初免之后(图3)。然而，这在d56加强之后不太显著，导致在d63至d106间隔期间仅用immtor
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处理的组中的显著igm升高。同时，在用immtor
tm
和全身性地塞米松处理的组中的igm产生表现出甚至更强和统计学上更显著的igm应答抑制，甚至在d56加强之前其比仅用immtor
tm
处理的组更低(图3)。
[0223]
这也转化为低得多的igg转化率(图4)。同样，如前面所示，immtor
tm
与aav共施用抑
制了aav igg的早期诱导并延迟了其出现，尽管在d56加强之前和特别是在d56加强之后看到了一些突破，导致到d104该组中6只小鼠中有4只成为igg阳性。同时，直到d104，在用immtortm和全身性地塞米松处理的组中没有一个igg转化(图4)。
[0224]
实施例4：通过与全身性地塞米松组合的纳米粒包封的雷帕霉素(immtor
tm
)的协同作用降低对多次施用aav载体的长期igm免疫应答。
[0225]
将四组c57bl/6雌性小鼠(每组6只小鼠)在第0、56和147天注射(i.v.，眶后神经丛)3次1
×
10
10
vg(d0和56)或2
×
10
10
vg(d147)的aav8-seap(不含immtor
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纳米粒(两组)或含有100μg(d0和56)或200μg(d147)的雷帕霉素下的immtor
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纳米粒(两组))。在成对的组中，将一组在aav和immtor
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注射时(第0、56、147天)另外地用全身性地塞米松(i.p.，200μg)处理。总的来说，将研究中的一组用单独aav8处理，一组用与immtor
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组合的aav8处理，一组用与全身性地塞米松组合的aav8处理，还有一组用与immtor
tm
和全身性地塞米松(dex)二者组合的aav8处理。
[0226]
在图5a所指示的时间(第6、13、20、34、49、62、69、76、90、104、142、154、161、168、182、196和231天)，对小鼠进行放血，从全血中分离血清并储存在-20
±
5℃下直到分析。然后，如下用elisa测量针对aav的igm抗体：将96孔板用aav包被过夜，然后在第二天洗涤并封闭。将经稀释的血清样品(1∶40)添加至板并孵育，洗涤板，添加驴抗小鼠igm特异性hrp，并且在另一次孵育和洗涤之后，通过添加tmb底物并在450nm的吸光度(570nm的参考波长)下测量来检测针对aav的igm抗体的存在(信号强度表示为最高光密度，od，与样品中igm抗体的量成正比)。
[0227]
如前所示，与aav共施用的immtor
tm
纳米粒抑制了aav igm的早期诱导并延迟了其出现，尤其是在初免之后。然而，这在d56和d147加强(由箭头指示)之后不太显著，尤其是在第3次aav施用(d147)之后，导致仅用immtor
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纳米粒处理的组中显著的igm升高(图5a)。同时，用immtor
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纳米粒和全身性地塞米松处理的组中igm的产生表现出更强且统计学上更显著的igm应答抑制，其低于仅用immtor
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纳米粒处理的组，并且在第56天和第147天重复aav施用之后变得统计学显著，在最后一次aav施用之后84天或在第231天显著保持统计学差异(图5b)。
[0228]
注意到到d231时，未用immtor
tm
处理的组中的igm水平相对较低，因为在初始aav施用之后这些组中的igm产生较早(d6和d13)达到峰值，这导致在这些组中高效转换为抗aav igg产生，如实施例5中所示。
[0229]
实施例5：通过纳米粒包封的雷帕霉素(immtor
tm
)和全身性地塞米松的组合诱导较低水平的aav igg突破
[0230]
还通过elisa测量aav igg的存在来测试来自实施例4中所述的研究的血清样品。elisa类似于用于确定igm水平的elisa，不同之处在于使用了山羊抗小鼠igg特异性hrp。如前所示，与aav共施用的immtor
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抑制了大多数实验动物中aav igg的诱导，尽管少数在实验后期开始产生igg(这与该组中延迟的igm动力学相关)。具体而言，在第56天第1次加强之后该组中6只动物中有2只显示出可检测的igg，到第90天(第一次加强之后34天)时6只中有3只呈igg阳性，在第147天第2次加强之后紧接着(7天之后)(即，到第154天)6只中有5只转化，并且到第196天(第2次加强之后51天或第3次aav施用)该组中的所有动物均表明了针对aav的igg的存在。在用immtor
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和地塞米松的组合处理的组中没有确认的igg突破，直到第
231天，这也与如实施例3所示的igm的低水平和瞬时产生及其动力学的更显著延迟相关。这些在存在与地塞米松组合的immtor
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的情况下重复施用aav之后观察到的针对aav的igg的极低水平与在研究整个后期(即第142天至第231天)用仅与immtor
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组合的aav处理的组中观察到的那些的差异显著(0.001＜p＜0.05)。与仅用aav处理的组一样，在用单独地塞米松处理的组中没有igg抑制或延迟。
[0231]
总的来说，虽然单独的immtor
tm
显示出对aav igm/igg延迟和抑制的益处，而单独的地塞米松没有显示出任何一种，但两种处理的组合在aav特异性igm/igg抑制方面要优越得多，尤其是在重复aav施用之后。