一种利用双水相体系分离纯化α-淀粉酶抑制剂的方法与流程

一种利用双水相体系分离纯化
α-淀粉酶抑制剂的方法
技术领域
1.本发明涉及生物领域，具体涉及一种利用双水相体系分离纯化α-淀粉酶抑制剂的方法。


背景技术：

2.α-淀粉酶抑制剂是一种糖苷水解酶抑制剂，在胃肠道中，它能抑制肠胃道内唾液和胰淀粉酶的活性，阻碍或延缓其对食物中主要的碳水化合物淀粉的消化作用，降低食物中淀粉糖类物质的分解吸收，从而起到减低血糖、血脂的作用，抑制血糖浓度的升高。对于肥胖患者，α-淀粉酶抑制剂可减少糖向脂肪转化，延缓肠道的排空，增加脂肪消耗以减少体重。因此，α-淀粉酶抑制剂能够防止和治疗肥胖症、脂肪过多症、动脉硬化症、高血脂及糖尿病等。同时，α-淀粉酶抑制剂可以阻碍或延缓其对食物中主要的碳水化合物淀粉的消化作用，阻止血糖的升高，从而能使糖尿病人吃饱饭，消除饥饿感。这种可以同时达到控制血糖升高和防治肥胖的蛋白质类生物制品在当今社会有很大的科研价值和应用前景。
3.白芸豆α-淀粉酶抑制剂是一种能特异性抑制人体唾液和肠道淀粉酶活力的糖蛋白，能够通过阻碍或延缓淀粉的水解来降低餐后血糖高峰，因而在糖尿病的预防和控制方面有着较好的应用前景。白芸豆是一种短日照植物，春秋两季均可栽培，在我国各省区均有种植，尤其在云南、四川、贵州等省份种植面积较大，一般产量在1020～1125kg/hm2。因此白芸豆α-淀粉酶抑制剂产品的工业化制备有着重大的现实意义和良好的物质基础。
4.目前国外主要采用盐析、离子交换纤维素层析或凝胶层析等分离方法来纯化α-淀粉酶抑制剂，从小麦粉中提取α-淀粉酶抑制剂，比活力可以提高到4.08倍，但活性回收率仅为9.8％；从豆类中提取时活性回收率也只有37％。上述提取方法成本很高，操作周期长，不利于进行工业化放大应用。双水相体系是指某些有机物之间或有机物与无机盐之间，在水中以适当的浓度溶解后形成互不相溶的两相或多相体系，双水相体系萃取分离原理是基于生物物质在双水相体系中的选择性分配。本发明即提供一种利用新型的双水相体系高效的分离纯化α-淀粉酶抑制剂的方法。


技术实现要素：

5.发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种利用双水相体系分离纯化α-淀粉酶抑制剂的方法。
6.为了解决上述技术问题，本发明公开了一种利用双水相体系分离纯化α-淀粉酶抑制剂的方法，即利用含有聚乙二醇和谷氨酸钠的双水相混合体系，从含α-淀粉酶抑制剂的物料中分离纯化α-淀粉酶抑制剂。
7.其中，所述聚乙二醇数均分子量为2000～6000，优选为3000～4000。
8.其中，所述双水相混合体系中，所述聚乙二醇、谷氨酸钠和水的质量比为(15～35):(20～40):(35～50)，优选为25:30:45。
9.其中，所述含α-淀粉酶抑制剂的物料为以芸豆为原料制备的含α-淀粉酶抑制剂的
粗提液。
10.其中，所述以芸豆为原料制备的含α-淀粉酶抑制剂的粗提液的制备方法包括如下步骤：
11.(1)磨粉：将芸豆磨粉，过筛；
12.(2)碱水提取：将芸豆粉与水按质量体积比1g:5ml混合后，用naoh调节混合液ph至9.0，搅拌5小时；
13.(3)离心：将混合液离心取上清液，用hcl调节上清液的ph至4.0；
14.(4)灭酶：将上清液加热到55℃灭酶，然后离心取上清液；
15.(5)超滤：将上清液ph调至7.0，进行超滤，收集截留液，超滤膜的孔径为20kda，截留液即为α-淀粉酶抑制剂粗提液。
16.其中，所述双水相混合体系与含α-淀粉酶抑制剂的物料的质量比为(0.5～2):1，优选(0.5～1.5):1，进一步优选为1:1。
17.其中，将含有聚乙二醇和谷氨酸钠的双水相混合体系与含α-淀粉酶抑制剂的物料混合，静置，收集上层聚乙二醇相；将上层聚乙二醇相稀释后，超滤膜浓缩，所得截留物即为α-淀粉酶抑制剂。
18.其中，所述静置为20～30℃静置10～20min，优选为室温静置15min。
19.其中，所述稀释为将上层聚乙二醇相用水稀释5倍。
20.其中，所述超滤膜的截留分子量为15～25kda，优选为20kda。
21.其中，超滤浓膜缩后的料液通过喷雾干燥，制备得到α-淀粉酶抑制剂粉状产品。
22.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：
23.1、本发明方法能够高效的分离纯化α-淀粉酶抑制剂，α-淀粉酶抑制剂的活力达到2840u/g。
24.2、分相迅速，节省溶媒：使用本发明的聚乙二醇/谷氨酸钠双水相体系萃取α-淀粉酶抑制剂，在15分钟左右即可分相，缩短了整个工艺操作周期。
25.3、工艺操作简单，易于生产放大：本发明将膜分离和喷雾干燥等其它生物分离技术集成，提高产品的收率，为α-淀粉酶抑制剂的产业化打下了基础。
具体实施方式
26.下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
27.下述实施例中所述α-淀粉酶抑制剂酶活的测定方法为：
28.1、实验原理
29.利用淀粉溶液在i-ki作用下显蓝色，在660nm处的吸光值于一定淀粉浓度范围内和淀粉的量呈线性关系的特点，根据抑制剂加入前后α-淀粉酶分解淀粉量的差值即可计算出抑制剂的活性。
30.2、碘呈色法
31.取0.5μl的α-淀粉酶和2μl的α-淀粉酶抑制剂于0.5ml磷酸缓冲液中，在37℃条件下预反应30min后，加入0.5ml的0.04wt％的淀粉水溶液再反应15min，用3.8ml的酸(1体积0.5n的hcl 5体积0.5n乙酸)中止反应，加0.2ml 0.01mol/l的碘液显色，在660nm处测定吸
光值。
32.α-淀粉酶活性定义：在上述条件下(实验条件)将所加淀粉水解50％所需的酶量定义为一个单位。
[0033][0034]b‑‑‑‑‑‑‑‑‑
淀粉吸光值
[0035]r‑‑‑‑‑‑‑‑‑
加入酶吸光值
[0036]
α-淀粉酶抑制剂活性定义：在上述条件下，每ml溶液将2个单位α-淀粉酶活性抑制了50％所需的量为一个单位。
[0037]
通过上述定义得出：
[0038][0039]s‑‑‑‑‑‑‑‑‑
加入α-淀粉酶抑制剂后吸光值
[0040]
实施例1：α-淀粉酶抑制剂粗提液的制备
[0041]
(1)将白芸豆粉碎，过50目筛网，收集过50目筛网的白芸豆粉；
[0042]
(2)取200g步骤(1)所得白芸豆粉与1000ml蒸馏水混合，用2mol/l naoh溶液调节ph至9.0，室温搅拌提取5h，得到混合液；
[0043]
(3)将步骤(2)所得混合液于4℃，9000r/min下离心20min，收集上清液；
[0044]
(4)用2mol/lhcl溶液调节步骤(3)所得上清液ph至4.0，于55℃水浴灭酶20min，9000r/min下离心20min，取上清液；
[0045]
(5)用2mol/l naoh溶液将步骤(4)所得上清液ph调至7.0，用20kd超滤膜进行超滤，收集截留液，即为α-淀粉酶抑制剂粗提液。
[0046]
实施例2
[0047]
将实施例1的α-淀粉酶抑制剂粗提液喷雾干燥，即得粉末状的α-淀粉酶抑制剂产品。将α-淀粉酶抑制剂产品溶于0.1mol/l磷酸盐缓冲液(ph 6.9)中，测定α-淀粉酶抑制剂活力为460u/g。
[0048]
实施例3：双水相纯化α-淀粉酶抑制剂按以下步骤进行：
[0049]
一、配制peg2000/谷氨酸钠双水相，peg2000/谷氨酸钠双水相按重量百分比由25％的聚乙二醇、30％的谷氨酸钠和余量的去离子水组成；
[0050]
二、将实施例1的α-淀粉酶抑制剂粗提液与peg2000/谷氨酸钠双水相以1:1的重量比均匀混合，然后室温静置15min，收集peg2000/谷氨酸钠双水相中的上层液相；
[0051]
三、将收集的peg2000/谷氨酸钠双水相的上层液相用水稀释5倍，再用20kda超滤膜进行超滤，peg2000可以透过膜进行回用，截留物即为纯化的α-淀粉酶抑制剂，酶活收率78.4％；
[0052]
四、将纯化后的液体进行喷雾干燥，即得粉末状的α-淀粉酶抑制剂产品。将α-淀粉酶抑制剂产品溶于0.1mol/l磷酸盐缓冲液(ph 6.9)中，测定α-淀粉酶抑制剂活力为1830u/g。
[0053]
实施例4：双水相纯化α-淀粉酶抑制剂按以下步骤进行：
[0054]
一、配制peg3000/谷氨酸钠双水相，peg3000/谷氨酸钠双水相按重量百分比由
25％的聚乙二醇、30％的谷氨酸钠和余量的去离子水组成；
[0055]
二、将实施例1的α-淀粉酶抑制剂粗提液与peg3000/谷氨酸钠双水相以1:1的重量比均匀混合，然后室温静置15min，收集peg3000/谷氨酸钠双水相中的上层液相；
[0056]
三、将收集的peg3000/谷氨酸钠双水相的上层液相用水稀释5倍，再用20kda超滤膜进行超滤，peg3000可以透过膜进行回用，截留物即为纯化的α-淀粉酶抑制剂，酶活收率92.3％；
[0057]
四、将纯化后的液体进行喷雾干燥，即得粉末状的α-淀粉酶抑制剂产品。将α-淀粉酶抑制剂产品溶于0.1mol/l磷酸盐缓冲液(ph 6.9)中，测定α-淀粉酶抑制剂活力为2840u/g。
[0058]
实施例5：双水相纯化α-淀粉酶抑制剂按以下步骤进行：
[0059]
一、配制peg4000/谷氨酸钠双水相，peg4000/谷氨酸钠双水相按重量百分比由25％的聚乙二醇、30％的谷氨酸钠和余量的去离子水组成；
[0060]
二、将实施例1的α-淀粉酶抑制剂粗提液与peg4000/谷氨酸钠双水相以1:1的重量比均匀混合，然后室温静置15min，收集peg2000/谷氨酸钠双水相中的上层液相；
[0061]
三、将收集的peg4000/谷氨酸钠双水相的上层液相用水稀释5倍，再用20kda超滤膜进行超滤，peg4000可以透过膜进行回用，截留物即为纯化的α-淀粉酶抑制剂，酶活收率88.5％；
[0062]
四、将纯化后的液体进行喷雾干燥，即得粉末状的α-淀粉酶抑制剂产品。将α-淀粉酶抑制剂产品溶于0.1mol/l磷酸盐缓冲液(ph 6.9)中，测定α-淀粉酶抑制剂活力为2320u/g。
[0063]
实施例6：双水相纯化α-淀粉酶抑制剂按以下步骤进行：
[0064]
一、配制peg5000/谷氨酸钠双水相，peg5000/谷氨酸钠双水相按重量百分比由25％的聚乙二醇、30％的谷氨酸钠和余量的去离子水组成；
[0065]
二、将实施例1的α-淀粉酶抑制剂粗提液与peg5000/谷氨酸钠双水相以1:1的重量比均匀混合，然后室温静置15min，收集peg5000/谷氨酸钠双水相中的上层液相；
[0066]
三、将收集的peg5000/谷氨酸钠双水相的上层液相用水稀释5倍，再用20kda超滤膜进行超滤，peg5000可以透过膜进行回用，截留物即为纯化的α-淀粉酶抑制剂，酶活收率82.2％；
[0067]
四、将纯化后的液体进行喷雾干燥，即得粉末状的α-淀粉酶抑制剂产品。将α-淀粉酶抑制剂产品溶于0.1mol/l磷酸盐缓冲液(ph 6.9)中，测定α-淀粉酶抑制剂活力为1960u/g。
[0068]
实施例7：双水相纯化α-淀粉酶抑制剂按以下步骤进行：
[0069]
一、配制peg6000/谷氨酸钠双水相，peg6000/谷氨酸钠双水相按重量百分比由25％的聚乙二醇、30％的谷氨酸钠和余量的去离子水组成；
[0070]
二、将实施例1的α-淀粉酶抑制剂粗提液与peg6000/谷氨酸钠双水相以1:1的重量比均匀混合，然后室温静置15min，收集peg6000/谷氨酸钠双水相中的上层液相；
[0071]
三、将收集的peg6000/谷氨酸钠双水相的上层液相用水稀释5倍，再用20kda超滤膜进行超滤，peg6000可以透过膜进行回用，截留物即为纯化的α-淀粉酶抑制剂，酶活收率59.9％；
[0072]
四、将纯化后的液体进行喷雾干燥，即得粉末状的α-淀粉酶抑制剂产品。将α-淀粉酶抑制剂产品溶于0.1mol/l磷酸盐缓冲液(ph 6.9)中，测定α-淀粉酶抑制剂活力为1480u/g。
[0073]
对比例1：
[0074]
同实施例4，更改peg3000、谷氨酸钠和水的质量百分比，结果如表1。
[0075]
表1
[0076][0077][0078]
对比例2：
[0079]
同实施例4，更改粗提液和双水相体系的比例，结果如表2。
[0080]
表2
[0081][0082]
本发明提供了一种利用双水相体系分离纯化α-淀粉酶抑制剂的方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。