固定化的N-脱氧核糖转移酶和脱氧核苷的制备方法与流程

固定化的n-脱氧核糖转移酶和脱氧核苷的制备方法
技术领域
1.本技术涉及重组酶催化反应技术领域，具体涉及固定化的n-脱氧核糖转移酶和脱氧核苷的制备方法。


背景技术：

[0002]2’‑
脱氧胞苷(2
’‑
deoxycytigine，缩写da)，也称“2
’‑
脱氧核糖胞嘧啶胞苷”，是一种天然的脱氧核糖核苷，作为遗传物质脱氧核糖核酸(dna)的有机组成成分，参与生物机体细胞的遗传信息传递。作为eg5驱动蛋白调节剂，2
’‑
脱氧胞苷具有抗增殖和凋亡诱导活性，因此成为重要的医药中间体，能够用于合成抗癌药物吉西他滨(dfdc)、抗hiv药物扎西他滨(ddc)，以及生化试剂脱氧胞苷-5
’‑
单磷酸(5
’‑
dcmp)等，广泛应用于核酸与基因工程中。随着医药工业与生物技术的长足发展，为了满足原料市场对 2
’‑
脱氧胞苷日益增大的需求，核苷类似物作为抗病毒药物的重要组成部分，需求量也在急剧增加。
[0003]
2006年，moosa等在专利中报道了β-l-2
’‑
脱氧-胞苷的化学合成方法，该方法以保护的呋喃核糖为起始原料，经过与保护的嘧啶缩合，脱保护得到目标产物。但是，文献报道的2
’‑
脱氧胞苷的合成方法均有异构体α-2
’‑
脱氧胞苷的生成，尽管作者优化了合成的方法，然而其产品的α∶β构型物质的量比仅能达到1∶5或1∶6，选择性非常低。
[0004]
近年来出现了通过酶催化制备脱氧核苷的技术。中国专利申请cn105754899a公开了一种n-脱氧核糖转移酶酶法合成脱氧核苷的方法，包括重组n-脱氧核糖转移酶ndt 在重组菌e.coli bl21(de3)的诱导表达与纯化，以及在缓冲液中加入核糖供体和受体，并加入n-脱氧核糖转移酶粗酶液，放入35℃转速180rpm的摇床中反应2h，反应结束后取样加入甲醇中终止反应。然而，该方法中使用的粗酶液含有大量杂酶，其会水解产物从而产生大量杂质，导致最终脱氧核苷产品的纯度较低。
[0005]
本领域仍然需要寻找一种能以高纯度、高转化率和低成本制备脱氧核苷，尤其是2
’‑ꢀ
脱氧胞苷，同时避免产生异构体的方法。


技术实现要素：

[0006]
为解决上述技术问题，本技术的一个方面提供一种固定化的n-脱氧核糖转移酶的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
[0007]
a.获得带亲和标签的n-脱氧核糖转移酶；
[0008]
b.将所述带亲和标签的n-脱氧核糖转移酶与亲和配体接触，以将所述带亲和标签的n-脱氧核糖转移酶固定至所述亲和配体；和
[0009]
c.洗涤所述亲和配体以获得固定化的n-脱氧核糖转移酶。
[0010]
本发明的另一个方面提供了一种脱氧核苷的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
[0011]
a.获得带亲和标签的n-脱氧核糖转移酶；
[0012]
b.将所述带亲和标签的n-脱氧核糖转移酶与亲和配体接触，以将所述带亲和标签
的n-脱氧核糖转移酶固定至所述亲和配体；
[0013]
c.洗涤所述亲和配体以获得固定化的n-脱氧核糖转移酶；
[0014]
d.提供包含脱氧核糖供体和碱基供体的反应组合物；
[0015]
e.将所述固定化的n-脱氧核糖转移酶加入所述反应组合物；和
[0016]
f.获得所述脱氧核苷。
附图说明
[0017]
下面结合附图更详细地说明本技术，附图中：
[0018]
图1是表示用n-脱氧核糖转移酶的粗酶液催化脱氧核糖供体和胞嘧啶生成2
’‑
脱氧胞苷的产物hplc液相谱图；
[0019]
图2是表示用根据本技术的一个实施方式的固定化的n-脱氧核糖转移酶催化脱氧核糖供体和胞嘧啶生成2
’‑
脱氧胞苷的产物hplc液相谱图；
[0020]
图3是显示用根据本技术的一个实施方式的固定化的n-脱氧核糖转移酶在不同固定化酶添加量和不同时间下催化反应的转化率变化的示意图；和
[0021]
图4是显示用根据本技术的一个实施方式的固定化的n-脱氧核糖转移酶催化脱氧核糖供体和胞嘧啶生成2
’‑
脱氧胞苷时，不同摩尔量的胞嘧啶对反应转化率的影响的示意图。
具体实施方式
[0022]
本技术涉及一种固定化的n-脱氧核糖转移酶的制备方法。该方法包括：a.获得带亲和标签的n-脱氧核糖转移酶。在本技术中，n-脱氧核糖转移酶是能催化脱氧核糖供体和碱基供体发生反应以产生脱氧核苷的任何合适的酶，并且带亲和标签的n-脱氧核糖转移酶可通过任意合适的方法获得。在本技术的一个实施方式中，n-脱氧核糖转移酶是来自温泉拟甲色球藻(chroococcidiopsis thermalis)的n-脱氧核糖转移酶。在本技术的一个实施方式中，带亲和标签的n-脱氧核糖转移酶通过发酵过程获得，该发酵过程包括将表达带亲和标签的n-脱氧核糖转移酶的宿主细胞接种至发酵培养基中，诱导蛋白表达并提取，得到含有带亲和标签的n-脱氧核糖转移酶的粗酶液。在本技术的一个实施方式中，宿主细胞是真核细胞。在本技术的一个实施方式中，宿主细胞是原核细胞。在本技术的一个实施方式中，宿主细胞是大肠杆菌细胞。在本技术的一个实施方式中，亲和标签是组氨酸标签。在本技术的一个实施方式中，带亲和标签的n-脱氧核糖转移酶的氨基酸序列如seq id no：2所示。在本技术的一个实施方式中，带亲和标签的n-脱氧核糖转移酶的编码核苷酸序列如seq id no：1所示。在本技术的一个实施方式中，发酵培养基可以是本领域已知的任何合适的培养基。本技术的一个实施方式中，发酵培养基包括tb 液体培养基。
[0023]
该固定化的n-脱氧核糖转移酶的制备方法还包括：b.将所述带亲和标签的n-脱氧核糖转移酶与亲和配体接触，以将所述带亲和标签的n-脱氧核糖转移酶固定至所述亲和配体。在本技术中，“亲和配体”是指能与亲和标签特异性结合的物质。在本技术中，可以使用本领域已知的任何合适的亲和标签与亲和配体对。在本技术的一个实施方式中，亲和标签是组氨酸标签，并且亲和配体是金属亲和配体。在本技术的一个优选实施方式中，金属亲和配体包括镍离子金属螯合介质或钴离子金属螯合介质。在本技术的一个优选实施方式中，
金属亲和配体选自镍离子或钴离子活化的lx-1000ida、seplitelx-1000ida、fp-ida405/eb或ni-ida-sefinose树脂。在本技术的一个实施方式中，该接触步骤包括将带亲和标签的n-脱氧核糖转移酶的粗酶液流过预装有亲和配体的层析柱，使带亲和标签的n-脱氧核糖转移酶吸附在亲和配体上。
[0024]
该固定化的n-脱氧核糖转移酶的制备方法还包括：c.洗涤所述亲和配体以获得固定化的n-脱氧核糖转移酶。在本技术的一个实施方式中，该洗涤步骤包括用洗涤剂洗涤亲和配体以去除未结合的n-脱氧核糖转移酶和粗酶液中的其他杂质。在本技术中，洗涤剂可以是本领域已知的任何适合洗涤亲和配体而不会导致已结合的n-脱氧核糖转移酶脱离的试剂。在本技术中，固定化的n-脱氧核糖转移酶包括n-脱氧核糖转移酶和亲和配体。在本技术的一个实施方式中，固定化的n-脱氧核糖转移酶的酶载量是1-200mg n
‑ꢀ
脱氧核糖转移酶/g亲和配体。在本技术的一个优选实施方式中，固定化的n-脱氧核糖转移酶的酶载量是10-100mg n-脱氧核糖转移酶/g亲和配体。在本技术的一个优选实施方式中，固定化的n-脱氧核糖转移酶的酶载量是30-80mg n-脱氧核糖转移酶/g亲和配体。在本技术的一个优选实施方式中，固定化的n-脱氧核糖转移酶的酶载量是约50mg n
‑ꢀ
脱氧核糖转移酶/g亲和配体。
[0025]
本技术还涉及一种脱氧核苷的制备方法。该方法包括：a.根据前文所述的制备方法获得固定化的n-脱氧核糖转移酶。
[0026]
该脱氧核苷的制备方法还包括：b.提供包含脱氧核糖供体和碱基供体的反应组合物。在本技术的一个实施方式中，脱氧核苷包括2
’‑
脱氧核苷。在本技术的一个优选实施方式中，脱氧核苷包括2
’‑
脱氧胞苷，脱氧核糖供体包括2
’‑
脱氧胸苷、2
’‑
脱氧尿苷或 2
’‑
脱氧腺苷，并且碱基供体包括胞嘧啶。在本技术的一个实施方式中，脱氧核糖供体和碱基供体的摩尔浓度比为1∶2至1∶8。在本技术的一个优选实施方式中，脱氧核糖供体和碱基供体的摩尔浓度比为1∶3至1∶6。在本技术的一个优选实施方式中，脱氧核糖供体和碱基供体的摩尔浓度比为约1∶5。在本技术的一个实施方式中，脱氧核糖供体的浓度为 5-100mg/ml。在本技术的一个优选实施方式中，脱氧核糖供体的浓度为10-50mg/ml。在本技术的一个优选实施方式中，脱氧核糖供体的浓度为约24mg/ml。在本技术的一个实施方式中，碱基供体的浓度为10-200mg/ml。在本技术的一个优选实施方式中，碱基供体的浓度为20-100mg/ml。在本技术的一个优选实施方式中，碱基供体的浓度为约 55.5mg/ml。在本技术的一个实施方式中，反应组合物包括：脱氧核糖供体，其浓度为 5-100mg/ml；碱基供体，其浓度为10-200mg/ml；和缓冲液，其ph为6.0-8.0。在本技术的一个优选实施方式中，脱氧核糖供体的浓度为约10-50mg/ml。在本技术的一个优选实施方式中，脱氧核糖供体的浓度为约100mg/ml。在本技术的一个优选实施方式中，碱基供体的浓度为40-200mg/ml。在本技术的一个优选实施方式中，碱基供体的浓度为约200mg/ml。在本技术中，缓冲剂是适合脱氧核糖供体与碱基供体在其中发生反应的任何缓冲剂。在本技术的一个优选实施方式中，缓冲剂的ph为6.5-7.5。在本技术的一个优选实施方式中，缓冲剂的ph为约7.0。在本技术的一个优选实施方式中，缓冲剂包括磷酸盐缓冲液。
[0027]
该脱氧核苷的制备方法还包括：c.将所述固定化的n-脱氧核糖转移酶加入所述反应组合物。在本技术的一个实施方式中，该步骤中加入的所述固定化的n-脱氧核糖转移酶的量为1-100mg/ml。在本技术的一个优选实施方式中，该步骤中加入的所述固定化的n-脱
氧核糖转移酶的量为1.5-70mg/ml。在本技术的一个优选实施方式中，该步骤中加入的所述固定化的n-脱氧核糖转移酶的量为约2.5-60mg/ml。在本技术的一个优选实施方式中，该步骤中加入的所述固定化n-脱氧核糖转移酶的量为2.5-50mg/ml。在本技术的一个优选实施方式中，该步骤中加入的所述固定化的n-脱氧核糖转移酶的量为 2.5-40mg/ml。在本技术的一个优选实施方式中，该步骤中加入的所述固定化的n-脱氧核糖转移酶的量为2.5-10mg/ml。在本技术的一个优选实施方式中，该步骤中加入的所述固定化的n-脱氧核糖转移酶的量为约2.5mg/ml。在本技术的一个实施方式中，该步骤中的反应温度为25-70℃。在本技术的一个优选实施方式中，该步骤中的反应温度为 50-60℃。在本技术的一个优选实施方式中，该步骤中的反应温度为约60℃。在本技术的一个实施方式中，该步骤中的反应时间为1-20小时。在本技术的一个优选实施方式中，该步骤中的反应时间为4-20小时。在本技术的一个优选实施方式中，该步骤中的反应时间为约20小时。
[0028]
该脱氧核苷的制备方法还包括：d.获得所述脱氧核苷。在本技术中，该步骤可采用任何合适的分离技术。在本技术的一个实施方式中，该步骤包括通过滤膜过滤以去除不溶物。在本技术的另一个实施方式中，该步骤包括离心以去除不溶物。
[0029]
下面将结合附图对本技术的技术方案进行清楚、完整的表述，显然，所描述的实施例是本技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例都属于本技术保护的范围。
[0030]
实验材料
[0031]
重组大肠杆菌菌株：大肠杆菌bl21(de3)/pet-28a( )，其含有包含经密码子优化的 ndt-b2基因序列(seq id no：1)的表达质粒(购买自novagen，产品编号：69864-3cn)。
[0032]
金属亲和配体层析柱：ni离子活化的ni-ida-sefinose树脂(购买自上海生工生物，产品编号：c600813)。
[0033]
tb液体培养基，其含有：12g/l的蛋白胨，24g/l的酵母粉，4g/l的甘油，2.31g/l 的kh2po4和16.43g/l的k2hpo4·
3h2o。
[0034]
磷酸盐缓冲液(50mm)，其配制方法为：分别称量k2hpo4·
3h2o：5.57g，kh2po4： 2.65g，加入800ml超纯水使其充分溶解，加入hcl调节溶液ph为7.0，最后加入超纯水定容至1l。
[0035]
磷酸盐(2mm)缓冲液(ph 7.0)：分别称量k2hpo4·
3h2o：0.23g，kh2po4：0.11g，加入800ml超纯水使其充分溶解，加入hcl调节溶液ph为7.0，最后加入超纯水定容至1l。
[0036]
hplc检测方法：流动相为15％乙腈/水，检测波长为254nm，检测时间为3min。
[0037][0038]
实施例1
[0039]
(1)制备n-脱氧核糖转移酶粗酶液
[0040]
将重组大肠杆菌菌株接种至tb液体培养基中，经iptg诱导蛋白表达发酵后，将培养的菌液使用离心机4000rpm离心30min，收集发酵菌体，该发酵菌体即为含有带组氨酸标签的n-脱氧核糖转移酶的重组大肠杆菌菌体，用2mm ph 7.0磷酸盐缓冲液将收集的菌体重悬，将重悬菌体放置在冰水浴中，用超声波细胞粉碎机进行细胞破碎，条件为200w，超声3s，间隔5s，共30min。离心收集上清液即为含n-脱氧核糖转移酶的粗酶液。
[0041]
(2)制备固定化的n-脱氧核糖转移酶
[0042]
将得到的粗酶液作为上柱液流过预装有金属亲和配体层析柱，使带组氨酸标签的 n-脱氧核糖转移酶固定在金属亲和配体上。
[0043]
(3)酶载量的测定
[0044]
称取2
’‑
脱氧胸苷(200mm)和胞嘧啶(200mm)，加入反应体系，加入2ml ph7.0 磷酸盐缓冲液(50mm)缓冲液搅拌混匀，调整反应液温度至60℃。加入由步骤(1)制备的粗酶液1ml(蛋白浓度2.5mg/ml：由bradford蛋白浓度测定试剂盒，按照产品使用说明书测定)，反应5分钟后，取样经过hplc，测定粗酶液的转化率(con(粗酶液)) 为14.3％；
[0045]
转化率的计算方法如下：
[0046]
con＝a/(a b)*100，其中a＝产物的峰面积；b＝原料的峰面积
[0047]
同样的方法，称取2
’‑
脱氧胸苷(200mm)和胞嘧啶(200mm)，加入反应体系，加入2ml ph7.0磷酸盐缓冲液(50mm)缓冲液搅拌混匀，调整反应液温度至60℃。加入由步骤(2)制备的固定化的n-脱氧核糖转移酶10mg(电子天平称重)，反应5分钟后，取样经过hplc，测定固定化酶的转化率(con(固定化酶))为3.2％；
[0048]
由此计算固定化酶的载量为δ＝con(粗酶液)/con(固定化酶)*10＝50。在此，该数值表示每10mg亲和配体上加载0.5mg的酶，即酶载量＝50mg n-脱氧核糖转移酶/g亲和配体。
[0049]
实施例2
[0050]
比较n-脱氧核糖转移酶粗酶液和固定化的n-脱氧核糖转移酶催化相同底物后生成的产物成分
[0051]
称量2
’‑
脱氧胸苷(200mm)和胞嘧啶(200mm)，加入反应体系，加入2ml ph7.0 磷酸盐缓冲液(50mm)缓冲液搅拌混匀，调整反应液温度至60℃，加入2ml由实施例1 的步骤(1)得到的n-脱氧核糖转移酶粗酶液，60℃搅拌反应20h，得到n-脱氧核糖转移酶催化反应液。将反应液放置在100℃中，热处理10min后，将1ml样品离心(12000rpm，2min)。取离心上清液200μl，加入1ml ph7.0磷酸盐缓冲液(50mm)，充分混匀后，样品过滤膜，用高效液相色谱仪(hplc)对反应混合液的成分进行检测，结果显示，反应20h后，产物中出现了尿嘧啶及杂质峰(图1)。
[0052]
称量2
’‑
脱氧胸苷(200mm)和胞嘧啶(200mm)，加入反应体系，加入4ml ph7.0 磷酸盐缓冲液(50mm)缓冲液搅拌混匀，调整反应液温度至60℃，加入50mg由实施例1 的步骤(2)得到的固定化的n-脱氧核糖转移酶，60℃搅拌反应20h，得到n-脱氧核糖转移酶催化反应液。将反应液放置在100℃中，热处理10min后，将1ml样品离心 (12000rpm，2min)。取离心上清液200μl，加入1ml ph7.0磷酸盐缓冲液(50mm)，充分混匀后，样品过滤膜，用高效液相色谱仪(hplc)对反应混合液的成分进行检测。结果显示，反应20h后，产物中只有胸腺嘧啶，没有尿嘧啶及杂质峰(图2)。
[0053]
结果表明经过纯化后的固定化酶，在催化反应过程中，有效避免了粗酶液中的杂酶将胸腺嘧啶水解为尿嘧啶，简化了后续对产品的进一步纯化的工艺步骤并降低生产成本。
[0054]
实施例3
[0055]
比较测定固定化的n-脱氧核糖转移酶催化反应时的酶活力
[0056]
称取5mg、10mg、20mg和40mg的由实施例1的步骤(2)得到的固定化n-脱氧核糖转移酶，加入2ml ph7.0磷酸盐缓冲液(50mm)，充分混匀后，分别加入200mg 2
’‑
脱氧胸苷和138mg胞嘧啶，调整反应液温度至60℃，在摇床上以1000rpm振荡反应2，4， 6，20h后分别取样。取100μl反应液放置在100℃中，热处理10min后，离心(12000rpm， 2min)。取离心上清
液，加入1ml ph7.0磷酸盐缓冲液(50mm)，充分混匀后，样品过滤膜，用高效液相色谱仪(hplc)对反应混合液的成分进行检测。结果表明(图3)：反应20h后，反应平衡时的转化率大约为70％。固定化酶的添加量越多反应速度越快， 40mg的固定化酶在反应2h后，反应的转化率即可达到65％，而此时5mg的固定化酶催化转化率为23％。然而，仅需5mg的固定化酶，反应20h后，即可将反应的转化率推动到70％，因此从经济性角度出发，5mg的固定化酶(2.5mg/ml)可以作为该催化反应的最适酶量。进一步证明了本发明制备的固定化的n-脱氧核糖转移酶具有高活性的特征。
[0057]
实施例4
[0058]
确定不同浓度的胞嘧啶对固定化酶反应催化转化率的影响
[0059]
称取50mg的由实施例1的步骤(2)得到的固定化n-脱氧核糖转移酶，加入2mlph7.0磷酸盐缓冲液(50mm)，充分混匀后，加入48mg 2
’‑
脱氧胸苷，并分别加入44mg(0.4m)、67mg(0.6m)、89mg(0.8m)、111mg(1m)、133mg(1.2m)、155mg(1.4m)和 178mg(1.6m)的胞嘧啶，调整反应液温度至60℃，在摇床上以1000rpm振荡反应2，4， 6，20h后分别取样。取100μl反应液放置在100℃中，热处理10min后，离心(12000rpm， 2min)。取离心上清液，加入1ml ph7.0磷酸盐缓冲液(50mm)，充分混匀后，样品过滤膜，用高效液相色谱仪(hplc)对反应混合液的成分进行检测。结果表明(图4)：反应20h后，当胞嘧啶的浓度为0.6-1.2m时(此时2
’‑
脱氧胸苷的浓度为0.2m，反应原料的摩尔比为2
’‑
脱氧胸苷∶胞嘧啶＝1∶3-1∶6)，反应的转化路可超过75％，并且当胞嘧啶的浓度为1m时(此时2
’‑
脱氧胸苷的浓度为0.2m，反应原料的摩尔比为2
’‑
脱氧胸苷∶胞嘧啶＝1∶5)，反应的转化率最高可以达到81％。
[0060]
综上所述，本发明与现有技术相比，具有以下优点：
[0061]
1.通过将带亲和标签的n-脱氧核糖转移酶的粗酶液与亲和配体进行接触，能够有效的吸附带亲和标签的n-脱氧核糖转移酶，且能够有效的去除粗酶液中的杂酶，起到高效的纯化效果；
[0062]
2.将带亲和标签的n-脱氧核糖转移酶固定至亲和配体上，实现带亲和标签的n-脱氧核糖转移酶的高效酶活力和提高重复利用率的效果；
[0063]
3.本发明能够彻底有效的去除粗酶液中的杂酶，利用固定化的带亲和标签的n-脱氧核糖转移酶催化合成脱氧核苷，有效解决了产物水解的问题；
[0064]
4.本发明通过使用特定范围摩尔比的脱氧核糖供体和碱基供体在转化合成中达到更高的转化率和生产效率；和
[0065]
5.利用本发明的方法催化生产2
’‑
脱氧胞苷，与化学法相比，酶催化法没有异构体产生，提高了产品的纯度和产物的利用率。
[0066]
以上仅是本技术的具体应用范例，对本技术的保护范围不构成任何限制。对于所述领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以列举说明。凡采用等同变换或者等效替换而形成的类似此种的技术方案，均落在本技术权利保护范围之内。