柱前衍生-HPLC检测发酵液中卡那霉素含量的方法与流程

柱前衍生-hplc检测发酵液中卡那霉素含量的方法
技术领域
1.本发明属于成分检测领域，涉及发酵液中卡那霉素的检测方法，具体的涉及一种柱前衍生-hplc检测发酵液中卡那霉素含量的方法。


背景技术：

2.卡那霉素是一种氨基糖苷类抗生素，对大多数革兰氏阴性菌、肠杆菌、变形杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和结核杆菌等具有强大的抗菌作用。卡那霉素b比卡那霉素的作用还要强，但神经毒性和肾毒性也更大，所以各国药典中要求限制其含量。
3.卡那霉素的生产方法主要是发酵法。由于发酵液提取过程对卡那霉素b的去除能力有限，因此发酵过程调控不仅要尽量提高发酵水平，同时还要控制卡那霉素b的含量，以保证最终成品合格。所以发酵过程调控迫切需要一种能够同时测定卡那霉素发酵水平和卡那霉素b含量的检测方法。
4.因氨基糖苷类无紫外吸收，所以不能直接使用hplc-uv法进行卡那霉素的分离检测。《中国药典》和《中国兽药典》使用通用型hplc-elsd法可分别对卡那霉素和卡那霉素b进行检测，但其检测对象为成品粉，不适用于发酵液检测，因为卡那霉素与糖类性质具有相似性，用蒸发光散射检测器检测发酵液样品时，卡那霉素易受培养基中糖类的干扰而影响检测准确度。有些企业采用比色法进行中间体的检测，成本低，效率高，但检测准确度和稳定性较差，且无法同时测定卡那霉素b。此外，相关文献报道了柱前衍生-高效液相色谱法、柱后衍生-荧光法、hplc-脉冲安培检测法、酶联免疫法、毛细管电泳法、液质联用法等，从设备成本和易操作性考虑，柱前衍生-hplc-uv法是目前较为普遍适用的中间体分析方法，可满足卡那霉素发酵过程质量控制的需要。
5.文献报道的柱前衍生试剂包括2,4,6-三硝基苯磺酸、茚三酮-吡啶、邻苯二甲醛、异硫氰酸苯酯等。文献《硫酸卡那霉素及其注射液的hplc衍生化测定》以异硫氰酸苯酯为柱前衍生试剂，可同时测定样品中的卡那霉素和卡那霉素b，但其研究对象为成品粉和注射液，操作过程包括水浴加热步骤，反应条件较为复杂，且对卡那霉素b的含量测定采用归一化法，指导意义不大。


技术实现要素：

6.为解决上述问题，本发明的目的是在文献基础上，分别对发酵液样品处理方法和衍生过程进行开发和改进，以提供一种适用于同时检测发酵液中卡那霉素含量及有关组分的方法，从而为发酵过程调控提供指导。
7.本发明为实现其目的采用的技术方案是，一种柱前衍生-hplc检测发酵液中卡那霉素含量的方法，包括以下步骤：
8.a、制备卡那霉素对照品溶液和样品溶液；
9.b、制备衍生溶液：将卡那霉素对照品溶液和样品溶液分别与衍生试剂溶液混合，
摇匀后室温静置反应0.5-1h；然后将反应液加水稀释5倍，微孔滤膜过滤，分别得到卡那霉素对照品衍生溶液和样品衍生溶液，待测；
10.c、采用hplc进行检测：将卡那霉素对照品衍生溶液和样品衍生溶液分别注入hplc，记录峰面积，采用外标法计算样品中卡那霉素的含量。同时，用卡那霉素的校正因子近似计算卡那霉素b的含量。
11.进一步地，所述样品为卡那霉素发酵液。
12.进一步地，所述卡那霉素对照品溶液的浓度为0.4-2.0mg/ml；所述卡那霉素样品溶液的制备方法为：取均匀的卡那霉素发酵液样品，以3000-8000r/min离心10-40min，取上清液用纯化水稀释5-25倍，得到卡那霉素样品溶液。
13.进一步地，所述衍生溶液的制备过程为，取卡那霉素对照品溶液和样品溶液各1ml，分别加入到10ml具塞比色管中，再等量加入衍生试剂溶液，摇匀后室温静置反应0.5-1h。将反应液加水稀释5倍，微孔滤膜过滤，即得到卡那霉素对照品衍生溶液和样品衍生溶液。
14.进一步地，所述衍生试剂溶液为异硫氰酸苯酯、三乙胺、乙腈的混合溶液，其中异硫氰酸苯酯的浓度为0.5％，三乙胺的浓度为2％-8％。
15.进一步地，所述色谱条件如下：
16.流动相a：80％乙腈；
17.流动相b：0.1mol/l乙酸钠溶液(用冰醋酸调节ph至6.5)-乙腈(93:7)；
18.色谱柱：4.6*250mm c
18
；
19.进样量：10-50μl；
20.柱温：30-40℃；
21.流速：0.9-1.1ml/min；
22.波长：254nm；
23.梯度洗脱程序为：
24.时间(分)流动相a％流动相b％0010014208024277324.05100031.3100031.350100350100
25.本发明的有益效果为：本方法样品预处理步骤较为简单，衍生试剂用量较小，衍生条件温和，操作过程简便易控；通过优化色谱条件，更适于卡那霉素与发酵培养基成分完全分离，适用于对发酵液中卡那霉素含量及有关组分进行同时监测，从而为发酵过程调控提供指导。
附图说明
26.图1为实施例1的对照品衍生溶液色谱图(卡那霉素tr：15.9min；卡那霉素b：
23.5min)；
27.图2为实施例1的样品衍生溶液色谱图。
具体实施方式
28.下面以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此：
29.具体实施例一：
30.色谱条件：
31.进样量：10μl；
32.柱温：40℃；
33.流速：1.0ml/min；
34.波长：254nm
35.a、制备卡那霉素对照品溶液：精密称取卡那霉素对照品20mg，溶于50ml水中，摇匀。
36.制备卡那霉素样品溶液：取均匀的卡那霉素发酵液样品，以3000r/min离心40min，取上清液用纯化水稀释10倍，得到卡那霉素样品溶液。
37.b、衍生试剂溶液配制(临用现配)：异硫氰酸苯酯、三乙胺、乙腈按比例混合；其中异硫氰酸苯酯的浓度为0.5％，三乙胺的浓度为2％。
38.c、制备衍生溶液：准确移取对照品溶液和样品溶液各1.0ml，分别加入到10ml具塞比色管中，各加衍生试剂溶液1.0ml，摇匀后室温静置反应1h，各加纯化水8ml，摇匀，分别用微孔滤膜过滤后即得卡那霉素对照品衍生溶液和样品衍生溶液，分别装小瓶待测。
39.d、测定：将对照品衍生溶液和样品衍生溶液分别注入液相色谱仪，进行分离测定；对照品衍生溶液平行进样3次，样品衍生溶液进样1次，记录峰面积。
40.e、结果计算：用卡那霉素对照品衍生溶液的浓度(称样质量w
×
纯度p％/定容体积v)和峰面积a
对
计算校正因子f，然后，用此校正因子和目标峰面积a及样品稀释倍数n分别计算出发酵液样品中卡那霉素和卡那霉素b的含量：
[0041][0042]
样品中卡那霉素的含量＝f
×a样
×
n＝8.35mg/ml。
[0043]
卡那霉素b的含量＝f
×ab
×
n＝0.33mg/ml。
[0044]
具体实施例二：
[0045]
色谱条件：
[0046]
进样量：50μl；
[0047]
柱温：35℃；
[0048]
流速：0.9ml/min；
[0049]
波长：254nm
[0050]
a、制备卡那霉素对照品溶液：精密称取卡那霉素对照品50mg，溶于25ml水中，摇匀。
[0051]
制备卡那霉素样品溶液：取均匀的卡那霉素发酵液样品，以8000r/min离心10min，
取上清液用纯化水稀释5倍，得到卡那霉素样品溶液。
[0052]
b、衍生试剂溶液配制(临用现配)：异硫氰酸苯酯、三乙胺、乙腈按比例混合；其中异硫氰酸苯酯的浓度为0.5％，三乙胺的浓度为8％。
[0053]
c、制备衍生溶液：准确移取对照品溶液和样品溶液各1.0ml，分别加入到10ml具塞比色管中，各加衍生试剂溶液1.0ml，摇匀后室温静置反应0.5h，各加纯化水8ml，摇匀，分别用微孔滤膜过滤后即得卡那霉素对照品衍生溶液和样品衍生溶液，分别装小瓶待测。
[0054]
d、测定：将对照品衍生溶液和样品衍生溶液分别注入液相色谱仪，进行分离测定；对照品衍生溶液平行进样3次，样品衍生溶液进样1次，记录峰面积。
[0055]
e、结果计算：用卡那霉素对照品衍生溶液的浓度(称样质量w
×
纯度p％/定容体积v)和峰面积a
对
计算校正因子f，然后，用此校正因子和目标峰面积a及样品稀释倍数n分别计算出发酵液样品中卡那霉素和卡那霉素b的含量：
[0056][0057]
样品中卡那霉素的含量＝f
×a样
×
n＝2.16mg/ml。
[0058]
卡那霉素b的含量＝f
×ab
×
n＝0.12mg/ml。
[0059]
具体实施例三：
[0060]
色谱条件：
[0061]
进样量：20μl；
[0062]
柱温：30℃；
[0063]
流速：1.1ml/min；
[0064]
波长：254nm
[0065]
a、制备卡那霉素对照品溶液：精密称取卡那霉素对照品25mg，溶于25ml水中，摇匀。
[0066]
制备卡那霉素样品溶液：取均匀的卡那霉素发酵液样品，以5000r/min离心20min，取上清液用纯化水稀释25倍，得到卡那霉素样品溶液。
[0067]
b、衍生试剂溶液配制(临用现配)：异硫氰酸苯酯、三乙胺、乙腈按比例混合；其中异硫氰酸苯酯的浓度为0.5％，三乙胺的浓度为7％。
[0068]
c、制备衍生溶液：准确移取对照品溶液和样品溶液各1.0ml，分别加入到10ml具塞比色管中，各加衍生试剂溶液1.0ml，摇匀后室温静置反应50min，各加纯化水8ml，摇匀，分别用微孔滤膜过滤后即得卡那霉素对照品衍生溶液和样品衍生溶液，分别装小瓶待测。
[0069]
d、测定：将对照品衍生溶液和样品衍生溶液分别注入液相色谱仪，进行分离测定；对照品衍生溶液平行进样3次，样品衍生溶液进样1次，记录峰面积。
[0070]
e、结果计算：用卡那霉素对照品衍生溶液的浓度(称样质量w
×
纯度p％/定容体积v)和峰面积a
对
计算校正因子f，然后，用此校正因子和目标峰面积a及样品稀释倍数n分别计算出发酵液样品中卡那霉素和卡那霉素b的含量：
[0071][0072]
样品中卡那霉素的含量＝f
×a样
×
n＝10.87mg/ml。
[0073]
卡那霉素b的含量＝f
×ab
×
n＝0.45mg/ml。