连翘苷在制备脂肪甘油三酯脂肪酶抑制剂中的应用的制作方法

1.本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及连翘苷在制备脂肪甘油三酯脂肪酶抑制剂中的应用。


背景技术：

2.连翘始载于《神农本草经》卷三，列为下品，曰：“连翘一名异翘，一名兰华，一名折根，一名轵，一名三廉。生山谷”。其味苦，性微寒。归肺、心、小肠经，主产于我国山西、河南、陕西、山东等地。2020年版《中华人民共和国药典》收载连翘为木犀科植物连翘forsythia suspensa(thunb.)vahl的干燥果实。秋季果实初熟尚带绿色时釆收，除去杂质，蒸熟，晒干，习称“青翘”；果实熟透时采收，晒干，除去杂质，习称“老翘”。具有清热解毒，消肿散结，疏散风热的功效，临床上用于治疗痈疽，瘰疬，乳痈，丹毒，风热感冒，温病初起，温热入营，高热烦渴，神昏发斑，热淋涩痛。
3.连翘中含多种化学成分，主要包括木脂素类、黄酮类、苯乙醇苷类、挥发油类及萜类、生物碱类、有机酸类等，其中木脂素类有效活性成分连翘苷(phillyrin，分子量为534.55)含量较高，是连翘的主要药理活性成分，也是中国药典所规定的连翘质量控制指标性成分，中国药典规定本品按干燥品计算，含连翘苷(c
27h34o11
)不得少于0.15％。连翘苷是由两分子苯丙素侧链相互连接形成两个环氧结构的一类木脂素，其结构上连翘是多种天然产物单体发挥抗氧化、抗菌和抗炎作用的重要基团之一。
4.脂肪甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase，atgl)是催化甘油三脂水解第一步的重要脂肪酶，将甘油三酯水解为甘油二脂和一分子游离脂肪酸，是脂滴中甘油三脂水解的主要限速酶。atgl在细胞质、脂滴和细胞膜上都有分布，atgl借助c-端val315到ile364的疏水区域结合到脂滴表面。
5.连翘苷是中药连翘的主要的活性成分之一，现代药理研究表明连翘苷具有多种作用，包括抗氧化、抗炎、抑制肥胖、调节代谢等。连翘苷的一些药理作用已经被研究者证明：有研究表明连翘苷通过抑制mapks以及nf-κb通路的激活，从而改善tnfα诱导的体外脂肪细胞的炎症反应。连翘苷通过激活脂肪组织pparγ/anptl通路，降低小鼠血清炎症因子如tnfα的表达，改善高脂饮食导致的脂肪组织慢性炎症状态，从而改善高脂诱导的胰岛素抵抗。此外，连翘苷激活irs/pi3k/akt信号通路，改善脂肪细胞胰岛素敏感性，显著增强脂肪细胞对葡萄糖的摄取率。
6.目前报道的atgl抑制剂只有atglistatin。因此，急需开发出效果好且副作用较小、价格适宜的药物。
7.鉴于上述缺陷，本发明创作者经过长时间的研究和实践终于获得了本发明。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于解决现有的脂肪甘油三酯脂肪酶抑制剂的效果欠佳且有副作用的问题，提供了连翘苷在制备脂肪甘油三酯脂肪酶抑制剂中的应用。
9.为了实现上述目的，本发明公开了连翘苷在制备脂肪甘油三酯脂肪酶抑制剂中的应用，所述抑制剂剂型为注射剂、丸剂、片剂、颗粒剂中的任意一种。
10.与现有技术比较本发明的有益效果在于：本发明采用连翘苷作为atgl抑制剂，通过抑制脂肪组织脂解过程及其在相关代谢紊乱疾病中的应用，通过一系列相关实验，发现连翘苷可显著降低高脂饲养或正常小鼠血清游离脂肪酸和甘油水平，抑制脂肪组织基础脂解反应，降低atgl的基因表达和蛋白水平。分子对接实验表明，连翘苷可与atgl蛋白进行结合，并产生抑制作用。连翘苷作为atgl抑制剂，其实验结果可靠，效果明确。
附图说明
11.图1为连翘苷降低小鼠血中甘油水平，a：25mg/kg连翘苷连续给药后，对高脂饲养小鼠血中甘油水平的影响，b：单次给药不同剂量连翘苷对小鼠血中游离脂肪酸水平的影响，data＝mean
±
sem，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.005；
12.图2为连翘苷降低脂肪组织脂解反应，a：200μm连翘苷对500ng/ml lps刺激的体外培养脂肪组织甘油释放的影响，b：200μm连翘苷对100ng/ml il-6刺激的体外培养脂肪组织甘油释放的影响，c：200μm连翘苷对50μmatglistatin刺激的体外培养脂肪组织甘油释放的影响，data＝mean
±
sem，*p《0.05，**p《0.01；
13.图3为连翘苷对脂肪组织基因表达的影响；
14.图4为连翘苷对脂肪组织脂解通路相关基因表达水平的影响；
15.图5为连翘苷对脂肪组织atgl、hsl、mgl mrna水平的影响；
16.图6为连翘苷降低atgl的蛋白表达以及连翘苷对脂肪组织脂解通路相关蛋白表达的影响，data＝mean
±
sem，*p《0.05；
17.图7为连翘苷与atgl的分子对接结果。
具体实施方式
18.以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。
19.一、实验动物
20.采用spf级雄性健康c57bl/6j雄性小鼠，均为4周龄，江苏集萃药康生物科技股份有限公司提供，许可证号：scxk(苏)2012-0001。spf级饲养，温度恒定为18-22℃，湿度恒定为55％-65％，饲养于安徽中医药大学中西医结合学院实验动物中心spf级的动物房中，动物实验设计征得安徽中医药大学实验动物伦理委员会同意。实验期间注意观察小鼠机体活动情况，毛发颜色，记录动物死亡情况，每周固定时间监测体重、摄食量、每天监测饮水量。高脂模型试验中，分三组：正常组(ctrl)、高脂组(hfd)、高脂 连翘苷组(phil)。肥胖模型小鼠喂养含60％脂肪的高脂饲料(xthf60，协同生物)。连翘苷用0.1％cmc-na混悬。高脂 连翘苷组(phil)小鼠在喂养高脂饲料的同时，灌胃给予连翘苷，模型组及正常对照小鼠灌服等体积溶媒对照。连续给药后，小鼠处死，摘眼球取血，测定血清甘油水平。不同剂量连翘苷单次给药试验中，正常c57bl/6j小鼠分5组，隔夜禁食后，灌胃给予0、25、50、100、200mg/kg的连翘苷药液，给药8h后，眼眶静脉采血，测定血中游离脂肪酸水平。
21.二、小鼠脂肪组织体外培养和分组
22.随机取正常c57bl/6j小鼠，在超净台下取出小鼠脂肪组织，pbs清洗2-3次；剪碎脂
肪组织至约1mm3大小，均匀分为6份，放置在6孔板中。在10％fbs培养基中加入il-6、lps和连翘苷至实验预定的浓度后于培养箱中37℃，5％co2的条件下培养24h，收集上清和脂肪组织。
23.三、甘油含量测定
24.(1)工作液r1：r2＝4：1，现配现用；
25.(2)标准品稀释：用蒸馏水、生理盐水或与样品缓冲液一样的液体，将4mm甘油标准品倍比稀释为1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125μmol/l，注意设置0浓度对照反应管；
26.(3)先加标准甘油或待测甘油5μl，后加工作液195μl；
27.(4)37℃，反应20min；然后测定各管吸光度值。
28.四、脂肪组织总rna的提取
29.(1)移除6孔板中的培养基，用pbs缓冲液对6孔板内的组织进行清洗后，收集脂肪组织，每孔加250μltrizol reagent裂解细胞。
30.(2)加500μl氯仿，室温放2-3min；
31.(3)离心12000rpm，15min，4℃；
32.(4)取上清至新的ep管；
33.(5)加100μl异丙醇，室温放10min；
34.(6)离心12000rpm，10min 4℃；
35.(7)弃上清，加75％乙醇500μl洗一次，晾干，加20μl ddh2o存放于冰上；
36.(8)测rna浓度。存放于-80℃。
37.五、逆转录反应
38.(1)rna上样量1000ng，计算上样体积，加5
×
gdna 2μl，ddh2o补足10μl，42℃ 3min；
39.(2)10
×
fast rt buffer 2μl，rt enzyme mix 1μl，fq-rt primer mix 2μl，ddh2o 5μl，加入(1)中42℃ 15min 95℃ 3min；
40.(3)得到cdna 20μl，存放于-20℃；
41.六、qrt-pcr实验
42.运用sybr green嵌入荧光法定量检测atgl、hsl、mgl等基因的表达水平。将逆转录合成的cdna加80μl ddh2o稀释，进行定量pcr反应。反应条件为：预变性95℃10min，变性95℃15s，退火/延伸60℃1min，共45个循环20μl反应体系，300nm：primer(4500nm)0.34μl，h2o 2.12μl，master mix 5μl，cdna 2.5μl。100nm：primer(4500nm)0.11μl，h2o 2.39μl，master mix 5μl，cdna 2.5μl。
43.七、组织总蛋白的提取及检测
44.1、总蛋白提取
45.取适量脂肪组织加入蛋白裂解液(含0.1％pmsf)于离心管中，用超声细胞破碎仪破碎组织，12000rpm，4℃，离心5min，置于冰上，用200μl枪头插到蛋白液体层吸取，将吸取的液体移至新的1.5ml离心管，分装，放于-80℃冻存，备用。
46.2、western blot操作步骤
47.(1)将制备凝胶的模具装好(短板在外，长板在内)，固定上塑料板。加满超纯水检
漏，观察30min后无漏水现象才可使用，否则重新固定；
48.(2)制备聚丙烯酰胺凝胶
[0049][0050][0051]
(3)翻转玻璃板，放入电泳槽中，倒入电泳缓冲液，小心拔出梳子。将样品稍离心，加20μl蛋白样品和彩虹蛋白marker 2μl，盖上电泳盖，进行sds-page电泳；
[0052]
(4)打开电泳仪接通电源，电压恒压调至100v，先电泳约15min，当染料进入分离胶后，将电压调至150v，继续电泳约60min，至染料接近凝胶的底端，进行转膜；
[0053]
(5)在电泳快结束时，剪裁pvdf膜(8.5cm
×
5.5cm)，甲醇中浸泡20s，ddh2o中20s，在blotting buffer中浸泡30min(活化膜)。电泳后将胶取下，在blotting buffer中浸泡10min。打开塑料支架，在有转移缓冲液的搪瓷盘里切胶、取胶，在塑料板黑色面上放一层海绵，一层滤纸，叠放整齐，再放置凝胶、pvdf膜，再叠放一层滤纸，轻轻赶走各层之间的气泡，塑料支架扣好后，放入转膜槽内，倒入转移缓冲液，装好电泳设备。
[0054]
(6)接通电源，电流设置为恒流200ma转移1.5h，为防止转膜温度过高，整个转膜过程在冰盒中进行；
[0055]
(7)将膜从电泳槽中取出，ddh2o稍加漂洗；
[0056]
(8)用tbst洗3次，每次10min，blocking buffer(封闭液)1h，tbs冲洗，将一抗用一抗稀释液稀释至适当浓度后倒入培养皿中，将pdvf膜放入一抗中，4℃孵育过夜；
[0057]
(9)根据一抗来源选择合适的二抗，用含的3％bsa的tbst稀释至适当浓度，将膜置于二抗溶液中，室温下孵育40min。用tbst洗3次，每次10min；
[0058]
(10)在暗室条件下进行化学发光反应。将a、b发光液在ep管中等体积混合，将发光混合液滴在膜的蛋白面，让蛋白与发光试剂充分接触后在超灵敏多功能成像仪下曝光。
[0059]
八、连翘苷与atgl蛋白的分子对接
[0060]
atgl预测蛋白结构(q8bj56(plpl2_mouse))从alphafold protein structure database(www.alphafold.ebi.ac.uk)上下载。运用schrodinger software release 2017-1软件进行分析计算。运用ligprep module(https://www.schrodinger.com/)获取连翘苷和atglistatin的3d构型，并运用opls3 force field进行优化。运用sitemap软件预测蛋白结合位点。运用glide sp进行连接评分。
[0061]
九、实验结果
[0062]
1、连翘苷降低小鼠血中甘油水平
[0063]
如图1a结果显示，与模型组相比，25mg/kg连翘苷连续给药后，可显著降低高脂饲
养小鼠血中甘油水平。此外，单次给药，连翘苷可呈剂量依赖性的降低小鼠血中游离脂肪酸(ffas)的水平(图1b)。上述结果提示，连翘苷可抑制脂肪组织基础水解过程。
[0064]
2、连翘苷抑制体外脂肪组织基础脂解反应
[0065]
如图2a结果显示，与lps组相比，200μm连翘苷可显著降低脂肪组织甘油的释放。同时，如图2b结果显示，与il-6组相比，200μm连翘苷可显著降低脂肪组织甘油的释放。上述结果提示，连翘苷可降低脂肪组织基础水解反应。然而，在atgl被其抑制剂atglistatin抑制的情况下，200μm连翘苷不能够显著降低脂肪组织的甘油释放水平(图2c)。因此，连翘苷对脂肪组织脂质水解的抑制作用与atgl相关。
[0066]
3、连翘苷降低atgl基因的表达
[0067]
rna-seq数据显示连翘苷可显著改变脂肪组织的基因表达水平(图3)。其中，脂质水解通路中atgl的表达显著降低，而cgi-58、hsl及mgl表达水平不变(图4)。通过qrt-pcr实验，我们进一步证实脂质组织中atgl mrna水平显著降低(图5)。因此，上述结果显示连翘苷可抑制脂肪组织atgl的基因表达。
[0068]
4、连翘苷降低atgl蛋白的表达
[0069]
western blot结果显示，连翘苷可显著降低il-6刺激的脂质组织中atgl的蛋白水平。而其他相关蛋白(plin1、phsl、hsl、cgi-58)的表达水平不受连翘苷影响(图6)。因此，上述结果显示连翘苷可抑制脂肪组织atgl的蛋白表达。
[0070]
5、连翘苷与atgl蛋白分子对接实验结果
[0071]
连翘苷与atgl有5个可能的结合位点(表1)。其中，位点2的评分最高，达到-12.70，高于atglistatin在此位点的评分。因此，我们选取位点2用来进行连翘苷与atgl建立分子对接模型。结果显示，连翘苷有5个氢键能与atgl ser47、leu51、thr146、ala225和leu226号位点的氨基酸形成氢键(图7)
[0072]
表1连翘苷与atgl中5个结合位点的评分
[0073]
site numbersite scored scoresite 11.0571.106site 21.3221.418site 30.9390.921site 40.8310.806site 50.7570.711
[0074]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，对本发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。