用于非小细胞肺癌CYFRA21-1检测的电化学发光免疫传感器及检测方法与流程

用于非小细胞肺癌cyfra21-1检测的电化学发光免疫传感器及检测方法
技术领域
1.本发明属于电化学发光免疫传感器、纳米复合材料技术领域，涉及一种用于非小细胞肺癌cyfra21-1检测的电化学发光免疫传感器及检测方法。


背景技术：

2.肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，已成为全球癌症相关死亡的主要原因。 肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌（nsclc）约占所有肺癌的85％，而且大约有75％的nsclc患者在被发现时已经处于晚期。现有的诊断方法具有价格昂贵、过程复杂耗时、患者机体损伤大等缺点。因此对于非小细胞肺癌而言，探索成本较低、简便快捷且机体损伤小的疾病诊断方法具有重要的临床意义。cyfra21-1是细胞角蛋白19（ck19）的可溶性片段。它是非小细胞肺癌常见的生物标志物，其水平与肿瘤的类型和严重程度密切相关，所以检测cyfra21-1对于肺癌的诊断具有重要意义。
3.目前cyfra21-1的检测方法主要有传统方法如荧光测定法、表面等离子共振分析和免疫放射测定方法等。虽然灵敏度高但存在如耗时、成本高、设备昂贵和操作繁琐等不足，因此开发一种简便、灵敏、快速和经济的方法用于临床标本cyfra21-1的检测是非常有必要的。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术中的问题，本发明提供一种用于非小细胞肺癌cyfra21-1检测的电化学发光免疫传感器。本发明构建了以双金属有机框架作为载体，mxene和nimn ldh的纳米复合材料作为基底，协同促进luminol发光的夹心型电化学发光免疫传感器,为非小细胞肺癌的检测提供了新的诊断途径。
5.除特殊说明外，本发明所述份数均为重量份，所述百分比均为质量百分比。
6.为实现上述目的，本发明的技术方案为：一种用于非小细胞肺癌cyfra21-1检测的电化学发光免疫传感器，其特征在于，通过信号探针和基底材料构建用于非小细胞肺癌cyfra21-1检测的电化学发光免疫传感器。
7.所述构建用于非小细胞肺癌cyfra21-1检测的电化学发光免疫传感器的方法为：将基底材料mxene-pei-nimn ldh溶液滴加到清洁的玻碳电极表面上，然后将 aunps溶液滴加到玻碳电极表面上，再将用pbs缓冲液室温溶解的ab1滴加在玻碳电极上，4℃孵育12 h；接着在电极上滴加 1% bsa溶液，4℃孵育30 min；最后将用pbs缓冲液室温溶解的cyfra21-1滴在玻碳电极上，4℃孵育1.5 h，即得到用于cyfra21-1检测的电化学发光免疫传感器。
8.所述信号探针由la-mof@zif-67@aunps@luminol溶液与 ab2于室温搅拌12小时，离心后沉淀洗涤，得到信号探针。
9.所述la-mof@zif-67@aunps@luminol溶液的制备包括如下步骤：
1）zif-67分散液的制备：将 co(no3)2·
6h2o和 2-甲基咪唑用甲醇溶解，在室温下搅拌3小时，然后离心，用甲醇和水洗涤，60℃下干燥得棕色粉末，然后将棕色粉末分散在超纯水中制得浓度为1mg/ml的zif-67分散液；2）la-mof分散液的制备:将 la(no3)3和2-氨基对苯二甲酸加入到 dmf 溶液中，室温下搅拌10分钟，然后转移到衬有聚四氟乙烯的不锈钢高压釜中，在150℃下反应6 h，冷却至室温，甲醇和水洗涤，离心收集沉淀物，60℃真空干燥12h；最后将干燥的沉淀物分散在超纯水中制得浓度为1mg/ml的la-mof分散液；3）aunps溶液的制备：将 100 ml 0.01% haucl
4 溶液在搅拌下煮沸，然后加入 2.5 ml 1% 柠檬酸钠溶液，保持沸腾15 min后冷却至室温。最后，溶液颜色变为紫红色，表明aunps的成功合成。
10.4）la-mof @zif-67 @aunps@luminol的制备：首先，将1ml 1mg/ml la-mof 分散液加入1ml 1mg/ml zif-67分散液中，并在室温下搅拌12小时，离心洗涤后得到la-mof@zif-67纳米复合材料分散液；然后将aunps溶液加入纳米复合材料分散液中，并在室温下保持均匀搅拌4小时，用水冲洗，离心得到沉淀 la-mof@zif-67@aunps，再用超纯水溶解得到la-mof@zif-67@aunps溶液；再加入luminol，搅拌4 h后离心，沉淀用超纯水溶解得到la-mof@zif-67@aunps@luminol溶液。
11.所述基底材料mxene-pei-nimn ldh溶液的制备为将mxene分散体与 1% pei溶液混合，然后将混合物在室温下搅拌2小时，加入nimn ldh分散液，搅拌8小时，离心后将沉淀洗涤得mxene-pei-nimn ldh基底材料；然后将mxene-pei-nimn ldh基底材料溶于超纯水中得到基底材料mxene-pei-nimn ldh溶液，于4℃备用。
12.所述nimn ldh分散液的制备为将 mnso4·
4h2o、 ni(no3)2·
6h2o 和 nh4f溶解在超纯水中，超声处理成均匀溶液后，滴加 nh3·
h2o，然后在室温下搅拌4小时，再老化12小时，产物离心，沉淀用超纯水洗涤后60℃真空烘箱中干燥12小时；最后将干燥后的沉淀分散在超纯水中，制得浓度为1mg/ml的nimn ldh分散液。
13.一种用于非小细胞肺癌cyfra21-1检测的电化学发光免疫传感器，其特征在于，制备过程包括如下步骤：（1）信号探针的制备：1）zif-67分散液的制备：将 1.455 g co(no3)2·
6h2o 和1.65 g 2-甲基咪唑分别溶解在30 ml甲醇中，混合，在室温下搅拌3小时，然后将混合物离心，得到棕色粉末，用甲醇和水洗涤，60℃下干燥，将棕色粉末分散在超纯水中，制备浓度为1mg/ml的zif-67分散液。
14.2）la-mof分散液的制备:将 2 mmol la(no3)3和2-氨基对苯二甲酸加入到30 ml dmf 溶液中，超声处理至均匀分散后，在室温下搅拌10分钟，然后转移到衬有聚四氟乙烯的不锈钢高压釜中，在150℃下反应6 h，冷却至室温，甲醇和水洗涤，离心收集沉淀物，60℃真空干燥12h；最后将沉淀物分散在超纯水中制备浓度为1mg/ml的la-mof分散液。
15.3）aunps溶液的制备：将 100 ml 0.01% haucl
4 溶液在搅拌下煮沸，然后加入 2.5 ml 1% 柠檬酸钠溶液，保持沸腾15 min后冷却至室温。最后，溶液颜色变为紫红色，表明aunps的成功合成。
16.4）la-mof @zif-67 @aunps@luminol溶液：首先，将1ml 1mg/ml la-mof 分散液加入1ml 1mg/ml zif-67分散液中，在室温下搅拌12小时，离心，沉淀用超纯水溶解制备得到
la-mof@zif-67纳米复合材料分散液；然后将aunps溶液加入到纳米复合材料分散液中，并在室温下搅拌4小时，用水冲洗后离心，沉淀用超纯水溶解制得 la-mof@zif-67@aunps溶液，加入1 ml 0.01 m luminol，搅拌4 h后离心，沉淀用超纯水溶解制备得到la-mof@zif-67@aunps@luminol溶液。
17.5）信号探针的制备：取步骤4）制备的la-mof@zif-67@aunps@luminol溶液1 ml 与100 μl ab2，室温搅拌12小时，离心后沉淀洗涤，得到信号探针。
18.（2）基底材料的制备：1）nimn ldh: 将0.3 mmol mnso4·
4h2o、0.3 mmol ni(no3)2·
6h2o 和1.8 mmol nh4f溶解在25 ml超纯水中。超声处理成均匀溶液后，滴加2 ml nh3·
h2o，然后在室温下搅拌混合4小时，再老化12小时，产物离心，沉淀用超纯水洗涤，在60℃真空烘箱中干燥12小时，最后将干燥的沉淀分散在超纯水中，即得到浓度为1mg/ml的nimn ldh分散液。
19.2）mxene-pei
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nimn ldh：将1ml mxene分散体 (1mg/ml)与500 μl 1% pei溶液混合，在室温下搅拌2小时，加入溶解在1ml超纯水中的1mg nimn ldh，搅拌8小时，离心得沉淀mxene-pei-nimn ldh复合材料。 将制备的mxene-pei-nimn ldh复合材料溶于1ml 超纯水中4℃备用。
20.（3）检测非小细胞肺癌cyfra21-1的电化学发光免疫传感器的构建过程：1）用0.1 m pbs（ph=7.4）缓冲液室温下分别溶解ab1和cyfra21-1，储存备用；2）将玻碳电极用食人鱼洗液（98% h2so4/30% h2o
2 = 3:1, v/v）浸泡30 min后用超纯水冲洗干净备用；3）将步骤2）得到的电极分别用0.3 μm和0.05 μm的al2o3粉末抛光呈镜面，然后分别按超纯水、无水乙醇、超纯水的顺序超声处理电极，干燥备用；4）将步骤3）得到的电极在0.5 m h2so4中进行电化学活化，然后用超纯水冲洗，干燥；5）将10 μl基底材料溶液滴加到步骤4）清洁的玻碳电极表面上，室温干燥；6）将10 μl aunps溶液滴加到步骤5）玻碳电极表面上，室温干燥；7）将10 μl步骤1）制得的ab1缓冲盐溶液滴加在步骤6）制备得到的电极上，4℃孵育12 h；8）将6 μl 1% bsa溶液滴加到步骤7）得到的电极上，4℃孵育30 min；9）将10 μl步骤1）制备的cyfra21-1缓冲盐溶液滴在步骤8）制备的电极上， 4℃孵育1.5 h，即得到用于cyfra21-1检测的电化学发光免疫传感器。
21.本发明还提供利用电化学发光免疫传感器检测非小细胞肺癌cyfra21-1的方法。
22.一种利用电化学发光免疫传感器检测非小细胞肺癌cyfra21-1的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）向所述的电化学发光免疫传感器的电极上滴加信号探针溶液于电极表面，4 ℃孵育4 h；（2）将步骤1）制备得到的电极用超纯水冲洗净，晾干后将电极置于含有5 mm h2o2的0.1 m pbs溶液中，测量不同浓度cyfra21-1的电化学发光响应信号变化值；（3）根据不同浓度对数值与电化学发光响应信号变化值的线性关系，绘制标准曲线；
（4）将待测样品利用所述的电化学发光免疫传感器检测，得到电化学发光响应信号值，通过标准曲线换算即可得待测样中cyfra21-1的浓度。
23.与现有技术相比，本发明的一种检测非小细胞肺癌cyfra21-1的电化学发光免疫传感器的制备方法与应用，其突出的特点是：本发明制备了聚乙烯亚胺（pei）功能化的氮掺杂mxene修饰nimn ldh纳米材料最终形成的mxene-pei-nimn ldh纳米复合材料作为传感器的敏感界面；利用新型纳米复合物较大的比表面积和良好导电性协同提高aunps在单位面积上的负载量；然后ab1通过au-n键固载在电极表面，cyfra21-1与ab1特异性结合，最后通过信号探针与不同浓度目标探针的特异性结合引起电化学发光信号的不同变化，来实现对cyfra21-1的定量检测。所制备的电化学发光免疫传感器成功用于cyfra21-1的超灵敏检测。与传统的cyfra21-1检测方法相比，本发明的优点在于灵敏度高，特异性强，检测迅速，操作方便，设备材料价格低廉，无污染，从而为cyfra21-1的检测提供了新的分析方法。
24.有益效果：（1）通过聚乙烯亚胺功能化mxene，极大地改善了nimn ldh的导电性，有效避免mxene的聚集，使其能够均匀地铺展在电极表面，有利于充分发挥其优异的物理化学性能。
25.（2）制备的mxene-pei-nimn ldh具有较大比表面积，作为固定金属的结合位点，两者协同作用以提高aunps在单位面积上的负载量，进一步提高ab1的负载量，从而提高传感器的灵敏度，从而为微量cyfra21-1的检测提供了新的研究方向和分析方法。
26.（4）涉及的材料均可在实验室条件下合成，操作简单，原材料价格低廉，每次使用量极少，降低了实验成本。
27.（5）整个检测分析方法步骤清晰简便，灵敏度高，信号响应迅速。
28.（6）本方法制备的电化学生物传感器可为非小细胞肺癌cyfra21-1的检测提供新方法；该发明所制备的电化学传感器也可应用于疾病的的诊断、分析、检测等方面。
附图说明
29.图1：本发明传感器对不同浓度cyfra21-1的检测结果：图a为在含有5 mm h2o2的0.1m pbs缓冲液中，传感器对不同浓度cyfra21-1扫描的ecl曲线；图b为不同浓度cyfra21-1对数值与传感器ecl响应值的校准曲线。
30.图2：本发明传感器的稳定性、重现性和特异性检测结果：图a:本发明传感器稳定性的检测结果：将孵育两种不同浓度的cyfra21-1(10 pg/ml and 100 pg/ml)构建的传感器扫描15圈后的ecl图；图b：本发明传感器重现性的检测结果：为同一批次5支不同电极在含有5 mm h2o2的0.1 m pbs中扫描的ecl图；图c在相同条件下孵育cyfra21-1 （100 pg / ml）和干扰物（1 ng / ml），如抗坏血酸（aa），多巴胺（da），葡萄糖(glu)，人血清蛋白（hsa），癌胚抗原（cea），空白溶液（blank）后检测的ecl响应值的柱状图。
具体实施方式
31.下面通过具体实施例对本发明进行具体描述，在此指出以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
32.本发明所用原料及试剂均为市售产品。
33.mxene 是从先丰纳米材料科技有限公司（中国南京）订购的。 mnso4·
4h2o 和 n, n-二甲基甲酰胺 (dmf) 购自上海麦克林生化有限公司（中国上海）。 牛血清白蛋白（bsa）购自 j&k scientific ltd（中国北京）。氯化金水合物 (haucl4) 和 2-氨基对苯二甲酸购自 sigma-aldrich chemical co. (美国)。 聚乙烯亚胺 (pei) 购自 alfa aesar co. (美国)。 甲醇购自重庆川东化工集团有限公司 ni(no3)2·
6 h2o、nh4f、la(no3)3·
6h2o、co(no3)2·
6h2o、2-甲基咪唑、luminol购自阿拉丁(美国)。 过氧化氢（h2o2） 购自重庆科龙化工集团有限公司。本发明所用cyfra21-1 抗原和 cyfra21-1 抗体（ab1和ab2）购自 cloud-clone 有限公司（中国武汉）。
34.所用设备及技术参数：在电化学工作站 (autolab pgstsat 302n，metrohm china ltd) 中采用三电极系统进行循环伏安法 (cv) 和电化学阻抗法 (eis) 测量，其中三电极系统包括铂丝 (对电极) 、饱和甘汞电极 (sce, 参比电极) 和修饰后的玻碳电极 (gce, 工作电极)。ecl是由工作站（xi’an remax electronic high-tech ltd, china）采用三电极系统在含有5 mm h2o2的0.1 m pbs中扫描获得。
35.实施例1复合纳米材料的制备和电化学发光免疫传感器的构建按如下步骤操作（构建原理图如图1所示）：步骤1：zif-67分散液：将 1.455 g co(no3)2·
6h2o 和1.65 g 2-甲基咪唑分别溶解在30 ml甲醇中。超声处理后混合上述溶液，在室温下搅拌3小时。将混合物离心，得棕色粉末，用甲醇和水洗涤，60℃下干燥备用。最后将棕色粉末分散在超纯水中，制得浓度为1mg/ml的zif-67分散液。
36.步骤2：la-mof分散液:将 2 mmol la(no3)3和2-氨基对苯二甲酸缓慢加入30 ml dmf 溶液中。超声处理至均匀分散后，将混合物在室温下搅拌10分钟，然后转移到衬有聚四氟乙烯的不锈钢高压釜中，在150℃下反应6 h，冷却至室温，甲醇和水洗涤，离心收集沉淀，60℃真空干燥12h。最后将沉淀分散在超纯水中，制得浓度为1mg/ml的la-mof分散液。
37.步骤3：aunps溶液的制备：将 100 ml 0.01% haucl
4 溶液在剧烈搅拌下煮沸，然后将 2.5 ml 1% 柠檬酸钠溶液快速加入沸腾的溶液中，再使溶液保持沸腾15 min并冷却至室温。最后，溶液颜色变为紫红色，表明aunps的成功合成。
38.步骤4：la-mof@zif-67@aunps@luminol溶液的制备：先将1ml 1mg/ml la-mof分散液 加入1ml 1mg/ml zif-67分散液中，并在室温下搅拌12小时。离心，将沉淀洗涤得到la-mof@zif-67纳米复合材料，然后用超纯水分散la-mof@zif-67，再加入aunps溶液，室温下保持均匀搅拌4小时，离心得沉淀la-mof@zif-67@aunps。用超纯水溶解la-mof@zif-67@aunps，加入1 ml 0.01 m luminol，搅拌4小时后离心，沉淀用超纯水溶解制备得到la-mof@zif-67@aunps@luminol溶液。
39.步骤5：信号探针的制备:取步骤4）制备的la-mof@zif-67@aunps@luminol溶液1 ml 与100 μl ab2，室温搅拌12小时，离心，沉淀洗涤，得到信号探针。
40.步骤6：nimn ldh: 将0.3 mmol mnso4·
4h2o、0.3 mmol ni(no3)2·
6h2o 和1.8 mmol nh4f溶解在25 ml超纯水中。超声处理成均匀溶液后，在剧烈搅拌下滴加2 ml nh3·
h2o。然后将分散体在室温下用磁力搅拌器混合4小时。老化12小时后，产物离心，沉淀用超纯水洗涤，在60℃真空烘箱中干燥12小时。最后将烘干的沉淀分散在超纯水中，即得到浓度为1mg/ml的nimn ldh分散液。
41.步骤7：将1ml mxene分散体 (1mg/ml)与500 μl 1% pei溶液混合，然后将混合物在室温下搅拌2小时。在剧烈搅拌下，将溶解在1ml超纯水中的1mg nimn ldh加入上述分散体中并保持搅拌8小时。离心，得沉淀mxene-pei-nimn ldh复合材料（基底材料）。将制备的mxene-pei-nimn ldh复合材料溶于1ml 超纯水中，4℃备用。
42.步骤8：用0.1 m pbs（ph=7.4）缓冲液室温下分别溶解ab1和cyfra21-1，储存备用。
43.步骤9：将玻碳电极用食人鱼洗液（98% h2so4/30% h2o
2 = 3:1, v/v）浸泡30 min后用超纯水冲洗干净备用。
44.步骤10：将步骤9得到的电极分别用0.3 μm和0.05 μm的al2o3粉末抛光呈镜面，然后分别按超纯水、无水乙醇、超纯水的顺序超声处理电极，干燥备用。
45.步骤11：将步骤10得到的电极在0.5 m h2so4中进行电化学活化，然后用超纯水冲洗，干燥。
46.步骤12：将10 μl步骤7所制的基底材料溶液滴加到步骤11清洁的玻碳电极表面上，室温干燥。
47.步骤13：将10 μl aunps溶液滴加到步骤12玻碳电极表面上，室温干燥。
48.步骤14：将10 μl步骤8制得的ab1缓冲盐溶液滴加在步骤13制备得到的电极上，4℃孵育12 h。
49.步骤15：将6 μl 1% bsa溶液滴加到步骤14得到的电极上，4℃孵育30 min,步骤16：将10 μl步骤8所得的cyfra21-1缓冲盐溶液滴在步骤15得到的电极，4℃孵育1.5 h，即得到用于cyfra21检测的电化学发光免疫传感器。
50.实施例2利用电化学发光免疫传感器检测非小细胞肺癌cyfra21-1利用实施例1构建的电化学发光免疫传感器检测cyfra21-1，按照如下步骤操作：（1）标准曲线的绘制：在实施例1构建的免疫传感器中滴加10 μl 步骤5所制的信号探针于电极表面，并将电极置于含有5 mm h2o2的0.1 m pbs溶液中表征，测量不同浓度cyfra21-1的电流值。根据不同浓度cyfra21-1对数值和ecl响应信号绘制标准曲线，检测结果表明两者在100 fg/ml
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100 ng/ml浓度范围内呈良好的线性关系，线性相关系数为0.9980，检测限为85.20 fm，结果详见图1。
51.（2）传感器稳定性检测：将制备好的传感器分别对两种不同浓度的cyfra21-1连续扫描15圈后ecl信号变化不大，rsd分别为1.53% and 1.77%，结果详见图2 (a)，以上数据表明该传感器具有可接受的稳定性。
52.（3）传感器重现性检测：在相同条件下，使用本发明制备的同一批次的5支不同电极，对cyfra21-1 (100 pg/ml) 进行测定，结果详见图2(b)，其电流响应值的相对标准偏差 (rsd) 为1.43%，说明传感器重现性较好。
53.（4）传感器特异性检测：为了检测本发明传感器的特异性，对如下物质在相同条件下进行检测：cyfra21-1 （100 pg / ml）和干扰物aa，da，glu，hsa，cea，blank（1 ng / ml），在含有5 mm h2o2的0.1 m pbs中ecl响应值见图2(c),图中结果表明本发明的生物传感器具有令人满意的特异性。