一种人工神经鞘水凝胶修复系统及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于凝胶生产技术领域，特别涉及一种人工神经鞘水凝胶修复系统及其制备方法和应用。


背景技术：

2.周围神经在大脑和身体各个部位之间传递信息的过程中起着重要的生理作用。但当神经受损时，通常会导致慢性疼痛、肢体瘫痪甚至严重残疾。与中枢神经系统不同，末梢神经损伤后的再生能力有限。目前，修复周围神经损伤的一般策略主要是在显微镜下神经端点到端点的缝合。然而，这种治疗具有明显的不足，如手术损伤、神经紧张抑制轴突再生和肿瘤性疼痛仍然具有挑战性。临床上常用的神经上皮缝合等显微外科手术，一旦缝合的神经断端之间存在内部结构不能吻合、缝隙、扭曲、重叠、滑移等问题，就会导致再生的轴突不能顺利地长入雪旺管中，从而影响神经的再生和功能恢复。因此，开发一种在湿润环境下具有强粘附和修复功能的水凝胶系统是迫切需要的。
3.水凝胶是一种高水含量的三维交联亲水聚合物网络，具有良好的生物相容性、高的含水量以及类似组织的高弹性等优点，在生物医学领域有着广泛的应用。它可以作为组织损伤部位的植入填充物、组织工程中细胞培养时的三维支架以及细胞、药物、活性分子、生长因子等的释放载体。在组织修复和再生的应用中，作为植入物的水凝胶，利用其粘附性将损伤的组织粘附在一起，既节省时间又节省精力，提高手术安全性，有望替代临床上繁复的显微缝合手术，使其临床应用更加方便。
4.因此，研发出一种结构接近人体组织，组织匹配性、生物相容性及机械性能良好的水凝胶材料对于组织的修复具有十分重要的意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种具备良好的稳定性以及优异的生物相容性的人工神经鞘水凝胶修复系统及其制备方法和应用。
6.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种人工神经鞘水凝胶修复系统，包括以下重量份的原料：明胶为2-3、甲基丙烯酸酐改性明胶为0.5-1、丙烯酸为30-35、多巴胺接枝丙烯酸为1-1.5、单宁酸为6-8、甲基丙烯酰氧乙基三甲基铵氯化物为1-1.6。
7.进一步地，所述的甲基丙烯酸酐改性明胶通过以下方法制得：将明胶加入到生理盐水中，所得溶液加热到40-50℃，然后持续搅拌0.5-1h融化明胶，紧接着加入甲基丙烯酸酐溶液反应4-5h，将反应完的溶液装进透析袋中透析3-4天，将透析后的溶液冷冻并干燥得到甲基丙烯酸酐改性的明胶。
8.进一步地，所述的明胶与甲基丙烯酸酐溶液的质量/体积比为1-1.5:250-300g/μl，反应条件为避光。
9.进一步地，所述的明胶与生理盐水的质量/体积比为1-3:50-60g/ml；
10.搅拌的速度为300-400r/min；
11.甲基丙烯酸酐溶液的浓度为0.1g/ml。
12.进一步地，所述的明胶来源于猪皮、驴皮、鱼皮中的一种或者几种。
13.进一步地，所述的多巴胺接枝丙烯酸通过以下方法制得：将丙烯酸溶液用纯净水稀释后，加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)，反应0.5-1h，之后再加入n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，反应3-4h，最后加入多巴胺盐酸盐反应3-4天，透析、冷冻干燥，得到多巴胺接枝丙烯酸。
14.进一步地，所述的丙烯酸溶液与纯净水的体积比为1-1.5:1.1-1.2，
15.丙烯酸、edc、nhs和多巴胺盐酸盐的摩尔比为1-1.2:0.5-0.8:0.5-0.7:0.3-0.9，反应条件为避光。
16.本发明还提供一种人工神经鞘水凝胶修复系统的制备方法，按重量份将明胶2-3、甲基丙烯酸酐改性明胶0.5-1、丙烯酸30-35、多巴胺接枝丙烯酸1-1.5、单宁酸6-8、甲基丙烯酰氧乙基三甲基铵氯化物1-1.6加入生理盐水中，加入交联剂和引发剂，充分溶解后将上述溶液注入模具里，50-60℃的条件下热聚合成型，得到人工神经鞘水凝胶修复系统。
17.进一步地，所述的交联剂为聚乙二醇双丙烯酸酯、n,n-亚甲基双丙烯酰胺、环三烯键、三烯丙基异氰脲酸酯中的一种或者多种；
18.所述的引发剂为过硫酸钾、2-羟基-2-甲基苯丙酮、过硫酸铵、α-酮戊二酸中的一种或者多种。
19.进一步地，以明胶、甲基丙烯酸酐改性明胶、丙烯酸、多巴胺接枝丙烯酸、单宁酸和甲基丙烯酰氧乙基三甲基铵氯化物的总质量为100计，交联剂的质量百分比为0.01-0.02％，引发剂的质量百分比为0.02-0.03％；聚合条件为无氧；
20.所述的明胶与生理盐水的质量/体积比为1-3:50-60g/ml。
21.将所述人工神经鞘水凝胶修复系统作为受损的神经组织修复的药物使用。
22.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
23.(1)本发明利用了cation-π的粘附作用机制，创新性地以甲基丙烯酰氧乙基三甲基铵氯化物作为凝胶中的cation部分，以多巴接枝丙烯酸中的苯环作为π电子云，以及利用单宁酸中的高密度氢键，通过强静电相互作用以及氢键的作用协同增强水下和体内的强粘附，采用热聚合法制备的人工神经鞘修复产品用于受损的神经组织修复，制备方法简单，成本较低，具有产业化实施的前景；
24.(2)本发明制备的人工神经鞘具有良好生物相容性和组织修复效果，为组织修复系统的开发打下了良好的基础，是一种有潜力的实现组织修复和再生的平台；
25.(3)本发明所采用的制备工艺可用于制备实现体内组织修复和再生的多功能系统，具有很好的实用价值。
附图说明
26.图1为本发明的材料的成分以及结构示意图；
27.图2为本发明制备的甲基丙烯酸酯化明胶的全反射红外光谱图；
28.图3a为本发明制备的甲基丙烯酸酯化明胶的核磁共振波谱图；
29.图3b为图3a中的a部结构图；
30.图4为本发明制备的人工神经鞘的产品图；
31.图5为本发明制备的人工神经鞘的sem图；
32.图6为本发明制备的人工神经鞘的力学性能图；
33.图7为本发明制备的人工神经鞘的粘附性能图；
34.图8为本发明制备的人工神经鞘与细胞共孵育后的细胞毒性试验结果图；
35.图9为本发明制备的人工神经鞘对体内老鼠的切断神经的修复和再生效果图。
具体实施方式
36.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
37.本发明使用全反射红外吸收光谱(atr-ftir)、核磁共振波谱、万能拉伸试验机、扫描电子显微镜(sem)、细胞活力分析(cck-8测试)以及体内的动物模型表征本发明制备的具有组织修复功能的人工神经鞘水凝胶修复系统。
38.实施例1
39.制备人工神经鞘的具体成分和结构如图1所示。制备方法包括以下步骤：
40.(1)甲基丙烯酸酐改性明胶的制备：称取2g的明胶加入到50ml的生理盐水中并将溶液加热到40-50℃，然后持续搅拌0.5-1h融化明胶，紧接着加入500μl的甲基丙烯酸酐溶液(0.1g/ml)，在避光的条件下反应4-5h，将反应完的溶液装进透析袋中透析3-4天，将透析后的溶液冷冻并干燥得到甲基丙烯酸酐改性明胶。采用全反射红外光谱和核磁共振波谱的测试结果表明：成功的制备了甲基丙烯酸酯化明胶(图2和图3a-3b)，具体测试结果如下：
41.atr-ftir和核磁共振波谱测试结果
42.本实施例制备得到的甲基丙烯酸酯化明胶在973.8cm-1
处出现一个明显的特征峰，这是由于碳碳双键(rc＝ch2)中c-h键的平面外弯曲振动引起的，参加图2。此外，核磁共振波谱结果显示，甲基丙烯酸酯化明胶在5.29ppm和5.63ppm处出现了两个质子峰，归因于碳碳双键上的不饱和h，参见图3a-3b。atr-ftir和核磁共振波谱的测试结果表明：本发明成功合成了甲基丙烯酸酯化明胶。
43.(2)多巴胺接枝丙烯酸的制备：将3ml的丙烯酸溶液用3ml的纯净水稀释后，加入0.5g的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)反应0.5-1h，之后再加入0.3g的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)反应3-4h，最后向上述溶液体系中加入0.61g的多巴胺盐酸盐，避光的条件下搅拌反应3-4天，得到多巴胺接枝的丙烯酸。
44.(3)将明胶(0.04g)、甲基丙烯酸酯化明胶(0.01g)、丙烯酸(0.6g)、多巴接枝的丙烯酸(0.02g)、单宁酸(0.16g)、甲基丙烯酰氧乙基三甲基铵氯化物(0.02g)等药品溶解在2ml的生理盐水中，加入交联剂(0.002g)和引发剂(0.004g)，将上述混合好的溶液注入模具里，无氧和50℃的条件下热聚合5-6h成型，得到人工神经鞘。
45.对所得人工神经鞘产品进行性能测试，如下：
46.1)sem测试结果
47.图4为本实施例制备的人工神经鞘的产品图，表明人工神经鞘成功的合成和塑型；图5为本发明制备的人工神经鞘的sem图，表明合成人工神经鞘凝胶，具有比较均匀的孔径
约为20-25μm左右。
48.2)材料的力学性能测试结果
49.如图6所示，本实施例制备得到的人工神经鞘具有优异的力学性能，拉伸结果表明材料具有450％的最大拉伸伸长率以及240kpa的最大抗拉强度。压缩结果显示，当材料被压缩到80％时，最大抗压缩强度达到40mpa。表明本发明制备的材料具有优异的抗拉伸和抗压缩性能；
50.3)材料的粘附性能测试结果
51.本实施例制备得到的人工神经鞘具有优异的水下粘附性能，如图7所示，与在空气中的粘附性能相比，在不同的液体环境中都保持着稳定的粘附强度(空气：9.51kpa，水下：8.44kpa，海水：8.32kpa，pbs：8.27kpa)，表明材料具有优异的水下粘附性能。
52.4)cck-8细胞活力测试
53.取实施例1中所得产品用无菌pbs缓冲液配置成0、0.5、1、2mg/ml的浓度。取培养好的大鼠皮质原代神经元细胞或大鼠施万细胞系种于96孔板中，按照1万细胞/孔的密度接种，每孔体积100μl。培养过夜后，用pbs清洗2-3次，之后加入上述各浓度的材料，与细胞共培养不同的时间段。每个梯度做5个平行孔，以pbs缓冲液作为空白对照。培养结束后用100μl pbs清洗3次，之后每孔加90μl无血清培养基和10μl cck-8溶液，37℃孵化2h，用酶标仪检测450nm处吸光度值。cck-8法检测细胞活力结果表明，人工神经鞘没有显示出明显的细胞毒性，表现出良好的细胞相容性，如图8所示，试验结果表明在0-2mg/ml范围内，显示优良的细胞相容性，没有显著的细胞毒性。
54.6)大鼠体内切断的坐骨神经的修复结果
55.取实施例1中所得产品先用10ml的无菌生理盐水冲洗，然后将材料贴合在大鼠的切断的坐骨神经上，并修复一个月，以pcl材料作为空白对照。大鼠的神经组织修复结果显示：与对照组相比，人工神经鞘水凝胶修复系统具有优异且快速的组织修复和再生效果，如图9所示，结果表明：在同等的时间内，本发明中制备得到的人工神经鞘表现出比对照组更好的修复效果，大鼠的爪印可以更好地展开。
56.实施例2
57.一种人工神经鞘水凝胶修复系统的制备方法，包括以下步骤：
58.(1)甲基丙烯酸酐改性明胶：将明胶0.5g加入到生理盐水10ml中并将溶液加热到40℃，在持续搅拌(搅拌速度为300r/min)下，融化明胶，加入甲基丙烯酸酐溶液50μl反应4h，透析3天，冷冻干燥得到甲基丙烯酸酐改性明胶。
59.(2)多巴接枝丙烯酸：0.4g的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)先加入到丙烯酸稀溶液(7.5ml其中丙烯酸溶液与纯净的体积比为1:1.1，丙烯酸溶液为市售化学纯)中反应0.5h，之后再加入0.2g的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)反应3h，最后加入多巴胺盐酸盐反应3天，透析、冷冻、干燥得到多巴接枝丙烯酸。
60.(3)将明胶0.5g、甲基丙烯酸酐改性明胶0.1g、丙烯酸7.5ml、多巴接枝的丙烯酸0.25ml、单宁酸2g、甲基丙烯酰氧乙基三甲基铵氯化物0.3ml等药品以一定的比例溶解在生理盐水中，加入交联剂(加入量为前面药品总质量的0.01％)和引发剂(加入量为前面药品总质量的0.02％)，充分溶解后将上述溶液注入特定的模具里，50℃的条件下热聚合成型，得到人工神经鞘水凝胶修复系统。
61.将所得人工神经鞘水凝胶修复系统进行力学性能测试和粘附性能测试，结果如下：
62.材料具有450％的最大拉伸伸长率以及240kpa的最大抗拉强度。压缩结果显示，当材料被压缩到80％时，最大抗压缩强度达到40mpa；在不同的液体环境中都保持着稳定的粘附强度(空气：9.51kpa，水下：8.44kpa，海水：8.32kpa，pbs：8.27kpa)，表明材料具有优异的水下粘附性能。
63.实施例3
64.一种人工神经鞘水凝胶修复系统的制备方法，包括以下步骤：
65.(1)甲基丙烯酸酐改性明胶：将明胶2g加入到生理盐水50ml中并将溶液加热到50℃，在持续搅拌(搅拌速度为400r/min)下，融化明胶，加入甲基丙烯酸酐溶液500μl反应5h，透析4天，冷冻干燥得到甲基丙烯酸酐改性明胶。
66.(2)多巴接枝丙烯酸：1.5g的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)先加入到丙烯酸稀溶液(30ml，其中丙烯酸溶液与纯净的体积比为1.5:1.2，丙烯酸溶液为市售化学纯)中反应1h，之后再加入1.2g的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)反应4h，最后加入多巴胺盐酸盐反应4天，透析、冷冻、干燥得到多巴接枝丙烯酸。
67.(3)将明胶2g、甲基丙烯酸酐改性明胶0.4g、丙烯酸30ml、多巴接枝的丙烯酸1ml、单宁酸8g、甲基丙烯酰氧乙基三甲基铵氯化物1.5ml等药品以一定的比例溶解在生理盐水中，加入交联剂(加入量为前面药品总质量的0.02％)和引发剂(加入量为前面药品总质量的0.03％)，充分溶解后将上述溶液注入特定的模具里，60℃的条件下热聚合成型，得到人工神经鞘水凝胶修复系统。
68.将所得人工神经鞘水凝胶修复系统进行力学性能测试和粘附性能测试，结果如下：
69.水凝胶修复系统具有450％的最大拉伸伸长率以及240kpa的最大抗拉强度。压缩结果显示，当材料被压缩到80％时，最大抗压缩强度达到40mpa；在不同的液体环境中都保持着稳定的粘附强度(空气：9.51kpa，水下：8.44kpa，海水：8.32kpa，pbs：8.27kpa)，表明材料具有优异的水下粘附性能。