一种用于分子循环吸附与连续光学检测的微流控芯片及用其进行多核酸样本检测的方法与流程

1.本发明涉及分子诊断领域，特别涉及一种用于分子循环吸附与连续光学检测的微流控芯片及用其进行多核酸样本检测的方法。


背景技术：

2.微流控技术是一门化学、材料学、微尺度流体力学综合交叉的应用技术。从几十年前微流控技术诞生伊始，微流控芯片在化学、生命科学等领域的应用不断得到拓宽与深化，在近十年间其发展尤为迅速，在生物分子（如病毒）的快速检测的科研及产业化应用前沿发挥着举足轻重的作用。
3.结合光学检测技术（如表面等离子基元共振spr、表面光增强拉曼检测sers等）与微流控芯片的新型检测方法是生物分子检测领域的一种前沿方法。常规的，这类方法通常会通过载有生物分子的流体流经特殊的传感界面，同时通过激光照射传感界面，通过光热将其加热至特定温度（t1）以实现生物分子在其上的特征吸附（如杂交反应），在此过程中通过入射传感界面的入射光束的相关参量变化实现生物分子的检测，在检测完成后再通过将传感界面加热至更高温度（t2）从而将生物分子脱吸附以实现传感界面的再生，但这类检测方法所使用的微流控芯片还存在以下不足之处：1．用于这类检测的是简单微流控芯片，其并不具备将有限生物分子样本浓缩并充分吸附于传感界面的功能，这在很大程度上降低了整个系统的检测灵敏度；2．该类芯片用于产生光热的加热束会在一定程度上对检测束产生干扰从而影响检测的灵敏度以及信噪比；3．由于传感界面的再生需要，这类简单的微流控芯片并不能实现连续的样本检测，在实际应用时其检测效率会受到一定的影响。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种分离加热与检测区域的、可将有限生物分子样本浓缩并充分吸附于光学检测区域传感界面上并能实现样本连续光学检测的微流控芯片及用该芯片进行多核酸样本连续检测的方法，以克服上述已有技术存在的不足。
5.本发明采取的技术方案是：一种用于分子循环吸附与连续光学检测的微流控芯片，包括基底层和流道层，所述基底层正面设光学检测区，光学检测区上设传感界面，背面贴附控温加热片和冷却片；所述流道层背面设独立循环流道系统，所述独立循环流道系统包括贮存槽，热流道，检测槽，冷却洄流流道，冷流道，进样管和出样管，所述贮存槽一端连通热流道一端，热流道另一端连通检测槽一端，检测槽另一端连通冷却洄流流道一端，冷却洄流流道另一端连通冷流道一端，冷流道另一端连通至贮存槽另一端，从而形成贮存槽——热流道——检测槽——冷却洄流流道——冷流道——贮存槽的片内循环流道，所述进样管一端连通冷流
道，另一端贯通至流道层正面、接驳进样阀及外部进样管路，所述出样管一端连通热流道，另一端贯通至流道层正面、接驳出样阀及外部出样管路；所述基底层正面与流道层背面贴附，所述光学检测区的位置与检测槽的位置相重叠，控温加热片的位置与贮存槽的位置相重叠，冷却片的位置与冷却洄流流道的位置相重叠。
6.其进一步的技术方案是：所述独立循环流道系统有多套，所述进样管连通冷流道中段，出样管连通热流道中段，出样管高于进样管。
7.其更进一步的技术方案是：所述微流控芯片在工作时以倾斜或竖直固定方式放置。
8.更进一步：所述基底层的主体为可透过选定波长光束的晶体或非晶体、陶瓷或玻璃材料，例如石英玻璃等。
9.更进一步：所述光学检测区有多个，每个光学检测区上均设传感界面，所述传感界面为纳米尺度薄膜或微阵列或薄膜-微阵列多层复合结构。
10.更进一步：所述控温加热片有多个，为电阻式加热片与热电偶复合形成的可控温加热体。
11.更进一步：所述冷却片有一个或多个，为半导体冷却器。
12.更进一步：所述流道层为聚合物透光材料，其材质为可透过特定波长范围光束并同时便于通过机械加工、成型、3d打印、热压、蚀刻等方式加工相应流道的透明材料，例如聚甲基丙烯酸甲酯（pmma）等。
13.更进一步：所述独立循环流道系统有左、右两套，光学检测区有左、右两个，控温加热片有左、右两个。
14.相关的另一技术方案是：它是利用上述的一种用于分子循环吸附与连续光学检测的微流控芯片来进行多核酸样本检测的方法，其具体步骤为：（1）打开所有阀门，向左、右两套流道系统之微流道中分别注入针对目标核酸的生物探针试剂；（2）关闭所有阀门，启动左、右控温加热片及冷却片，控温加热片将温度控制在40～95摄氏度，保持1～90分钟后将生物探针分子充分修饰于传感界面之上；（3）停止加热及冷却，打开所有阀门，向各微流道中分别注入纯水清洗，结束后关闭所有阀门待机；（4）使用纯水将所有待测样本分别配置成溶液；（5）打开所有阀门，将1号样品溶液注入左流道，将左流道中的纯水排出；（6）关闭所有阀门，启动左控温加热片及冷却片，将其加热温度控制在40～70摄氏度，保持1～90分钟，期间调整测试光束正面照射于左光学检测区，并通过透射束的检测分析获取样品检测信息；（7）打开所有阀门，将2号样品溶液注入右流道，同时向左流道注入清洗液，将左流道中样品液排出；（8）关闭所有阀门，启动右控温加热片及冷却片，将其加热温度控制在40～70摄氏度，同时启动左控温加热片，将其加热温度控制在75～95摄氏度，保持1～90分钟，期间调整测试光束正面照射于右光学检测区，并通过透射束的检测分析获取样品2检测信息；
（9）打开所有阀门，将3号样品溶液注入左流道，将左流道中清洗液排出，同时向右流道注入清洗液，将右流道中样品液排出；（10）关闭所有阀门，启动左控温加热片及冷却片，将左控温加热片加热温度控制在40~70摄氏度，同时启动右控温加热片，将其加热温度控制在75~95摄氏度，保持1~90分钟，期间调整测试光束正面照射于左光学检测区，并通过透射束的检测分析获取样品3检测信息；（11）循环执行步骤（7）至步骤（10），直至所有样本溶液检测完成。
15.由于采用上述技术方案，本发明之一种用于分子循环吸附与连续光学检测的微流控芯片及用其进行多核酸样本检测的方法具有如下有益效果：1．由于本发明提供了一种集成生物样本浓缩与光学检测的小型微流控芯片，即将多个有限量生物样本中生物分子实时浓缩吸附并进行连续光学检测，可进行光学有效检测区域内有限样本中生物分子充分的、浓缩的收集，同时使用外部检测光束照射检测区，通过其透射或反射束的性质变化来提取样本检测信息，如此将样本浓缩与光学检测技术结合到同一个微流控芯片中，不仅解决了光学检测界面对于有限生物样本中目标检测物的吸附效率问题，而且提高了光学检测效率及检测精度。
16.2．由于本发明之微流控芯片设置了控温加热片，通过改变控温加热片的不同加热温度变化，来控制流经光学检测界面流体的温度，以满足生物分子在检测界面吸附、反应、脱吸附等不同过程中的变温控制需求，实现了检测界面对生物分子吸附——脱吸附再生——再吸附的循环，同时也实现了吸附、反应、脱附过程中的芯片内集成及光学原位检测。
17.3．由于本发明之微流控芯片设置了多套独立循环流道系统，且控温加热片与冷却片可通过独立外部供电及控制系统分别控制其实时温度，从而实现片内各套流道系统中热流体与传感界面之间的相互作用的独立控制（相互作用包括但不限于流体内流质在传感界面的吸附、转化及脱吸附等），再通过检测光束片内多套流道的切换，以及片内多套流道中流体注入的切换与加热温度的独立控制，可实现多个生物样本中生物分子的吸附、脱吸附过程的同步进行，从而实现多样本在检测界面上浓缩吸附与检测界面脱吸附再生的无缝衔接，进一步提高了检测效率。
18.4．本发明之微流控芯片可通过调节与水平面形成的夹角，从而在控温加热片加热温度恒定的情况下调控内部流道中流体的循环流速。
19.5．本发明之微流控芯片大幅减少了样本预处理、检测界面再生等人为操作，提高了多样本光学检测的速度，缩短了检测时间，同时芯片结构简单，功能集成度高，可连续复用进行无缝衔接的多样本连续检测，检测过程可控且操作方便，满足各种场合中生物样本快速检测的需求，实际应用前景巨大。
20.下面结合附图和实施例对本发明之一种用于分子循环吸附与连续光学检测的微流控芯片及用其进行多核酸样本检测的方法的技术特征作进一步说明。
附图说明
21.图1为本发明实施例一之一种用于分子循环吸附与连续光学检测的微流控芯片结构示意图（主视）；
图2为本发明实施例一之基底层与流道层贴附前的层叠示意图；图3为本发明实施例一之基底层结构示意图；图4为本发明实施例一之流道层结构示意图。
22.图中：1—基底层，2—流道层，3—左光学检测区，4—右光学检测区，5—左控温加热片，6—右控温加热片，7—冷却片，8—左出样管，9—左下行热流道，10—左上行热流道，11—左检测槽，12—左冷却洄流流道，13—左贮存槽，14—左下行冷流道，15—左上行冷流道，16—左进样管，17—右出样管，18—右下行热流道，19—右上行热流道，20—右检测槽，21—右冷却洄流流道，22—右贮存槽，23—右下行冷流道，24—右上行冷流道，25—右进样管。
具体实施方式
23.实施例一一种用于分子循环吸附与连续光学检测的微流控芯片，也可用于表面等离子基元共振（spr）光学检测的多核酸样本连续实时浓缩检测，如图1、图2所示，包括基底层1和流道层2，所述基底层正面设左光学检测区3与右光学检测区4，左光学检测区3与右光学检测区4上均根据检测需要制备有传感界面，基底层背面贴附左控温加热片5、右控温加热片6和半导体冷却片7（参见图3）。
24.所述微流控芯片以与水平面成90
°
的竖直方式固定，所述流道层背面设左、右两套独立循环流道系统，包括左、右贮存槽，左、右上行热流道，左、右下行热流道，左、右检测槽，左、右冷却洄流流道，左、右上行冷流道，左、右下行冷流道，设于下方的左、右进样管和设于上方的左、右出样管。
25.如图4所示，所述左贮存槽13上端连通左上行热流道10下端，左上行热流道10另一端连通左下行热流道9，其共端连通左出样管8下端，左出样管8上端贯通至流道层正面、接驳出样阀及外部出样管路，所述左下行热流道9下端连通左检测槽11上端，左检测槽11下端连通蛇形的左冷却洄流流道12上端，左冷却洄流流道12下端连通左下行冷流道14上端，左下行冷流道14另一端连通左上行冷流道15，其共端连通左进样管16上端，左进样管16下端贯通至流道层正面、接驳进样阀及外部进样管路，所述左上行冷流道15上端通回至左贮存槽13下端，从而形成左贮存槽13——左上行热流道10——左下行热流道9——左检测槽11——左冷却洄流流道12——左下行冷流道14——左上行冷流道15——左贮存槽13的片内循环流道。
26.相对地，所述右贮存槽22上端连通右上行热流道19下端，右上行热流道19另一端连通右下行热流道18，其共端连通右出样管17下端，右出样管17上端贯通至流道层正面、接驳出样阀及外部出样管路，所述右下行热流道18下端连通右检测槽20上端，右检测槽20下端连通蛇形的右冷却洄流流道21上端，右冷却洄流流道21下端连通右下行冷流道23上端，右下行冷流道23另一端连通右上行冷流道24，其共端连通右进样管25上端，右进样管25下端贯通至流道层正面、接驳进样阀及外部进样管路，所述右上行冷流道24上端通回至右贮存槽22下端，从而形成右贮存槽22——右上行热流道19——右下行热流道18——右检测槽20——右冷却洄流流道21——右下行冷流道23——右上行冷流道24——右贮存槽22的片内循环流道，至此形成左、右两套对称且独立的流道系统。
27.所述基底层正面与流道层背面贴附，所述左光学检测区3的位置与左检测槽11的位置相重叠，右光学检测区4的位置与右检测槽20的位置相重叠，左控温加热片5的位置与左贮存槽13的位置相重叠，右控温加热片6的位置与右贮存槽22的位置相重叠，冷却片7的位置与左、右冷却洄流流道的位置相重叠。
28.所述基底层的主体为石英玻璃。
29.所述左、右光学检测区上的传感界面为均匀黄金薄膜，其厚度为50nm。
30.所述控温加热片为电阻式加热片与热电偶复合形成的可控温加热体。
31.所述冷却片为半导体冷却器。
32.所述流道层为聚甲基丙烯酸甲酯（pmma）。
33.所左、右独立循环流道系统之单组流道内容积均为189微升。
34.所述基底层与流道层以等离子清洗机处理贴合面后进行键合。
35.工作过程：首先，在所有阀门打开的状态下，通过进样管将微流控芯片全管路注满流体，而后关闭所有阀门，封闭流道，左、右两套独立循环流道系统以外部供电及控制系统各自通过独立的控温加热片控温加热，并共同一片半导体冷却片进行洄流冷却，则流体在不同温区形成密度差及重力的协同作用下在微流控管路系统内进行循环，实现片内流道系统中的流体热对流循环以及样品重复流经检测槽的需求。
36.实施例二一种用微流控芯片进行多核酸样本检测的方法，它是利用实施例一所述的一种用于分子循环吸附与连续光学检测的微流控芯片来进行多核酸样本检测的方法，其具体步骤为：（1）打开所有阀门，向左、右两套流道系统之微流道中分别注入200微升含0.5od的针对目标核酸的生物探针试剂。
37.（2）关闭所有阀门，启动左、右控温加热片及冷却片，通过控温加热片将温度控制在25摄氏度或45摄氏度或95摄氏度，保持90分钟或10分钟或1分钟后将生物探针分子充分修饰于传感界面之上。
38.（3）停止加热及冷却，打开所有阀门，向左、右两组微流道中分别注入800微升纯水清洗，结束后关闭所有阀门待机。
39.（4）使用纯水将所有待测样本分别配置成200微升溶液。
40.（5）打开所有阀门，将1号样品溶液注入左流道，将左流道中的纯水排出。
41.（6）关闭所有阀门，启动左控温加热片及冷却片，将流经左贮存槽的流体温度控制在25摄氏度或45摄氏度或70摄氏度，保持90分钟或5分钟或1分钟，期间调整测试光束正面照射于左光学检测区，并通过透射束的检测分析获取样品检测信息。
42.（7）打开所有阀门，将2号样品溶液注入右流道，同时向左流道注入清洗液，将左流道中样品液排出。
43.（8）关闭所有阀门，启动右控温加热片及冷却片，将流经右贮存槽的流体温度控制在25摄氏度或45摄氏度或70摄氏度，同时启动左控温加热片，将流经左贮存槽的流体温度控制在75摄氏度或85摄氏度或95摄氏度，保持90分钟或5分钟或1分钟，期间调整测试光束正面照射于右光学检测区，并通过透射束的检测分析获取样品2检测信息。
44.（9）打开所有阀门，将3号样品溶液注入左流道，将左流道中清洗液排出，同时向右
流道注入清洗液，将右流道中样品液排出。
45.（10）关闭所有阀门，启动左控温加热片及冷却片，将流经左贮存槽的流体温度控制在25摄氏度或45摄氏度或70摄氏度，同时启动右控温加热片，将流经右贮存槽的流体温度控制在75摄氏度或85摄氏度或95摄氏度，保持90分钟或5分钟或1分钟，期间调整测试光束正面照射于左光学检测区，并通过透射束的检测分析获取样品3检测信息。
46.（11）循环执行步骤（7）至步骤（10），直至所有样本溶液检测完成。
47.以上实施例仅为本发明的较佳实施例，本发明的结构与方法并不限于上述实施例列举的形式，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。