一种治疗糖尿病肾病的中药单体异荭草素的制作方法

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1.本发明属于中药技术领域，涉及一种治疗糖尿病肾病的中药单体异荭草素。


背景技术：

2.糖尿病肾病(dn)是糖尿病的主要微血管并发症之一，也是终末期肾病最常 见的病因之一。虽然dn的发病是有多种因素造成的，但越来越多的糖尿病患者 和动物模型显示，糖尿病肾病过程中足细胞的结构和功能异常，在糖尿病肾病的 肾损伤的发生发展中起着重要的作用。足细胞是一种高度分化及终末分化的上皮 细胞，在肾小球基底膜(gbm)的转运、肾小球滤过屏障的维持和肾小球滤过的调 节等方面发挥着重要作用。由于足细胞修复和再生能力有限
2.，足细胞损伤的程 度被认为是dn预后的主要决定因素。
3.目前，临床dn患者的治疗方案非常有限，主要包括严格控制血糖、低蛋白 饮食、使用血管紧张素ⅱ1型受体拮抗剂、血管紧张素ⅱ转换酶抑制剂等药物。 然而，现在仍然缺乏有效的治疗药物来保护足细胞。
4.当前中药医学在糖尿病及其并发症的防治中得到了广泛的应用，葫芦巴已经 被认为是治疗dn有效的药物，但是葫芦巴的单体对糖尿病肾病的作用还没有研 究，也没有任何公开文献报道。而作为葫芦巴的主要有效成分之一的异荭草素， 具有许多生物活性和治疗作用，包括抗炎、抗糖尿病、抗氧化和自噬诱导作用。 因此，了解异荭草素对足细胞的保护作用对于开发治疗dn的新药具有重要意 义。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，设计提供一种治疗糖尿病肾病 的中药单体-异荭草素，通过验证异荭草素减轻高糖所致足细胞损伤的假说及其 相关机制，发现异荭草素对治疗dn的潜在价值。
6.为了实现上述目的，本发明所述异荭草素的化学结构式为：
[0007][0008]
异荭草素是一种含有木犀草素结构的黄酮类化合物，广泛存在于苦菜、荞麦、西 番莲和葫芦巴等植物的药用或食用部位，分子式为c
21h20o11
，能用于治疗糖尿 病肾病。
[0009]
本发明与现有技术相比，采用中药单体异荭草素治疗糖尿病肾病，其疗效好， 无毒副作用，异荭草素来源广泛易得，成本低。
附图说明：
[0010]
图1为本发明所述异荭草素对糖尿病肾病小鼠肾功能的保护作用，其中a-d 分别
为内生肌酐清除率(ccr)、尿微量白蛋白与肌酐比值(acr)、血尿素氮(bun) 和血肌酐(scr)，图示说明异荭草素可明显改善肾小球滤过率，降低尿蛋白，改 善血尿素氮及血肌酐水平，对肾功能有明显的保护作用(*p《0.05，**p《0.01)， 其中肾小球滤过率以内生肌酐清除率表示，计算公式为：内生肌酐清除率(l/24 h)＝(尿肌酐浓度/血肌酐浓度)
×
24h尿量。
[0011]
图2为本发明所述糖尿病肾病模型肾组织结构的变化与异荭草素干预的保 护作用，其中(a)正常组(b)糖尿病肾病组(c)异荭草素低剂量组(d)异荭草素中 剂量组(e)异荭草素高剂量组，光镜下观察，糖尿病组小鼠系膜区基质增多部分 肾小管上皮细胞出现空泡变性，肾系膜区增宽较正常组更为显著，且肾间质出现 部分肾小管扩张，肾小管上皮细胞脱落再生；电镜下，糖尿病组小鼠肾小球基底 膜明显不均匀增厚，足突广泛融合，裂孔隔膜消失，足细胞线粒体数量减少，并 出现肿胀、空泡变、内部膜及嵴结构紊乱消失等病理改变，异荭草素治疗后上述 改变明显缓解。
[0012]
图3为本发明所述异荭草素可增强糖尿病肾病小鼠肾脏自噬蛋白表达，其中 a为用western blotting检测lc3和p62的蛋白表达结果，b为统计分析结 果，异荭草素治疗糖尿病肾病小鼠8周后，采用western blotting技术，发现治 疗组小鼠肾脏自噬蛋白较糖尿病肾病组小鼠明显增加，且随着剂量(0-40um) 的增加自噬逐渐增强，*p《0.05,**p《0.01。
[0013]
图4为本发明所述异荭草素保护对足细胞的保护作用，其中a足细胞暴露 于异荭草素(0、20、40、80、160和320)48h，用cck-8测定细胞活力足细胞 暴露于高糖中；(b)将足细胞细胞暴露于高糖中，异荭草素(10、20和40μm) 处理48h后，用cck-8法测定细胞活力，(c-d)用异荭草素(40μm)处理高糖 刺激后的足细胞48h，采用流式细胞技术(annexinv染色)评价细胞凋亡。
[0014]
图5为本发明所述异荭草素是一种自噬激活剂，其中a-b用高糖、异荭草 素(40μm)、3-ma处理表达gfp-lc3的mpc-5细胞，观察细胞中中lc3点 的共焦图像，比例尺：25μm，对每组100至150个细胞进行计数，并进行三个 独立实验；c-e用western blotting检测lc3和p62的蛋白表达。
[0015]
图6为本发明所述iso保护高糖刺激后的足细胞线粒体膜电位，其中a-b用 荧光探针jc-10染色法研究线粒体去极化，用绿色荧光检测线粒体去极化细胞， 定量为细胞总数的百分比，比例尺：50μm(数据表示为独立实验的平均
±
sem)， 多组比较采用单向方差分析，相对于hg组，**p《0.01。
[0016]
图7为本发明异荭草素通过增强足细胞线粒体自噬保护线粒体，其中a为 通过免疫荧光共聚焦显微镜获得高糖组、异荭草素(40μm)组和3-ma组足细 胞线粒体蛋白tom20和lc3蛋白的图像；b为lc3与tom20的共定位，对照 组平均共定位系数：0.58
±
0.03，高糖组平均共定位系数：0.13
±
0.06，异荭草素组 平均共定位系数：0.65
±
0.05，3-ma组平均共定位系数：0.22
±
0.03，比例尺为5μm， 共定位系数是2-3个独立实验的综合结果(n＝28-30个区域/组)；同时自噬蛋白 lc3和tom20的细胞内的点数及共定位点数在正常组、高糖组、异荭草素组及 3-ma组均有明显差异；c线粒体数量统计和点状lc3共定位的线粒体数量统 计，*p《0.05，**p《0.01，d为western blotting实验检测定位于线粒体外膜上的 蛋白tom20，发现自噬增强后，tom20表达减少，故异荭草素可通过增强线粒 体自噬保护线粒体，e为灰度值统计分析结果，修饰蛋白质组学分析发现iso干 预可以逆转高糖引起的tsc2 s939磷酸化水平异常，可能是其增强自噬活性的 原因
[0017]
图8为本发明所述修饰蛋白质组学聚类图(a、b)，a聚类图显示tsc2在 高糖组中磷酸化较正常组明显增多，而iso组中tsc2较高糖组明显减低。
[0018]
图9为本发明异荭草素使高糖刺激后nix蛋白表含量图，其中a为westernblotting检测nix表达图，统计分析结果图为b；c为rt-qpcr分析nixmrna，所用引物见d，**p《0.01。
具体实施方式：
[0019]
下面通过实施例并结合附图对本发明作进一步说明。
[0020]
实施例：
[0021]
本实施例先证实了高糖引起自噬耗竭，随后导致足细胞凋亡和线粒体损伤， 但异荭草素可以改变这一结果，再对自噬或线粒体自噬在mpc-5小鼠足细胞中 的作用进行实验研究，证实了其对dn的足细胞是一种保护因子，具体实验过程 为：
[0022]
(一)动物实验：
[0023]
(1)构建动物模型：选择雄性c57bl/6j，5～6周龄的小鼠，室温保持在 25士2℃，湿度保持在(55士5)％，小鼠自由进食，自由饮水，每天保持12h 的昼夜循环；开始实验前，小鼠正常饮食饮水，适应环境2周，将50只小鼠中 随机选取8含只作为正常对照组，其余42只小鼠，使用含量60％的高脂饲料喂 养小鼠4周后，连续腹腔注射5次小剂量(40mg/kg)链脲佐菌素(stz)，1 周后测小鼠随机血糖，随机血糖＞16.7mmol/l为小鼠糖尿病模型造模成功；继 续喂养小鼠2月后，测量小鼠尿微量蛋白/肌酐，尿蛋白微量/肌酐＞30mg/kg为 糖尿病肾病造模成功；
[0024]
(2)进行实验：将造模成功小鼠随机分为模型组、异荭草素：低剂量治疗 组(10mg/kg)、中剂量治疗组(20mg/kg)、高剂量治疗组(40mg/kg)，腹腔注射给 药；对于正常对照组和模型组，则每天一次接受等量溶剂(0.5％羧甲基纤维素 钠)，连续给药8周，在整个实验环节中，每日早晚观测每组小鼠全身状况，包 括一般情况、精神及毛发状况、排便排尿以及食水摄入的变化；在给药8周后， 再次使用代谢笼手机小鼠24尿，检测小鼠尿微量蛋白尿；在实验动物取材前注 射5％水合氯醛10m l/kg进行麻醉后，采用眼球取血法取血，室温静止4小时， 于4℃3000r
·
min-1离心15min，取上清，-80℃分装保存用于检测小鼠肾 功能；取血完毕后，迅速于大鼠腹腔内取出双侧肾脏，用4℃生理盐水冲洗血液， 再用滤纸吸干多余的生理盐水，快速称量并记录肾脏数据，将其中一侧肾脏储存 在液氮中，用于随后提取肾组织蛋白质进行western blot试验，检测lc3ii/lc3i、tsc2、mtor及nix等线粒体和自噬相关蛋白的检测；将另一侧肾 脏置于固定液4％的多聚甲醛溶液中，待之固定完成后石蜡包埋成蜡块，进行肾 组织he染色、免疫荧光及电镜等试验；实验结果表明：
[0025]
(1)异荭草素明显降低了糖尿病肾病小鼠的尿蛋白，并且明显改善了糖尿 病肾病小鼠的内生肌酐清除率及血肌酐、尿素氮等，对糖尿病肾病小鼠的肾功能 有明显的保护作用；
[0026]
(2)通过western blotting实验结果可见：糖尿病肾病小鼠肾脏自噬水平降 低，异荭草素可以逆转这一结果，且在0-40um的浓度内异荭草素对糖尿病肾病 小鼠的自噬增强作用是呈剂量依赖性的。同时，通过小鼠肾脏的免疫荧光结果可 见，异荭草素可使肾脏的自噬蛋白表达明显增多。故异荭草素通过增加糖尿病肾 病的肾脏自噬保护肾脏；
[0027]
(3)从小鼠肾脏的he染色和电镜结果看，光镜下观察，糖尿病组小鼠系 膜区基质增多部分肾小管上皮细胞出现空泡变性，肾系膜区增宽较正常组更为显 著，且肾间质出现部分肾小管扩张，肾小管上皮细胞脱落再生，电镜下，糖尿病 组小鼠肾小球基底膜明显不均匀增厚，足突广泛融合，裂孔隔膜消失，足细胞线 粒体数量减少，并出现肿胀、空泡变、内部膜及嵴结构紊乱消失等病理改变，异 荭草素治疗后上述改变明显缓解，由此可见，异荭草素对糖尿病肾病小鼠的肾脏 的病理结构及线粒体均有明显的保护作用。
[0028]
(二)细胞实验：
[0029]
(1)细胞培养：将mpc5细胞培养于含体积分数为10％胎牛血清的low dmem 培养液中，在37℃、含体积分数5％的co2培养箱中培养，
[0030]
(1-1)细胞传代
[0031]
待细胞增长至80％左右时，进行传代，方法:在无菌超净工作台中，弃掉旧 培养基，用pbs洗涤细胞2遍，0.25％胰蛋白酶37℃静置消化2min。倒置显 微镜观察细胞形态变化，当细胞发生皱缩变圆时，加入完全培养基终止消化，用 吸管将贴壁细胞轻轻完全吹打下来，再将消化下来的细胞悬液以1000r/min离 心5min,弃上清液，加入完全培养基，充分吹打成细胞悬液，按1:4传代至新 的培养瓶中，置于37℃、5％co2培养箱中继续培养；
[0032]
(1-2)细胞复苏
[0033]
①
根据“缓冻速溶”原则，在液氮中取出细胞冻存管，直接浸入37℃温水 内，并且不时摇动使其迅速解冻；
[0034]
②
从37℃水浴中取出冻存管，消毒管口，打开盖子，用吸管吸取细胞悬液 移入15ml离心管中，添加10倍以上新鲜培养基，轻轻混匀，1000r/min离心 5min；
[0035]
③
弃去上清液，加入含10％fbs的新鲜培养基重悬细胞，计数，调整细胞密 度，接种至合适的培养皿，放入37℃，5％co2培养箱中培养；
[0036]
(1-3)细胞冻存
[0037]
扩增细胞，将生长较好的细胞进行冻存：先配制dmso:fbs＝1:9的细胞冻存 液，将0.25％胰蛋白酶消化mpc5细胞3分钟，培养基终止消化，将细胞收集至 15ml离心管，1000r/min离心5min后丢弃上清，加入预先配置的细胞冻存液， 轻柔吹打重悬细胞，并计数，再将细胞悬液加入冻存管中，每管1ml左右，最 后将冻存管放入-80℃冰箱中48h，然后移至液氮中。
[0038]
(2)将获得的细胞进行分组：
①
正常糖浓度组(ng，5.5mmol/l)；
②
高糖(hg， 30mmol/l)；
③
高糖 异荭草素组(hg isoorientin)；
④
高糖 异荭草素 3-ma组 (hg isoorientin 3-ma)；
[0039]
(3)采用现有技术中的annexinv-fitcpi结合流式细胞仪检测各组细胞凋 亡(处理肾脏足细胞和肾小管上皮细胞分别于24小时，48小时和72小时)，其 结果如图4所示；
[0040]
(4)采用免疫荧光共聚焦技术检测细胞内自噬蛋白表达情况，检测线粒体 蛋白tom20与nix及lc3的共定位情况，其结果如图7所示；
[0041]
(5)修饰蛋白质组学(磷酸化)：筛选正常组、高糖组及异荭草素处理组等 10000多种蛋白质，检测在几组中均有显著性差异的磷酸化蛋白表达情况，其结 果如图8所示；
[0042]
(6)采用westernblot分别检测线粒体自噬相关蛋白pink1、parkin、nix、 lc3ⅱ/ⅰ、p62、beclin1等表达情况；
[0043]
(7)采用荧光定量pcr分别检测lc3、p62和nix的mrna表达，其结果如 图9所示；
[0044]
(8)采用jc-10检测线粒体膜电位(mtp)，其结果如图6所示；
[0045]
上述实验结果表明：(1)高糖刺激肾脏足细胞48小时后，足细胞的凋亡率 明显增加，而加入异荭草素后，凋亡率明显降低，说明异荭草素减少高糖所致足 细胞凋亡，对肾脏足细胞有明显的保护作用；(2)根据western blotting及足细 胞的免疫荧光结果，高糖刺激肾脏足细胞后，其自噬水平明显降低，异荭草素明 显逆转了这一现象，而在异荭草素中加入3-ma以后，又再次逆转了异荭草素 产生的效果，故异荭草素可明显改善增强高糖刺激的肾脏足细胞的自噬减少；
[0046]
(3)异荭草素可以减少高糖导致的足细胞线粒体膜电位损伤，而3-ma可以逆 转这一结果，说明异荭草素通过自噬减轻高糖导致的线粒体膜电位的损伤，保护 线粒体；(4)根据western blotting结果，异荭草素可使定位于线粒体外膜上的 与线粒体自噬相关的蛋白tom20，较高糖刺激时明显减少；另外异荭草素使得线 粒体自噬相关蛋白nix明显升高；同时，根据lc3和tom20的免疫荧光图可见， 异荭草素使lc3和tom20的共定位明显增加，故异荭草素可通过增强线粒体自 噬保护足细胞；(5)根据蛋白质修饰组学结果，正常组与对照组相比，tsc2第 939位与第1397位丝氨酸磷酸化在高糖处理的足细胞中显著增加，而在同时加 入iso的足细胞中，其磷酸化水平下降至接近正常细胞水平,这提示高糖情况下， tsc2 s939与s1397出现异常磷酸化，并能够被iso逆转，iso可以抑制高糖所 致akt的活性增高，故iso通过pi3k-akt-tsc2通路调节自噬。