一种鱼类脱钙骨基质及其制备方法与流程

1.本发明涉及一种脱钙骨基质及其制备方法，具体涉及鱼类脱钙骨基质及其制备方法，属于骨缺损修复材料技术领域。


背景技术：

2.每年因为创伤、疾病、感染等造成的多种类型的骨缺损患者数量一直居高不下，给患者自己以及家人都带来了诸多不便。如何能够在短时间内修复骨缺损并且恢复相应功能，是患者最大的诉求，也是广大医护工作者努力的方向。
3.目前，在临床上，自体骨移植一直被认为是骨修复的“金标准”，但取骨时造成的二次创伤和骨量不足等问题，影响了自体骨移植的广泛应用。因此，产生了很多不同材质、不同类型的骨修复产品，这些骨修复产品主要包括：由钛钽等金属材料和聚四氟乙烯等高分子材料制成的辅助固定、支撑、替代类产品，以及由无机材料和有机材料等制成的骨修复产品等。这些骨修复产品具有诱导成骨能力、可降解、生物安全性高，被广泛用于临床，解决了很多患者的实际问题。在这些骨修复产品中，胶原基的骨修复产品备受青睐，但因为宗教信仰以及人畜共患病等风险的存在，使得以动物胶原为基础的骨修复产品的应用范围受到限制。
4.生活于海洋和可控水域的鱼类，其生长环境干净无污染，到目前为止，尚未发现鱼类与人类之间有共患病，如果将鱼类制成胶原基的骨修复产品，既不会受宗教信仰的限制，并且在风险等级方面也远低于陆生哺乳动物。另外，研究发现，来源于鱼类的胶原蛋白具有与陆生哺乳动物胶原蛋白类似的成分和结构，在理化、生物学性能等方面相似，被认为是一个重要的胶原蛋白替代来源。
5.我国是一个水产大国，各种类型的水产品加工企业数量巨多，各企业加工水产品剩下的鱼骨一般被作为固体废弃物抛弃，或者是以低廉的价格销售给饲料生产企业用于饲料生产，附加值非常低。如果能够充分利用鱼类骨骼的特点，将其加工成具有一定空间结构的脱钙骨基质，用于骨缺损的修复，不仅能够获得一种理想的医用骨修复材料原料，而且还能显著提高鱼骨的附加值。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于：以鱼类骨骼为原料，通过脱杂质、脱细胞、脱钙等处理，提供一种可用于各种非承重骨缺损修复和承重骨缺损辅助修复的脱钙骨基质及其制备方法。
7.为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
8.一种鱼类脱钙骨基质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.(1)向反应釜中加入切割好的鱼骨和质量浓度为9％的氯化钠溶液，4℃搅拌8h后去除氯化钠溶液；
10.(2)向反应釜中加入质量浓度为1％的sds溶液，4℃搅拌8h后去除sds溶液，并用纯水反复清洗鱼骨三次；
11.(3)向反应釜中加入丙三醇，4℃搅拌8h后过滤回收丙三醇，并用纯水清洗鱼骨一次；
12.(4)向反应釜中加入质量浓度为30％的过氧化氢溶液，37℃搅拌8h后去除过氧化氢溶液，并用纯水清洗鱼骨一次；
13.(5)向反应釜中加入无水乙醚，4℃搅拌8h后过滤回收乙醚；
14.(6)向反应釜中加入质量浓度为5％的蛋白酶溶液，4℃搅拌0.5h后快速去除蛋白酶溶液，并用纯水清洗鱼骨一次；
15.(7)向反应釜中加入无水乙醇，对鱼骨进行脱水处理，然后去除无水乙醇；
16.(8)将脱水后的鱼骨从反应釜中取出，冷冻干燥，获得鱼类脱钙骨基质。
17.优选的，在步骤(1)中，所述切割好的鱼骨呈方块状，边长0.1cm～0.5cm，入反应釜之前纯水漂洗三次。
18.优选的，在步骤(1)中，所述氯化钠溶液的用量为：每1kg鱼骨添加100l氯化钠溶液。
19.优选的，在步骤(2)中，所述sds溶液的用量为：每1kg鱼骨添加100l sds溶液。
20.优选的，在步骤(3)中，所述丙三醇的用量为：每1kg鱼骨添加100l丙三醇。
21.优选的，在步骤(4)中，所述过氧化氢溶液的用量为：每1kg鱼骨添加100l过氧化氢溶液。
22.优选的，在步骤(5)中，所述无水乙醚的用量为：每1kg鱼骨添加100l无水乙醚。
23.优选的，在步骤(6)中，所述蛋白酶溶液的用量为：每1kg鱼骨添加100l蛋白酶溶液。
24.优选的，在步骤(7)中，所述无水乙醇的用量为：每1kg鱼骨添加20l无水乙醇。
25.一种鱼类脱钙骨基质，其特征在于，由前述的制备方法制备而来。
26.本发明的有益之处在于：
27.1、本发明提供的制备鱼类脱钙骨基质的方法，整个反应过程在同一个反应釜中完成，省时、省力的同时，确保了制备得到的脱钙骨基质不被外界其他杂质污染；
28.2、本发明制备得到的鱼类脱钙骨基质，完好的保留了鱼骨骨骼的空间结构，具有良好的生物相容性、生物降解性和骨修复能力，并且经粉碎、重塑后获得的产品机械强度好，可用于各种非承重骨缺损修复和承重骨缺损辅助修复；
29.3、本发明制备得到的鱼类脱钙骨基质，可有效避免人畜共患病的风险；
30.4、本发明制备得到的鱼类脱钙骨基质，价格低廉，具有良好的市场应用前景。
附图说明
31.图1是用大马哈鱼的脊椎骨制成的鱼类脱钙骨基质；
32.图2是由图1中的鱼类脱钙骨基质粉碎得到的鱼类脱钙骨基质粉末；
33.图3是由图2中的粉末重塑得到的可直接应用在临床上的骨修复产品；
34.图4是图1中的鱼类脱钙骨基质的50倍扫描电镜图；
35.图5是图1中的鱼类脱钙骨基质的500倍扫描电镜图；
36.图6是图1中的鱼类脱钙骨基质的1000倍扫描电镜图；
37.图7是图1中的鱼类脱钙骨基质的5000倍扫描电镜图；
38.图8是图1中的鱼类脱钙骨基质的红外光谱扫描图；
39.图9是图1中的鱼类脱钙骨基质的热重分析图；
40.图10是图1中的鱼类脱钙骨基质的细胞毒性检测结果图；
41.图11是图1中的鱼类脱钙骨基质的溶血测试结果图；
42.图12是图1中的鱼类脱钙骨基质的热原测试结果图；
43.图13是图1中的鱼类脱钙骨基质经粉碎、重塑后获得的产品的机械强度的检测结果图；
44.图14是图1中的鱼类脱钙骨基质和牛脱钙骨基质分别植入皮下7d、14d和21d后得到的he染色图。
具体实施方式
45.鱼骨以iii型胶原蛋白为主，鱼骨周围有鱼肉组织，鱼骨内部有细胞和钙质等，完好保留鱼骨骨骼的空间结构，同时去除鱼肉组织、细胞和钙质等，再去掉免疫原性，即可制备成类似于市售的陆生动物的脱钙骨基质。
46.以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
47.一、制备鱼类脱钙骨基质
48.以新鲜的大马哈鱼脊椎骨为原料，使用切割机将新鲜的鱼骨切割成边长为0.1cm～0.5cm的方块，用适量纯水漂洗三次，沥去水，称取1kg切割好的鱼骨，置于反应釜中，后续在反应釜中依次进行如下工艺处理流程：
49.1、向反应釜中加入100l质量浓度为9％的氯化钠溶液，4℃搅拌8h后去除氯化钠溶液；
50.2、向反应釜中加入100l质量浓度为1％的sds溶液，4℃搅拌8h后去除sds溶液，并用纯水反复清洗鱼骨三次；
51.3、向反应釜中加入100l丙三醇，4℃搅拌8h后过滤回收丙三醇，并用纯水清洗鱼骨一次；
52.4、向反应釜中加入100l质量浓度为30％的过氧化氢溶液，37℃搅拌8h后去除过氧化氢溶液，并用纯水清洗鱼骨一次；
53.5、向反应釜中加入100l无水乙醚，4℃搅拌8h后过滤回收乙醚；
54.6、向反应釜中加入100l质量浓度为0.5％的蛋白酶溶液，4℃搅拌0.5h后快速去除蛋白酶溶液，并用纯水清洗鱼骨一次；
55.7、向反应釜中加入20l无水乙醇，对鱼骨进行脱水处理，然后去除无水乙醇；
56.8、将脱水后的鱼骨从反应釜中取出，冷冻干燥，获得鱼类脱钙骨基质。
57.二、观察鱼类脱钙骨基质的结构
58.1、直观观察
59.本发明制备得到的鱼类脱钙骨基质，其外观如图1所示，呈乳白色，保留了鱼骨的完整结构，无杂质。
60.将该鱼类脱钙骨基质粉碎后，得到如图2所示的粉末，该粉末呈乳白色，无杂质。
61.将图2所示的粉末重塑后，得到如图3所示的可直接应用于临床上的骨修复产品，该骨修复产品呈乳白色，表面细腻，无杂质。
62.2、电镜扫描
63.对本发明制备得到的鱼类脱钙骨基质进行电镜扫描，其在50倍、500倍、1000倍以及5000倍下的扫描电镜图分别见图4、图5、图6和图7。
64.由图4、图5、图6和图7可知：本发明制备得到的鱼类脱钙骨基质保留了鱼骨骨骼的空间结构。
65.3、红外光谱扫描
66.对本发明制备得到的鱼类脱钙骨基质进行红外光谱扫描，扫描结果见图8。
67.由图8可知：本发明制备得到的鱼类脱钙骨基质具有胶原蛋白的所有特征吸收峰，并且纯度较高。
68.4、孔隙率
69.通过溶胀方法，计算本发明制备得到的鱼类脱钙骨基质的孔隙率。
70.经计算，该鱼类脱钙骨基质的孔隙率为46.65
±
2.00％，可见其具有良好的空间结构，可为细胞爬行、生长提供支架。
71.三、检测鱼类脱钙骨基质的热稳定性
72.对本发明制备得到的鱼类脱钙骨基质进行热重分析，分析结果见图9。
73.由图9可知：本发明制备得到的鱼类脱钙骨基质热稳定性良好，适合植入体内使用。
74.四、细胞毒性实验
75.实验过程具体如下：
76.(1)在37℃下，用细胞培养基浸泡鱼类脱钙骨基质24h，得到鱼类脱钙骨基质浸提液；
77.(2)将l929细胞培养至对数生长期，然后加入到96孔板中，正常培养2d；
78.(3)用鱼类脱钙骨基质浸提液全部替换掉细胞培养基(100％浸提液)或部分替换掉细胞培养基(25％浸提液、50％浸提液、75％浸提液)；
79.(4)培养7d后，用细胞增殖率检测试剂盒检测细胞增殖率，进而判断细胞毒性。
80.实验结果见图10。
81.由图10可知：100％浸提液组的细胞增殖率大于95％，按细胞毒性评价标准，细胞毒性等级为0，即无细胞毒性。
82.五、溶血实验
83.实验过程具体如下：
84.(1)在37℃下，用生理盐水浸泡鱼类脱钙骨基质24h，获得鱼类脱钙骨基质浸提液；
85.(2)取大鼠新鲜血液3ml，加入抗凝剂，等量分装到三只10ml离心管中；
86.(3)向三只离心管中分别加入5ml蒸馏水、5ml生理盐水和5ml鱼类脱钙骨基质浸提液；
87.(4)37℃反应30min后离心，观察上清液的颜色，判断是否发生红细胞溶胀破裂现象。
88.实验结果见图11。
89.由图11可知：加入鱼类脱钙骨基质浸提液和生理盐水的血液均未出现红细胞溶胀破裂，即均无溶血现象。
90.六、热原实验
91.实验过程具体如下：
92.(1)在37℃下，用生理盐水浸泡鱼类脱钙骨基质24h，获得鱼类脱钙骨基质浸提液；
93.(2)将鱼类脱钙骨基质浸提液静脉注射入新西兰大白兔体内，实时监测大白兔的体温3h。
94.实验结果见图12。
95.由图12可知：注射完鱼类脱钙骨基质浸提液之后，大白兔体温无明显变化，说明本发明制备得到的鱼类脱钙骨基质无热原。
96.七、检测由鱼类脱钙骨基质粉碎、重塑后获得的产品的机械强度检测过程具体如下：
97.将本发明制备得到的鱼类脱钙骨基质粉碎并重塑成直径为0.3cm、高度为0.3cm的圆柱体，然后使用万能测试机以0.5mm/s的速度进行抗压强度测试。
98.检测结果见图13。
99.由图13可知：本发明制备得到的鱼类脱钙骨基质经粉碎、重塑后获得的产品机械强度好，这为重塑产品能够用于各种非承重骨缺损修复和承重骨缺损辅助修复奠定了基础。
100.八、皮下植入实验
101.实验过程具体如下：
102.(1)在大鼠背部切开0.5cm长的伤口；
103.(2)将本发明制备得到的鱼类脱钙骨基质和从市面上购买来的牛脱钙骨基质分别植入到大鼠的皮肤与肌肉筋膜层之间；
104.(3)7d后、14d后和21d后处死大鼠，并进行常规he染色，观察植入部位有无感染、红肿等免疫反应，以及鱼类脱钙骨基质和牛脱钙骨基质的降解情况。
105.实验结果见图14。
106.由图14可知：在第7d，植入鱼类脱钙骨基质的大鼠和植入牛脱钙骨基质的大鼠，在植入部位都出现了不少炎性细胞；在第14d，植入鱼类脱钙骨基质的大鼠和植入牛脱钙骨基质的大鼠，植入部位的炎性细胞均消失，植入的鱼类脱钙骨基质和牛脱钙骨基质均被纤维组织包裹，并开始降解；在第21d，植入的鱼类脱钙骨基质60％以上被降解，植入的牛脱钙骨基质60％以上未降解；在整个过程中，植入鱼类脱钙骨基质的大鼠和植入牛脱钙骨基质的大鼠，都未出现任何感染症状。
107.由此说明，植入的鱼类脱钙骨基质和牛脱钙骨基质均具有良好的生物相容性和一定的生物降解性能。
108.需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。