防止和去除牙周生物膜的含水解酶和聚谷氨酸的组合物的制作方法

1.本发明涉及用于防止和去除形成在口腔牙周生物膜的含聚谷氨酸和水解酶的组合物。


背景技术：

2.生物膜（biofilm）是绝大多数细菌黏附聚焦在固体表面形成的一种膜结构的方式。生物膜对宿主防御系统具有较强的抵抗力，对抗生素敏感性低，对人体致病能力大大高于浮游状态细菌。
3.口腔是人体四大菌库之一，口腔内细菌种类多，数量高，而这些细菌大部分以生物膜的形式黏附存在于牙齿、牙龈、口腔黏膜的表面或内部，以前常称之为牙菌斑。
4.如何去除生物膜一直是口腔医学的关注点之一。临床上通常采用机械物理的方法控制口腔牙周生物膜，严重时也采用抗生素给予治疗。
5.由于生物膜对于各种抗生素都存在敏感性降低的情况，于是医学工作者把目光投向了酶。单独或者联合运用多种酶，特别是水解酶类，可以有效地防止和去除口腔牙周生物膜。单独应用一种或联合应用多种水解酶类来防止和除去形成在口腔牙周生物膜，已成为常用的技术。
6.专利（申请号：200380102321.2、200880121578.5、200780026850.7）涉及采用单一酶或酶混合物的溶液防止和去除生物膜的方法。然而实践中我们发现由于某些商品化酶成本较高，应用受到了限制。


技术实现要素：

7.为了解决某些酶及其组合物的成本问题，发明人通过大量试验后在单一水解酶或水解酶混合物中加入了聚谷氨酸作为增效剂的方法，提高单位质量水解酶或水解酶组合物效果的同时，有效地降低了单一水解酶或水解酶组合物的用量，从而较好地解决了成本问题。
8.本发明所述的单一水解酶，选取自糖苷酶、肽酶（蛋白酶）、酯酶中的一种。
9.本发明所述的水解酶组合物，选取自糖苷酶、肽酶（蛋白酶）、酯酶的至少两种或两种以上，形成组合物。
10.含聚谷氨酸和水解酶组合物被用于防止或去除生物膜。
11.本发明所述的聚谷氨酸英文名称为γ-poly-glutamic acid，简称γ-pga，是一种水溶性，生物降解，不含毒性，使用微生物发酵法制得的生物高分子。聚谷氨酸是一种特殊的阴离子自然聚合物，是以α-胺基（α-amino）和γ-羧基（γ-carboxyl）之间经酰胺键结所构成的同型聚酰胺，分子量在5万到2百万道尔顿之间。为γ-（d，l）-pga, γ-（d）-pga, 和γ-（l）-pga等的统称。
12.本发明所述的聚谷氨酸由微生物，特别是枯草芽胞杆菌（bacillus subtilis）发酵制得，优先选择枯草芽胞杆菌纳豆变种（bacillus subtilis var. natto）发酵制得的聚
谷氨酸。
13.本发明所述的聚谷氨酸包括γ-pga的钠盐或钙盐等一价或二价盐，如γ-聚谷氨酸钠、γ-聚谷氨酸钾、γ-聚谷氨酸钙、γ-聚谷氨酸锌等。
14.本发明所述聚谷氨酸的用量为0.1%~10%之间，优选0.2%~2%。
15.本发明所述糖苷酶选自α-淀粉酶（α-amylase，ec3.2.1.1）、 β-淀粉酶（β-amylase，ec3.2.1.2）、葡聚糖1,4-α-葡萄糖苷酶（glucan1,4-a-glucosidase，ec3.2.1.3）、纤维素酶（cellulase，ec3.2.1.4）、内-1,3（4）
‑ꢀ
β-葡聚糖酶 （endo-1,3（4）
‑ꢀ
β-glucanase，ec3.2.1.6）、菊粉酶（inulinase，ec3.2.1.7）、内-1,4-β-木聚糖酶（endo-1,4-β-xylanase，ec3.2.1.8）、寡-1,6-糖苷酶（oligo-1,6-glucosidase，ec3.2.1.10）、葡聚糖酶（dextranase，ec3.2.1.11）、壳多糖酶（chitinase，ec3.2.1.14）、聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，ec3.2.1.15）、溶菌酶（lysozyme，ec3.2.1.17）、外-α-唾液酶（exo-α-sialidase，ec3.2.1.18）、α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，ec3.2.1.20）、β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，ec3.2.1.21）、α-半乳糖苷酶（α-galactosidase，ec3.2.1.22）、β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，ec3.2.1.23）、α-甘露糖苷酶（α-mannosidase，ec3.2.1.24）、β-甘露糖苷酶（β-mannosidase，ec3.2.1.25）、β-呋喃果糖苷酶（β-fructofuranosidase，ec3.2.1.26）、α, α-海藻糖酶（α, α-trehalase，ec3.2.1.28）、β-葡糖醛酸糖苷酶（β-glucuronidase，ec3.2.1.31）、透明质酸氨基葡糖苷酶（hyaluronoglucosaminidase，ec3.2.1.35）、透明质酸葡糖苷酸酶（hyaluronoglucuronidase，ec3.2.1.36）、支链淀粉酶（pullulanase，ec3.2.1.41）、岩藻多糖酶（fucoidanase，ec3.2.1.44）、环麦芽糖糊精酶（cyclomaltodextrinase，ec3.2.1.54）、异支链淀粉酶（isopullulanase，ec3.2.1.57）、霉菌葡聚糖酶（mycodextranase，ec3.2.1.61）、果聚醣酶（levanase, ec3.2.1.65）、槲皮苷酶（quercitrinase，ec3.2.1.66）、异淀粉酶（isoamylase，ec3.2.1.68）、β-琼脂酶（β-agarase，ec3.2.1.81）、乳糖酶（lactase，ec3.2.1.108）、α-葡糖醛酸糖苷酶（α-glucuronidase，ec3.2.1.139）、α-琼脂酶（α-agarase，ec3.2.1.158）。
16.本发明所述糖苷酶优先选自α-淀粉酶（α-amylase，ec3.2.1.1）、 β-淀粉酶（β-amylase，ec3.2.1.2）、纤维素酶（cellulase，ec3.2.1.4）、葡聚糖酶（dextranase，ec3.2.1.11）、壳多糖酶（chitinase，ec3.2.1.14）、溶菌酶（lysozyme，ec3.2.1.17）、外-α-唾液酶（exo-α-sialidase，ec3.2.1.18）、α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，ec3.2.1.20）、β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，ec3.2.1.21）、α-半乳糖苷酶（α-galactosidase，ec3.2.1.22）、β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，ec3.2.1.23）、α-甘露糖苷酶（α-mannosidase，ec3.2.1.24）、β-甘露糖苷酶（β-mannosidase，ec3.2.1.25）、支链淀粉酶（pullulanase，ec3.2.1.41）、异支链淀粉酶（isopullulanase，ec3.2.1.57）、果聚醣酶（levanase, ec3.2.1.65）、异淀粉酶（isoamylase，ec3.2.1.68）、乳糖酶（lactase，ec3.2.1.108）、α-葡糖醛酸糖苷酶（α-glucuronidase，ec3.2.1.139）、α-琼脂酶（α-agarase，ec3.2.1.158）。
17.本发明所述肽酶（蛋白酶）选自枯草杆菌蛋白酶（subtilisin，ec 3.4.21.62）、舍雷肽酶（serralysin，ec 3.4.24.40）、胰蛋白酶（trypsin，ec 3.4.21.4）。
18.本发明所述酯酶选自羧酸酯酶（carboxylesterase，ec3.1.1.1）、芳（香）基酯酶（arylesterase，ec3.1.1.2）、三酰基甘油脂酶（triacylglycerollipase，ec3.1.1.3）、磷脂
酶a2（phospholipase a2，ec3.1.1.4）、溶血磷脂酶（lysophospholipase，ec3.1.1.5）、乙酰酯酶（acetylesterase，ec3.1.1.6）、葡萄糖酸内酯酶（gluconolactonase，ec3.1.1.17）、磷脂酶a1（phospholipase a1，ec3.1.1.32）、脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，ec3.1.1.34）、α-氨基酸酯酶（α-amino-acid esterase，ec3.1.1.43）、乙酰木聚糖酯酶（acetylxylan esterase，ec3.1.1.72）、角质酶（cutinase，ec3.1.1.74）、碱性磷酸酯酶（alkaline phosphatase，ec3.1.3.1）、酸性磷酸酯酶（acid phosphatase，ec3.1.3.2）、核苷酸酶（nucleotidase ，ec3.1.3.31）、磷脂酶c（phospholipase c，ec3.1.4.3）、磷脂酶d（phospholipase d，ec3.1.4.4）。
19.本发明所述酯酶优先选自羧酸酯酶（carboxylesterase，ec3.1.1.1）、磷脂酶a2（phospholipase a2，ec3.1.1.4）、溶血磷脂酶（lysophospholipase，ec3.1.1.5）、磷脂酶a1（phospholipase a1，ec3.1.1.32）、脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，ec3.1.1.34）、α-氨基酸酯酶（α-amino-acid esterase，ec3.1.1.43）、角质酶（cutinase，ec3.1.1.74）、碱性磷酸酯酶（alkaline phosphatase，ec3.1.3.1）、酸性磷酸酯酶（acid phosphatase，ec3.1.3.2）、核苷酸酶（nucleotidase ，ec3.1.3.31）、磷脂酶c（phospholipase c，ec3.1.4.3）、磷脂酶d（phospholipase d，ec3.1.4.4）。
20.在本发明的第一个实施例中，本发明采用牙周炎常见菌种，如具核梭杆菌多形亚种、黏放线菌、伴放线聚集杆菌、牙龈卟啉单胞菌培养后建立生物膜，上述菌种可通过中国普通微生物菌种保藏管理中心或中国工业微生物菌种保藏管理中心获得。
21.在本发明的第二个实施例中，生物膜建立后，通过对比本发明所述不同用量水解酶组合物在增加或者不增加聚谷氨酸处理后，加入荧光染料液后培养后，在激光共聚焦扫描显微镜下扫描，通过nis-elements ar analysis软件对生物膜进行三维重建，量化胞外聚合物（eps），取平均值。其中，胞外聚合物是生物膜形成过程中由微生物产生的，导致生物膜内细菌致病性增强的基础物质，在改变生物膜中微生物行为，毒力及耐药性等方面发挥着至关重要的作用，测定eps可以评价生物膜的致病性，进而反映牙周疾病的进展。
22.在本发明的第三个实施例中，采用spss统计软件，对各组eps总量进行统计分析，判断加入聚谷氨酸后的效果。结果表明，0.01%水解酶组合物 0.5%聚谷氨酸优于0.02%水解酶组合物，说明加入聚谷氨酸后可以显著降低水解酶组合物的用量，而且表现出更佳地去除生物膜的效果。
23.在本发明第四个实施例中，我们依据实施例1、实施例2、实施例3的方法，通过大量试验，列举了本发明有效的聚谷氨酸和单一水解酶或水解酶的组合物。
24.本发明的聚谷氨酸和水解酶或水解酶组合物以防止或有效除去生物膜的量被加入到生物膜中。精确的剂量对于本发明不是关键的，并且可以进行调整，取决待处理的口腔牙周生物膜的性质。所使用的酶量可达0.01 %的总量，并且在一些情况下，可达10%的总量。
25.应用本发明时，将所述组合物应用到口腔牙周表面上的生物膜一段时间，所述一段时间足以使胞外聚合物（eps）水平显著下降。
26.本发明所述酶的命名引用自国际生物化学和分子生物学术语委员会（nomenclature committee of the international union of biochemistry and molecular biology）（2019年3月版本）。
具体实施方式
27.实施例1牙周炎相关多菌种生物膜的建立。取具核梭杆菌多形亚种、黏放线菌、伴放线聚集杆菌、牙龈卟啉单胞菌冻存液，分别复苏至对数期，调整各菌液浓度至1
×
108cfu/ml，将4种菌液等比例混合，振荡混匀，形成混合菌液。
28.在避光条件下，将已预处理的无菌盖玻片放入无菌6孔板内，加入200μl混合菌液，1.8ml新鲜无菌bhi液体培养基（含质量分数1%的蔗糖，体积分数1%的氯化血红素-维生素k1溶液，体积分数1
‰
的alexafluor
tm
647荧光染液），37℃厌氧培养（80%n2,10%co2,10%h2），隔天换液，培养48小时。
29.48小时后，避光条件下取出6孔板，无菌蒸馏水洗涤 3 次，加入200μl活菌荧光染液，37℃培养箱内厌氧条件下（80%n2,10%co2,10%h2）静置15min。取出6孔板，无菌蒸馏水洗涤3次。自然晾干后，载玻片上滴200μl抗荧光淬灭剂，将盖玻片倒置于载玻片上，封片送检。
30.实施例2通过激光共聚焦扫描显微镜（clsm）观察酶溶液对牙周炎相关多菌种生物膜胞外聚合物的作用。
31.取实施例1中制备的牙周炎相关多菌种生物膜，按以下方式进行试验。
32.（1）酶溶液现配现用，实验前将酶溶液置于37℃水浴锅预热30min。
33.（2）分组如下：a组为空白对照：无菌蒸馏水；b组为0.02%酶组合物（α-淀粉酶、枯草蛋白酶、脂肪酶、内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶）水溶液，c组为含0.5%聚谷氨酸和0.01%酶组合物（α-淀粉酶、枯草蛋白酶、脂肪酶、内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶）的水溶液。
34.上述酶组合物的来源如下：α-淀粉酶从地衣芽孢杆菌中提取；枯草蛋白酶从枯草芽孢杆菌中提取；内切葡聚糖酶由芽孢杆菌中提取；脂肪酶由细毛嗜热霉中提取；甘露聚糖酶为β-甘露聚糖酶。
35.聚谷氨酸由枯草芽胞杆菌（bacillus subtilis）发酵制得，分子量约为70万道尔顿。
36.（3）避光条件下将按实施例1制备好的生物膜取出，无菌蒸馏水洗涤3次。按上述实验分组处理结束后，用无菌蒸馏水洗涤3次，加入200μl活菌syto9荧光染液（syto9与蒸馏水的比例为1.5μl：1ml），37℃培养箱内厌氧条件下（80%n2,10%co2,10%h2）静置15min。取出6孔板，无菌蒸馏水洗涤3次。自然晾干后，在载玻片上滴 200μl 抗荧光淬灭剂，将盖玻片倒置于载玻片上，封片送检。
37.（4）每个样本随机取3个区，实验重复3次。alexa fluor
tm
647荧光染液激发/发射波长为650/668nm，syto9绿色荧光核酸染料激发/发射波长为 480/500nm。在激光共聚焦扫描显微镜下扫描，通过nis-elements ar analysis软件对生物膜进行三维重建，量化胞外聚合物（eps），取平均值。
38.实施例3统计学分析及结果：采用spss统计软件，对各组eps总量进行正态假设检验。结果显示，数据符合正态分布，根据统计学要求按照计量资料进行分析。各组eps总量以均数
±
标准差表示，进行方差齐性检验，结果显示方差齐，通过两个独立样本-t检验进行组间两两比较，采用单因素方
差分析比较实验组组内eps总量，p＜0.05，表示有统计学意义。
39.表1空白对照组与各处理组 eps 总量的比较（χ
±
s,n=3）*表示与空白组相比，差异有统计学意义（p＜0.05）；**表示与 0.02%酶组合物组相比，差异有统计学意义（p＜0.05）。
40.以上结果表明，在酶组合物中增加了聚谷氨酸后，可以有效降低酶组合物的用量，而且防止或有效去除生物膜效果更佳。
41.实施例4采用实施例1、2、3的方法，本发明经过试验确认有效的聚谷氨酸和水解酶的组合物至少包括以下组合。
42.（1）聚谷氨酸、α-淀粉酶（α-amylase，ec3.2.1.1）（2）聚谷氨酸、 β-淀粉酶（β-amylase，ec3.2.1.2）（3）聚谷氨酸、纤维素酶（cellulase，ec3.2.1.4）（4）聚谷氨酸、葡聚糖酶（dextranase，ec3.2.1.11）（5）聚谷氨酸、溶菌酶（lysozyme，ec3.2.1.17）（6）聚谷氨酸、葡聚糖1,4-α-葡萄糖苷酶（glucan1,4-a-glucosidase，ec3.2.1.3）（7）聚谷氨酸、内-1,3（4）
‑ꢀ
β-葡聚糖酶 （endo-1,3（4）
‑ꢀ
β-glucanase，ec3.2.1.6）（8）聚谷氨酸、菊粉酶（inulinase，ec3.2.1.7）（9）聚谷氨酸、内-1,4-β-木聚糖酶（endo-1,4-β-xylanase，ec3.2.1.8）（10）聚谷氨酸、寡-1,6-糖苷酶（oligo-1,6-glucosidase，ec3.2.1.10）（11）聚谷氨酸、壳多糖酶（chitinase，ec3.2.1.14）（12）聚谷氨酸、聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，ec3.2.1.15）（13）聚谷氨酸、外-α-唾液酶（exo-α-sialidase，ec3.2.1.18）（14）聚谷氨酸、α-半乳糖苷酶（α-galactosidase，ec3.2.1.22）（15）聚谷氨酸、β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，ec3.2.1.23）（16）聚谷氨酸、β-呋喃果糖苷酶（β-fructofuranosidase，ec3.2.1.26）（17）聚谷氨酸、α, α-海藻糖酶（α, α-trehalase，ec3.2.1.28）（18）聚谷氨酸、β-葡糖醛酸糖苷酶（β-glucuronidase，ec3.2.1.31）（19）聚谷氨酸、透明质酸氨基葡糖苷酶（hyaluronoglucosaminidase，ec3.2.1.35）（20）聚谷氨酸、透明质酸葡糖苷酸酶（hyaluronoglucuronidase，ec3.2.1.36）（21）聚谷氨酸、岩藻多糖酶（fucoidanase，ec3.2.1.44）（22）聚谷氨酸、环麦芽糖糊精酶（cyclomaltodextrinase，ec3.2.1.54）
（23）聚谷氨酸、霉菌葡聚糖酶（mycodextranase，ec3.2.1.61）（24）聚谷氨酸、果聚醣酶（levanase, ec3.2.1.65）（25）聚谷氨酸、槲皮苷酶（quercitrinase，ec3.2.1.66）（26）聚谷氨酸、异淀粉酶（isoamylase，ec3.2.1.68）（27）聚谷氨酸、β-琼脂酶（β-agarase，ec3.2.1.81）（28）聚谷氨酸、乳糖酶（lactase，ec3.2.1.108）（29）聚谷氨酸、α-葡糖醛酸糖苷酶（α-glucuronidase，ec3.2.1.139）（30）聚谷氨酸、α-琼脂酶（α-agarase，ec3.2.1.158）（31）聚谷氨酸、α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，ec3.2.1.20）（32）聚谷氨酸、β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，ec3.2.1.21）（33）聚谷氨酸、α-甘露糖苷酶（α-mannosidase，ec3.2.1.24）（34）聚谷氨酸、β-甘露糖苷酶（β-mannosidase，ec3.2.1.25）（35）聚谷氨酸、支链淀粉酶（pullulanase，ec3.2.1.41）（36）聚谷氨酸、异支链淀粉酶（isopullulanase，ec3.2.1.57）（37）聚谷氨酸、枯草杆菌蛋白酶（subtilisin，ec 3.4.21.62）（38）聚谷氨酸、舍雷肽酶（serralysin，ec 3.4.24.40）（39）聚谷氨酸、羧酸酯酶（carboxylesterase，ec3.1.1.1）（40）聚谷氨酸、磷脂酶a2（phospholipase a2，ec3.1.1.4）（41）聚谷氨酸、溶血磷脂酶（lysophospholipase，ec3.1.1.5）（42）聚谷氨酸、磷脂酶a1（phospholipase a1，ec3.1.1.32）（43）聚谷氨酸、角质酶（cutinase，ec3.1.1.74）（44）聚谷氨酸、羧酸酯酶（carboxylesterase，ec3.1.1.1）（45）聚谷氨酸、芳（香）基酯酶（arylesterase，ec3.1.1.2）（46）聚谷氨酸、三酰基甘油脂酶（triacylglycerollipase，ec3.1.1.3）（47）聚谷氨酸、乙酰酯酶（acetylesterase，ec3.1.1.6）（48）聚谷氨酸、葡萄糖酸内酯酶（gluconolactonase，ec3.1.1.17）（49）聚谷氨酸、脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，ec3.1.1.34）（50）聚谷氨酸、α-氨基酸酯酶（α-amino-acid esterase，ec3.1.1.43）（51）聚谷氨酸、乙酰木聚糖酯酶（acetylxylan esterase，ec3.1.1.72）（52）聚谷氨酸、碱性磷酸酯酶（alkaline phosphatase，ec3.1.3.1）（53）聚谷氨酸、酸性磷酸酯酶（acid phosphatase，ec3.1.3.2）（54）聚谷氨酸、核苷酸酶（nucleotidase ，ec3.1.3.31）（55）聚谷氨酸、磷脂酶c（phospholipase c，ec3.1.4.3）（56）聚谷氨酸、磷脂酶d（phospholipase d，ec3.1.4.4）（57）聚谷氨酸、α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，ec3.2.1.20）、β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，ec3.2.1.21）（58）聚谷氨酸、支链淀粉酶（pullulanase，ec3.2.1.41）、异淀粉酶（isoamylase，ec3.2.1.68）（59）聚谷氨酸、α-淀粉酶（α-amylase，ec3.2.1.1）、 β-淀粉酶（β-amylase，
ec3.2.1.2） （60）聚谷氨酸、纤维素酶（cellulase，ec3.2.1.4）、葡聚糖酶（dextranase，ec3.2.1.11）（61）聚谷氨酸、葡聚糖酶（dextranase，ec3.2.1.11）、磷脂酶a1（phospholipase a1，ec3.1.1.32）、磷脂酶a2（phospholipase a2，ec3.1.1.4）（62）聚谷氨酸、枯草杆菌蛋白酶（subtilisin，ec 3.4.21.62）、α-淀粉酶（α-amylase，ec3.2.1.1）、纤维素酶（cellulase，ec3.2.1.4）、葡聚糖酶（dextranase，ec3.2.1.11）、角质酶（cutinase，ec3.1.1.74）。
43.通过大量试验，发明人选择了数种水解酶单独与聚谷氨酸组合，证实了聚谷氨酸具有降低单一水解酶用量却效果显著增强的作用。通过两种或两种以上水解酶联合应用聚谷氨酸，亦具有降低水解酶组用量却效果显著增加的作用。所述聚谷氨酸分子量为5万道尔顿至200万道尔顿之间，包括其一价盐或二价盐。
44.综合上述试验可以得知水解酶单独或组合后与聚谷氨酸联合运用，能降低水解酶用量，同时显著增强防止或有效去除生物膜的作用。