一种用于皮肤修复的可注射水凝胶的制备方法以及应用与流程

1.本发明属于皮肤修复凝胶的技术领域，具体涉及一种用于皮肤修复的可注射水凝胶的制备方法以及应用。


背景技术：

2.早在20世纪早期，脂肪移植就开始进入人们的视野，脂肪移植的发展从大块脂肪到颗粒脂肪，再到纳米脂肪，经历了一系列的发展历程。脂肪组织中含有大量的活性结构，比如说脂肪干细胞、外泌体、脂肪细胞外基质等。其中，脂肪干细胞仅适用于患者本身，外泌体量较少，具有一定的应用限制。脂肪细胞外基质在自体或者异体填充过程当中具有较大的优势，和传统的填充物如玻尿酸相比，脂肪细胞外基质具有以下优势，如可以充当组织支架，对缺损部位启动组织修复；可以释放生长因子，促进自体组织的生长，除此以外，脂肪细胞外基质去除了主要的免疫原性结构，可以同种异体或者异种异体进行使用，适合进行规模化的应用，增加经济效益。但是传统的脂肪细胞外基质的处理方法限制了它的应用范围。比如将脂肪外基质利用酶消化法制备成基质胶，这在一定程度上改变了它的内部结构，可能会降低脂肪细胞外基质的作用效果，或者将脂肪细胞外基质制备成粉末，混匀后进行注射填充，这种方法很好地保留了组织活性，但是由于组织松散，达不到很好的应用效果。


技术实现要素：

3.针对上述问题，本发明的目的在于提供一种用于皮肤修复的可注射水凝胶的制备方法以及应用，制备过程中，保留脂肪的外基质结构，维持生物学活性，得到的水凝胶产品适用于皮肤修复。
4.本发明的技术内容如下：本发明提供了一种用于皮肤修复的可注射水凝胶的制备方法，包括如下步骤：1）制备脂肪组织外基质：取动物脂肪，离心脱水，将脂肪进行组织破碎处理，再次离心去除水分和油脂，将处理后的脂肪进行反复冻融，之后分别置于氯化钠溶液、水以及乳化剂中进行超声振荡处理，将脂肪组织漂洗之后，置于辛基酚聚氧乙烯醚溶液中萃取，离心，清洗，冻干，得到脂肪组织外基质粉末；2）将海藻酸盐或壳聚糖配置成浓度为0.4~1 mg/ml的溶液，磁力搅拌3~5h，加入步骤1）制得的脂肪组织外基质粉末，形成浓度为2~10 mg/ml的脂肪外基质胶，搅拌均匀之后，静置于0~5℃环境下，得到组织混合液；3）在组织混合液中加入氯化钙溶液，搅拌均匀制得水凝胶。
5.步骤1）所述制备脂肪组织外基质的具体操作为：取人体或猪的脂肪，离心脱水，利用低温组织研磨仪，在65~80hz，30~40s，3~5个循环的条件下将脂肪进行组织破碎处理，再次离心去除水分和油脂，将处理后的脂肪进行置于液氮中放置1.5~2h，35~40℃复温，循环3~4次，之后置于1m氯化钠溶液中，37℃超声振荡2h，蒸馏水漂洗之后，置于蒸馏水中超声振荡1h，蒸馏水漂洗之后，置于4~5%乳化剂中，室温下超声振荡1h，再用蒸馏水漂洗，之后置于
辛基酚聚氧乙烯醚溶液萃取36h，每12h更换萃取液，以除去多余的脂质，用蒸馏水反复漂洗3-5次，4℃下2000g离心3 min，沉淀物用蒸馏水反复漂洗，最后采用真空冻干机（温度为-65℃，冻干时间48h）将组织冻干后，采用低温研磨的方法制备出脂肪组织外基质粉末，粉末直接冻存于-80℃保存；所述超声振荡的频率为60~80 khz，处理1~3h；所述乳化剂的制备为：在真空环境下，将脂肪酸甲酯和水混合升温至120~150℃，加入环氧乙烷搅拌均匀，之后加入柠檬酸钠和γ-氧化铝复合催化剂，反应1.5~2h，之后降温至80~100℃，加入γ-氧化铝催化剂继续反应1.5~2h，降至常温即得到脂肪酸甲酯乙氧基化物产物，其有助于去除脂肪组织中的油脂，同时保留脂肪的组织稳固，避免组织松散；步骤1）所述脂肪酸甲酯和水的混合质量比为（6~8）：1；所述环氧乙烷的加入量为脂肪酸甲酯和水水混合物质量的3~5倍；所述柠檬酸钠和γ-氧化铝复合催化剂的加入量为2~3 wt%，其中柠檬酸钠和γ-氧化铝的复合质量比为（3~5）：（4~7）；所述γ-氧化铝催化剂的加入量为1~2 wt%。
6.步骤1）所述的辛基酚聚氧乙烯醚溶液为将辛基酚聚氧乙烯醚与8~10 g/l pbs溶液混合，置于35~40℃水浴中搅拌1~2h，其能够与脂肪中的油脂成分融合，更容易带走脂肪中的磷脂，同时维持脂肪的纤维结构；所述辛基酚聚氧乙烯醚的聚合度为4或6；所述辛基酚聚氧乙烯醚的加入量为pbs溶液的5~7 wt%。
7.步骤2）所述海藻酸盐包括海藻酸钠，具有良好的吸水性，并且对人体无毒，可以进行自体吸收；步骤3）所述氯化钙的浓度为2~3 %。
8.本发明还提供了一种以上制备方法制得用于皮肤修复的可注射水凝胶。
9.本发明还提供了一种所述可注射水凝胶在面部填充、创面治疗的应用。
10.本发明的有益效果如下：本发明的所制备的可注射水凝胶，通过对脂肪组织进行破碎以及采用氯化钠、乳化剂以及萃取溶液的处理，有效破坏脂肪中的细胞结构，并释放出生物因子附着于脂肪组织中，同时有效去除脂肪中的油脂物质，保留脂肪的外基质结构，呈现纤维结构，与凝胶材料结合形成水凝胶产品，保留脂肪组织的生物学活性，同时使得水凝胶的产品形态更适用于皮肤修复，将水凝胶涂覆于创伤皮肤，可以促进组织修复，还可用于植皮皮肤的涂覆，促进植皮皮肤的存活，减少需要经常换药产生的摩擦带来的疼痛感，使用于皮肤还可以改善皮肤光老化的程度，从而维持皮肤的健康状态。
附图说明
11.图1为脂肪组织的电镜图；图2为经过氯化钠、水以及乳化剂超声处理的脂肪组织的电镜图；图3为经过溶液萃取之后的脂肪组织外基质的电镜图；图4为试验例的紫外线照射下大鼠的皮肤的表皮厚度变化；图5为试验例的紫外线照射下大鼠的皮肤的真皮厚度变化。
具体实施方式
12.以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本技术所附权利要求所限定。
13.若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。
14.实施例1一种用于皮肤修复的可注射水凝胶的制备：1）制备脂肪组织外基质：取人体或猪的脂肪，离心脱水，利用低温组织研磨仪，在70hz，35s，4个循环的条件下将脂肪进行组织破碎处理，再次离心去除水分和油脂，如图1所示，显示细胞结构遭到破坏，但是仍有油脂其其它杂质的存在；将处理后的脂肪进行置于液氮中放置2h，37℃复温，循环3次，之后置于1m氯化钠溶液中，37℃下70 khz超声振荡2h，蒸馏水漂洗之后，置于蒸馏水中70 khz超声振荡1h，蒸馏水漂洗之后，置于4%乳化剂中，室温下70 khz超声振荡1h，再用蒸馏水漂洗，将处理后的脂肪组织进行电镜扫描，如图2所示，显示脂肪中的油脂以及其它杂质少了许多；之后置于辛基酚聚氧乙烯醚溶液萃取36h，每12h更换萃取液，以除去多余的脂质，用蒸馏水反复漂洗4次，4℃下2000g离心3 min，沉淀物用蒸馏水反复漂洗，将处理后的脂肪组织进行电镜扫描，如图3所示，显示脂肪组织的纤维结构，相比之前明显少了很多油脂，以及不见有细胞结构；最后采用真空冻干机（温度为-65℃，冻干时间48h）将组织冻干后，采用低温研磨的方法制备出脂肪组织外基质粉末，粉末直接冻存于-80℃保存；所述乳化剂的制备为：在真空环境下，将脂肪酸甲酯和水以质量比为7：1混合升温至135℃，加入混合物质量的4倍的环氧乙烷搅拌均匀，之后加入2 wt%质量比为4:6柠檬酸钠和γ-氧化铝复合催化剂，反应2h，之后降温至90℃，加入1 wt%γ-氧化铝催化剂继续反应1.5h，降至常温即得到脂肪酸甲酯乙氧基化物产物；所述辛基酚聚氧乙烯醚溶液为将聚合度为6辛基酚聚氧乙烯醚与9 g/l pbs溶液混合，置于37℃水浴中搅拌1.5h，所述辛基酚聚氧乙烯醚的加入量为pbs溶液的6 wt%；2）将海藻酸钠配置成浓度为0.8 mg/ml的溶液，磁力搅拌4h，加入步骤1）制得的脂肪组织外基质粉末，形成浓度为8 mg/ml的脂肪外基质胶，搅拌均匀之后，静置于4℃环境下，得到组织混合液；3）在组织混合液中加入浓度为2.5%氯化钙溶液，搅拌均匀制得水凝胶。
15.实施例2一种用于皮肤修复的可注射水凝胶的制备：1）制备脂肪组织外基质：取人体或猪的脂肪，离心脱水，利用低温组织研磨仪，在80hz，30s，3个循环的条件下将脂肪进行组织破碎处理，再次离心去除水分和油脂，将处理后的脂肪组织进行电镜扫描，将处理后的脂肪进行置于液氮中放置1.5h，35℃复温，循环3次，之后置于1m氯化钠溶液中，37℃下80 khz超声振荡1h，蒸馏水漂洗之后，置于蒸馏水中80 khz超声振荡1h，蒸馏水漂洗之后，置于5%乳化剂中，室温下80 khz超声振荡1h，再用蒸馏水漂洗，之后置于辛基酚聚氧乙烯醚溶液萃取28h，每12h更换萃取液，以除去多余的脂质，用蒸馏水反复漂洗3次，4℃下2000g离心3 min，沉淀物用蒸馏水反复漂洗，最后采用真
空冻干机（温度为-70℃，冻干时间40h）将组织冻干后，采用低温研磨的方法制备出脂肪组织外基质粉末，粉末直接冻存于-80℃保存；所述乳化剂的制备为：在真空环境下，将脂肪酸甲酯和水以质量比为8:1混合升温至150℃，加入混合物质量的5倍的环氧乙烷搅拌均匀，之后加入3 wt%质量比为5:7柠檬酸钠和γ-氧化铝复合催化剂，反应2h，之后降温至100℃，加入2 wt%γ-氧化铝催化剂继续反应2h，降至常温即得到脂肪酸甲酯乙氧基化物产物；所述辛基酚聚氧乙烯醚溶液为将聚合度为6辛基酚聚氧乙烯醚与10 g/l pbs溶液混合，置于40℃水浴中搅拌1h，所述辛基酚聚氧乙烯醚的加入量为pbs溶液的7 wt%；2）将壳聚糖配置成浓度为1 mg/ml的溶液，磁力搅拌5h，加入步骤1）制得的脂肪组织外基质粉末，形成浓度为10 mg/ml的脂肪外基质胶，搅拌均匀之后，静置于5℃环境下，得到组织混合液；3）在组织混合液中加入浓度为3%氯化钙溶液，搅拌均匀制得水凝胶。
16.实施例3一种用于皮肤修复的可注射水凝胶的制备：1）制备脂肪组织外基质：取人体或猪的脂肪，离心脱水，利用低温组织研磨仪，在65hz，40s，5个循环的条件下将脂肪进行组织破碎处理，再次离心去除水分和油脂，将处理后的脂肪进行置于液氮中放置2h，40℃复温，循环4次，之后置于1m氯化钠溶液中，37℃下60 khz超声振荡3h，蒸馏水漂洗之后，置于蒸馏水中60 khz超声振荡1h，蒸馏水漂洗之后，置于4%乳化剂中，室温下60 khz超声振荡1h，再用蒸馏水漂洗，之后置于辛基酚聚氧乙烯醚溶液萃取48h，每12h更换萃取液，以除去多余的脂质，用蒸馏水反复漂洗5次，4℃下2000g离心3 min，沉淀物用蒸馏水反复漂洗，最后采用真空冻干机（温度为-80℃，冻干时间36h）将组织冻干后，采用低温研磨的方法制备出脂肪组织外基质粉末，粉末直接冻存于-80℃保存；所述乳化剂的制备为：在真空环境下，将脂肪酸甲酯和水以质量比为6:1混合升温至120℃，加入混合物质量的3倍的环氧乙烷搅拌均匀，之后加入2 wt%质量比为3:4柠檬酸钠和γ-氧化铝复合催化剂，反应1.5h，之后降温至80℃，加入1 wt%γ-氧化铝催化剂继续反应1.5h，降至常温即得到脂肪酸甲酯乙氧基化物产物；所述辛基酚聚氧乙烯醚溶液为将聚合度为4辛基酚聚氧乙烯醚与8 g/l pbs溶液混合，置于35℃水浴中搅拌2h，所述辛基酚聚氧乙烯醚的加入量为pbs溶液的5 wt%；2）将海藻酸钠配置成浓度为0.4 mg/ml的溶液，磁力搅拌3h，加入步骤1）制得的脂肪组织外基质粉末，形成浓度为2 mg/ml的脂肪外基质胶，搅拌均匀之后，静置于0℃环境下，得到组织混合液；3）在组织混合液中加入浓度为2 %氯化钙溶液，搅拌均匀制得水凝胶。
17.试验例将sd大鼠（90g
±
8g）8只分为两组，2只正常生长组，6只进行紫外线光老化处理，处理方法为：大鼠背部去毛，左右各取两个1cm*1cm的正方形区域进行相应处理，2只不进行紫外线光照射处理，其余6只用波长为300nm，功率为15w，照射高度为80cm，第一周照射能量为80 mj/cm2，第二周为160 mj/cm2，第三第四周为240 mj/cm2。再等待一周后开始进行实验。实验分为四组，第一组是正常大鼠皮肤，不添加任何干预，第二组是光老化大鼠皮肤，不添加任何干预，第四组是将100 μl本注射凝胶产品进行大鼠光老化皮肤的皮内注射，第三组
是将第四组另一边采用等量的生理盐水进行注射，1周、2周、4周后，采用皮肤镜观察皮肤真皮和表皮的厚度，进行观察统计。
18.皮肤的老化行为主要原因来源于光老化，而阳光中的uvb在皮肤老化引起的皱纹中起着至关重要的作用，主要表现为皮肤粗糙，皱纹增多，老年斑形成和角质层不规则性增厚。在组织学上，表现为表皮不均匀增厚，真皮层变薄。
19.经过以上试验发现，如图4、图5所示，经过4周的紫外线照射，大鼠的皮肤表现为真皮层明显变薄，表皮层明显增厚，经过1周、2周、4周的时间，皮肤逐渐恢复，但是不同干预组的恢复情况不一。恢复最慢的组是不加任何干预组，其次为生理盐水组，恢复最快的是注射凝胶组。值得一提的是，注射生理盐水组和不加任何干预组没有任何区别。由此可见，本发明通过联合脂肪外基质和水凝胶获得的可注射凝胶，可以很大程度上改善皮肤光老化的程度，从而维持皮肤的健康状态，并且对皮肤具有修复作用。