1.本发明属于检测
技术领域：
：，更具体地，涉及一种基于数字等离子免疫吸附测定法的蛋白质结合动力学超灵敏动态成像分析方法。
背景技术：
：：2.表面等离子体共振(spr)生物传感器因其产生的倏逝场对局部折射率(ri)的变化具有很高的灵敏度，现已成为研究生物分子相互作用动力学的重要工具[1-2]。表面等离子体共振(spr)成像的提出[3]将spr技术与成像系统紧密结合在一起，成为具有无标记、高通量、原位和实时检测分子相互作用等特性的技术[5]。可应用于测量大分子结合过程中的特异性、亲和力和动力学参数，如蛋白质-蛋白质、蛋白质-dna、受体药物和细胞/病毒-蛋白质结合[6]。在疾病的早期诊断[7，8]、药物筛选[9]和食品质量控制[10，11]中得到越来越广泛的应用。[0003]数字pcr(dpcr)的概念自1999年首次提出以来[12],便引发人们的持续关注，相比于实时定量pcr(qpcr)，dpcr能提供更敏感、更具重复性的临床方法[13]。数字pcr(dpcr)是一种应用日益广泛的技术，在核酸的检测和定量方面具有许多优点[14]。近年来，随着微流控和乳液化学的发展，工艺更加简化和自动化使得dpcr变得更加实用，越来越多地应用于临床检测中，包括肿瘤学[15，16]和传染病[17-18]以及胎儿基因筛查[19，20]和预测移植排斥反应[21]。[0004]本发明发明人在前研究得到了一种人类唾液中c型反应性蛋白彩色成像的方法及装置[4]，虽然能够在一定程度上解决c反应蛋白定量分析，但该专利中介绍的方法也仅能进行c反应蛋白定量分析。技术实现要素：[0005]针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种基于数字等离子免疫吸附测定法的蛋白质结合动力学超灵敏动态成像分析方法，通过引入金钛等离子体纳米孔阵列的高灵敏度成像传感器，以及基于该传感器的数字等离子体免疫吸附测定法，通过结合经典的泊松统计算法和数字表面等离子体共振(spr)图像技术，可以定量测定低浓度的蛋白质并表现出优越的性能。本发明使用该传感器从spr图像中检测c反应蛋白(crp)和抗crp抗体结合信息，避免了复杂的光谱检测，可用于通过使用正常白光检测lod为2.36ng/ml的炎症标志物crp蛋白。此外，我们分析了蛋白质结合动力学，并证明本发明方法还可用于通过crp蛋白与抗crp抗体相互作用期间的超灵敏动态成像来确定蛋白质相互作用中的平衡解离常数。并且，由于等离子体纳米孔阵列的高性能，本发明中的方法有望用于未来的可见光便携式光学传感等方面。[0006]为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种基于数字等离子免疫吸附测定法的c型反应性蛋白浓度定量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：[0007](i)准备不同crp蛋白浓度的标准品，对于每一个标准品：[0008](i-1)准备洁净的等离子传感芯片，用于产生等离光子谐振耦合效应的设备；[0009](i-2)在等离子传感芯片上覆盖crp抗体，用于特异性结合crp蛋白；[0010](i-3)将等离子传感芯片固定在光学显微镜中，然后将去离子水滴加到该等离子传感芯片上，通过光学显微镜得到明场显微彩色图片作为参考图像，并记录芯片采集区域，计算参考图像芯片采集区域内像素值不超过预先设置阈值的像素点的个数，记为count1；[0011](i-4)将该crp蛋白浓度的标准品滴加到所述等离子传感芯片上，待反应完全后通过光学显微镜得到明场显微彩色图片作为检测图像，保持芯片采集区域不变，计算该标准品处理所对应的检测图像芯片采集区域内像素值不超过预先设置阈值的像素点的个数count2；[0012](i-5)定义像素点数目的变化率表示为p，且p＝(count1-count2)/count1，得到与该标准品浓度相对应的p值；[0013](ii)根据不同crp蛋白浓度的标准品所对应的p值，基于泊松分布算法，推导出拟合公式：得到p与crp浓度c的标准拟合曲线，由拟合曲线确定系数k1、k2的值，得到浓度定量公式：c＝k1×in(1-k2×p)；[0014](iii)针对待检测crp蛋白浓度的待测液，先重复步骤(i-1)和步骤(i-2)和步骤(i-3)，接着将这一待测液滴加到该等离子传感芯片上，待反应完全后通过光学显微镜得到明场显微彩色图片，得到该待测液处理所对应的检测图像，保持芯片采集区域不变，计算检测图像芯片采集区域内像素值不超过预先设置阈值的像素点的个数count3；[0015](iv)定义p’＝p＝(count1-count3)/count1，然后将p’代入所述步骤(ii)得到的浓度定量公式中，得到该待测液的crp浓度值，从而完成crp蛋白浓度的测定。[0016]作为本发明的进一步优选，所述明场显微彩色图片均用matlab进行自动化图像处理，具体的，是先对初始明场显微彩色图片进行模拟信号化处理，得到模拟信号图像；该模拟信号图像中的任意一个像素点的像素值为初始图片中对应像素点处的r通道强度值与rgb三通道强度值之和的比；[0017]然后，根据预先设置的阈值，将所述模拟信号图像二值化处理，得到数字信号图像；该数字信号图像中的任意一个像素点的像素值为0或1。[0018]作为本发明的进一步优选，所述步骤(i)中，所述不同crp蛋白浓度的标准品它们的crp蛋白浓度均分布在0～50ng/ml；[0019]更优选的，所述不同crp蛋白浓度的标准品至少包括2种crp蛋白浓度的标准品；[0020]所述步骤(iii)中，所述待检测crp蛋白浓度的待测液是由待检测crp蛋白浓度的初始溶液经稀释得到的。[0021]作为本发明的进一步优选，所述步骤(i-1)中，所述等离子传感芯片具有纳米孔阵列，并且在纳米孔阵列的表面还设置有钛黏附层和黄金层；更优选的，所述纳米孔阵列的周期为350nm；上下直径分别为180nm和160nm，高度为500nm；所述钛黏附层的厚度为9nm，所述黄金层的厚度为110nm。[0022]作为本发明的进一步优选，所述检测图像均是在水中获得的。[0023]按照本发明的另一方面，本发明提供了一种基于数字等离子免疫吸附测定法的c型反应性蛋白动态结合动力学成像分析方法，其特征在于，包括以下步骤：[0024]s1：准备洁净的等离子传感芯片，用于产生等离光子谐振耦合效应的设备；[0025]s2：在等离子传感芯片上覆盖crp抗体，用于特异性结合crp蛋白；[0026]s3：将等离子传感芯片固定在光学显微镜中，接着将已知蛋白浓度的待分析样品滴加到该等离子传感芯片上，发生反应；[0027]其中，记滴加瞬间为0时刻，先通过光学显微镜采集得到0时刻所对应明场显微彩色图片，保持芯片采集区域不变，在反应过程中，按照预先设定的时间间隔，采集得到一系列与反应时间相关的明场显微彩色图片；将0时刻得到的芯片采集区域内像素值不超过预先设置阈值的像素点的个数，记为count1；记任意一张明场显微彩色图片所对应的芯片采集区域内像素值不超过预先设置阈值的像素点的个数为count2，即可得到一系列与反应时间相关的count2；[0028]s4：根据p＝(countl-count2)/count1，计算不同反应时间所对应的数字信号变化率p，用公式p＝a(1-e-bt)拟合p与反应时间t的关系曲线，进而计算得到该蛋白与抗体相互作用的平衡解离常数kd；其中，公式p＝a(1-e-bt)中，a、b为待拟合确定的系数。[0029]通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，本发明中的方法既可以进行c反应蛋白定量分析，又能进行c反应蛋白抗原抗体结合动力学分析。本发明首次将数字pcr中的泊松分布算式引入到spr成像检测技术中(如后文图1中的b-e所示)，实现了数字化spr图像技术对crp蛋白浓度的定量检测(如后文图1中的f所示)。同时，我们通过采集蛋白结合过程的动态spr图像，测定了crp和抗crp抗体结合动力学。不同于以往计算spr图像模拟信号均值的方法，数字信号图像通过直接计数变化的敏感像素点来进行检测，通过自动化图像处理的方式实现spr图像从初始图像(如后文图2中的d、g所示)到模拟信号图像(如后文图2中的e、h所示)再到数字信号图像(如后文图2中的f、i所示)的转变。我们使用此方法对缓冲液中人类c反应蛋白(crp，100kda)浓度进行了定量检测，这是一种广泛用于急性炎症疾病临床诊断和治疗的生物标记物[22-25]。我们证明了检测极限(lod)低至2.36ng/ml。这一结果至少比血浆crp水平低3个数量级。并且，本发明还可用于通过crp蛋白与抗crp抗体相互作用期间的超灵敏动态成像，先得到数字信号变化率p，并根据p利用公式p＝a(1-e-bt)拟合p与反应时间t的关系曲线，再基于现有技术，由该关系曲线即可确定蛋白质相互作用中的平衡解离常数。[0030]本发明为表面等离子体共振(spr)成像检测蛋白浓度提供了新的思路和方法。同时避免了使用昂贵的光谱检测仪器，仅使用普通的白光光源和拍照设备实现亮场成像，没有复杂冗长的信号放大步骤，有望开发一种便携式生物传感器用于疾病的早期检测。附图说明[0031]图1是本发明数字化图像蛋白检测原理图。其中，图1中的a对应实验系统示意图。图1中的b对应稀释后的crp蛋白随机分散到芯片表面各处并与固定在芯片表面的捕获抗体结合，从而附着在芯片表面。此时芯片表面将分为含有crp蛋白的区域和不含有crp蛋白的区域。图1中的c对应过量的检测抗体加入到芯片表面并与捕获的crp蛋白结合进行信号放大，检测抗体的附着引起较大的等离子体共振峰的红移。图1中的d对应利用图像处理手段对含有crp蛋白的区域和不含有crp蛋白的区域进行像素点统计计数。图1中的e对应结合经典数字pcr泊松分布算法推导出数字spr算法。图1中的f对应用推导公式对1-50ngcrp蛋白进行指数拟合，确定相关系数。[0032]图2是spr图像处理分析流程。其中，图2中的a对应纳米孔生物传感芯片在白光照明下进行明场成像，用ccd相机记录真彩色spr图像。图2中的b为芯片sem图像。图2中的c展示了三明治夹心法放大示意图，crp蛋白与固定在芯片表面的捕获抗体结合，接着被检测抗体所识别。图2中的d和图2中的g是从ccd相机中获取的原始图片经过预处理后的初始图片，初始图片记录了345ꢀ×345um2的芯片表面区域。包含了1000×1000个像素点。并增加了50％的亮度和20％的对比度用以显示。其中图2中的d为加入检测抗体前图2中的b获取的图片。图2中的g为加入检测抗体后图2中的c获取的图片。图2中的e和图2中的h分别是图2中的d和图2中的g计算每个像素点处r/(r g b)值后得到的模拟信号图像，并以热图的形式呈现。模拟信号均值由图2中的e到图2中的h图像均值的变化率所得。图2中的f和图2中的i分别是图2中的e和图2中的h经过二元化后得到的数字信号图像，并以热图的形式呈现。模拟信号计数值由图2中的f到图2中的i像素点数目的变化率所得。实现对crp蛋白的数字化spr信号检测。[0033]图3是crp的动态和定量分析。其中，图3中的a为1μg/mlcrp动态检测中，在不同时间获得的初始图像，亮度增加50％，对比度增加20％进行显示。图3中的b为初始图像图3中的a转换而来的数字信号图像。图3中的c显示加入检测抗体(crp浓度为1μg/ml)后数字信号计数值(vdsc)随时间的变化曲线。图3中的d不同浓度crp蛋白结合的vdsc随时间的动态变化。图3中的e不同浓度的crp可以从数字信号图像中直观地区分出来。图3中的f条形图显示了不同浓度的crp样品的数字信号计数值(vdsc)，误差条表示三个重复样品的标准偏差。图3中的g对应crp校准曲线(lod＝2.36ng/ml)，拟合系数为0.985。[0034]图4是纳米金颗粒增强的蛋白结合数字化动态信号提取。其中，图4中的a不同时刻下获取的初始图像，图像增加50％亮度和20％对比度用于显示。图4中的b对应时刻下初始图像数字化处理后的热图图像。图4中的c和图4中的d分别显示了在1μg/ml和1ng/mlcrp的动态图像检测中金颗粒增强和没有金颗粒的数字信号计数值随时间的动态变化对比。具体实施方式[0035]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。[0036]准备工作：[0037]等离子传感芯片的制造[0038]我们使用复制成型工艺来制备纳米等离子体传感器芯片。原始模具是通过激光干涉光刻在氧化硅片上制成的锥形纳米柱阵列。在复制之前，将模具硅烷化以获得疏水性。然后，将norland光学粘合剂(noa-61)均匀且无气泡地涂覆在清洁的模具上，然后将pet薄板放置在模具的顶部。经过90秒钟的紫外线(105mw/cm^2)照射后，将表面具有纳米孔阵列的pet薄片小心地从模具上剥离。最后，使用电子束蒸发机在具有纳米孔阵列的pet表面上沉积9nm钛和110nm金，以制成纳米等离子体传感器芯片。所得的纳米杯阵列具有350nm的周期，180nm的直径和500nm的高度。[0039]仿真设置[0040]我们使用市售的三维有限差分时域(3d-fdtd)方法来研究纳米杯芯片的远场透射光谱的相关变化。我们在厚度为1000nm的基板(ri＝1.56)上构建了一个纳米杯。纳米杯阵列的周期为350nm，纳米杯的顶部直径，底部直径和深度分别为180nm，160nm和500nm。依次在杯子的上方放置一个9nm的ti层和一个110nm的au层(johnson和christy的光学参数)。金颗粒小球的直径为30nm。光源放置在纳米杯结构上方，并沿法线入射方向传播到基板。模拟总面积为350nmx350nmx2000nm。沿x和y方向应用周期性边界条件，并沿z轴应用完美匹配的层以消除边界的任何干扰。[0041]光学设置[0042]使用olympusix73立式荧光显微系统获取透射模式下的明场显微彩色图片。使用100w的卤素灯作为光源，光路包括一块毛玻璃、na为0.3的聚光镜和10倍放大倍数，na为0.3的物镜。rgb真彩色图片由cellsens软件控制的基于电荷耦合器件的(ccd)相机采集,曝光时间设定为25ms,数字增益为1。利用光谱仪(ihr320horiba)来获取透射光谱。来自样品的透射光谱用光源光谱进行归一化以获得最终的透射数据。光谱数据的采集由定制的labview程序控制。[0043]图像处理[0044]获取的所有rgb图像先用imagej软件进行预处理，使用软件内置的registervirtualstack功能对图片进行刚性配准，将配准后的图片剪裁为1000×1000像素大小的图片作为初始图像。后续的图像处理与分析均在matlab软件中进行。模拟信号图像是通过计算初始图像每个像素点处r通道强度值与rgb三通道强度值和的比值(r/(r g b))得到的，通过这个简单的转换，在一定程度上消除了由光源和样品波动引起的图像总体强度的变化[32],获得了更加稳定可靠的具有等离子体特征的信号。[0045]数字信号图像是将模拟信号图像通过设定阈值进行二元化后获得的。我们通过matlab程序，将大于阈值的像素点的值设为1，小于阈值的像素点的值设为0,图像被分割为像素值为1的区域和值为0的区域。数字信号计数值是通过计算数字信号图像中像素值为0的像素点数目的变化率得到的：[0046]vdsc＝(count1-count2)/count1[0047]count1、count2分别为加入检测抗体前后获取的数字信号图像中像素值为0的像素点的个数。内置的matlab颜色图(autumn)用于模拟信号图像和数字信号图像的可视化。[0048]试剂[0049]蔗糖，己基硅烷，乙醇，碳酸钾，11-巯基烷酸(mua)，1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edc)，n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，牛血清白蛋白(bsa)，乙醇胺，纯化的crp和磷酸盐缓冲液(pbs)缓冲液购自sigma-aldrich，单克隆抗crp捕获和检测抗体购自sinobiological。[0050]纳米金颗粒标记抗crp抗体[0051]将1.5ml30nm金纳米粒子溶液与5μl1mg/ml抗crp抗体混合，通过添加稀释的0.01m碳酸钾溶液将胶体au-nps溶液的ph值调节至ph7.2，孵育后，将10μltris-hcl1×和1％bsa封闭液加入金标记溶液中10分钟。然后将au-nps悬浮液以7200rpm的速度离心20分钟。离心和重悬步骤重复3次。在最后的重悬步骤中，将au-nps沉淀重悬在100μl的pbs缓冲液中。标记的金颗粒溶液在4℃下储存用于进一步的实验。通过紫外可见分光光度计测定溶液的吸光度，计算出金nps的浓度为0.28nm。[0052]crp蛋白检测流程[0053]首先用70％乙醇和去离子水清洗芯片表面，然后在去离子水中采集透射光谱和图片，并记录采集区域。加入1mm的mua溶液(在乙醇中)到芯片表面，在室温下孵育24小时，去除mua溶液后，用70％乙醇和去离子水清洗芯片两次。然后在去离子水中采集记录区域的透射光谱和图片。在室温下将芯片在400mmedc和100mmnhs的1∶1混合物中孵育30分钟，然后立即与50μg/ml单克隆抗crp捕获抗体(在pbs中)在4℃下孵育12h。用pbs和去离子水清洗芯片表面，然后在去离子水中采集记录区域的透射光谱和图片。先后在60μg/mlbsa封闭溶液和10％乙醇胺溶液中各孵育芯片30分钟。用去离子水冲洗芯片两次，然后在去离子水中采集记录区域的透射光谱和图片。将芯片在不同浓度的crp(在pbs中)中孵育2小时。用pbs和去离子水冲洗后在去离子水中采集记录区域的透射光谱和图片。最后，加入50μg/ml单克隆抗crp检测抗体(在pbs中)至芯片表面，采集记录区域随时间变化的动态图片。2h后用pbs和去离子水冲洗芯片，在去离子水中采集记录区域的透射光谱和图片。[0054]结果讨论如下：[0055]数字化spr信号检测crp蛋白含量[0056]图1中的a显示了检测装置的示意图，我们的实验是在荧光倒置显微镜上进行的，用普通的100w卤素灯进行照明，透射模式的图像在2448×1920像素的真彩色ccd相机上曝光25ms后记录下来(如图2中的a所示)。使用0.3na的聚光镜和0.3nt，10倍放大的物镜，可以捕获覆盖844.6×662.4um2区域的图像。由此可以计算出每个像素所覆盖的芯片表面区域的大小约为345×345nm2，这近似于我们所使用的芯片的纳米孔阵列的周期350nm。此外，还可以计算瑞利衍射极限光斑的大小。[0057][0058]这里λ是照明光的波长，na是聚光镜和物镜的数值孔径之和。可以计算出r约为1220nm。注意到衍射限制区域对应于4×4纳米孔单元，这可能表明纳米孔产生的spr信号的变化将影响16个像素。[0059]我们采用三明治夹心法来检测crp蛋白的浓度。简单来说首先芯片表面在mua溶液中形成sam，在用edc和nhs活化羧基后，将crp捕获抗体结合至芯片表面。用bsa与乙醇胺溶液封闭非特异性位点并覆盖剩余nhs。接着将稀释后的crp蛋白溶液加入到芯片表面，溶液中游离的crp蛋白将被芯片表面固定的crp抗体捕获而留在芯片表面。当溶液中的crp浓度较低时，平均每个纳米孔包含一个至多个crp蛋白分子。crp蛋白随机分散至芯片表面的各处并被捕获，使得crp蛋白在芯片表面分布的不均匀性(如图1中的b所示)。最后，过量的crp检测抗体添加到芯片表面与被捕获的crp蛋白进行结合。crp检测抗体在芯片表面的结合改变所在区域环境的ri使得等离子体共振峰的红移，从而芯片表面区域将分为两个部分，含有crp蛋白的区域在与crp检测抗体结合后改变了原来的spr信号，而不含有crp蛋白的区域不能与crp检测抗体结合保持原有的spr信号(如图1中的c所示)。[0060]数字pcr(dpcr)是一种对核酸分子绝对定量及扩增的新技术，由于每个纳米孔中可能结合了两个或两个以上的crp蛋白分子，结合数字pcr的概念，我们引入泊松分布算式[26](如图1中的e所示)来检测低浓度crp蛋白含量。[0061][0062]这里，λ和crp蛋白浓度c有关，有λ＝k1*c。当k＝0(不含有crp蛋白分子)时，上式可化简为：此处概率p可看作spr信号未发生变化的纳米孔区域与检测的纳米孔区域的比值。纳米孔区域的比值可近似用像素点数目的变化来表示，我们将spr信号发生变化的像素点数目的变化率表示为p，即同时由于显微分辨率的限制，spr信号发生变化的区域与像素点数目的变化之间不是一一对应的，需要添加一个矫正系数k2来建立对应关系，则有：p(x＝0)将其表示为p与c的函数得到：[0063][0064]两边取对数可进一步可变性为通用公式：[0065]c＝k1×in(1-k2×p)ꢀꢀ(3)[0066]像素点数目变化率p随crp浓度的函数关系如图1中的f所示。用公式(2)进行拟合，我们发现当crp的浓度低于50ng/ml时，拟合结果较好，r2为0.983。当添加到芯片表面的蛋白溶液浓度过高时，会导致生物分子在芯片表面聚集。分子聚集会降低泊松分布计算的准确性发现使用高浓度crp结果进行拟合时拟合系数值小于0.9，这可能表明较低浓度的crp分子在芯片表面得到更好的分离，对应于dpcr中的关键稀释步骤。因此，可以确定系数的值，方程(3)可以表示为c(crp)＝0.10804×in(1-4.9094％×p)。注意修正系数值接近1/16，说明系数在合理范围内。[0067]图像处理流程[0068]采集的显微图片在经过imagej进行预处理(详见材料与方法)后成为1000×1000像素大小的初始图片(如图2中的d、g所示)，初始图片包含了345×345um2的芯片表面区域。图像预处理是必要的，它提高了检测的精确度和后续图像处理的运算速度。[0069]初始图片在导入到matlab软件后，我们使用上述方法计算每个像素点处r/(r g b)的值来作为每个像素点处的spr信号值，经过转换后的得到能准确反应spr信号的模拟信号图像(如图2中的e、h所示)。初始图片在crp检测中的变化微弱，肉眼难以看出区别。、我们使用二元化的方法进一步处理模拟信号图片，将其转换为数字信号图片(如图2中的f、i所示)。我们选择合适的阈值，将高于阈值的像素点的值设置为1，将低于阈值的像素点的值设置为0。阈值的选取是动态的，考虑到实验中使用的芯片之间的差异性，对于不同的芯片下拍摄的图片，应采取相同的阈值标准而不是相同的阈值大小。为保证提取信号的准确性和灵敏性，我们使用加入检测抗体前拍摄的模拟信号图片的中值作为阈值，加入检测抗体后拍摄的时间序列图片都使用此阈值，在检测抗体与固定于芯片表面的crp蛋白结合后，环境ri的值发生变化，等离子体共振峰红移。导致图像像素点r/(r g b)的值增大，原本低于阈值的像素点越过阈值成为值为1的像素点，值为1的像素点数目因而增多。crp的浓度越高，固定于芯片表面的crp蛋白数目则越多，crp蛋白和检测抗体结合后，导致发生跃迁的像素点数目变多，从而构建了crp蛋白浓度变化与跃迁像素点数目变化之间的联系。[0070]方法对比及动力学定量[0071]图3中的a-d为芯片表面crp与crp检测抗体动态结合过程的信号提取。加入检测抗体后得到时间序列图片集。取0时刻的图片作为参考图像，后续的图像作为检测图像。通过检测图像与不同时间获取的参考图像之间的相对变化，提取动态结合信息。图3中的a为动态检测1μg/mlcrp时不同时刻获得的初始图片。初始图片亮度增加50％，对比度增加20％用以显示。通过初始图像的对比，肉眼几乎看不到spr信号随反应过程的变化。图3中的b显示了从初始图像(如图3中的a所示)转换而来的数字信号图像的图像热图。通过比较不同时刻的数字信号图像，可以直观地观察到反映crp和抗crp抗体动态结合信息的spr信号变化。图3中的c为1μg/mlcrp与检测抗体结合的动态曲线，并且图中的每个点都是从检测图像中计算出来的。[0072]我们在之前的研究中己经证明了lspr系统可以提供分子间相互作用速率并用来测定动力学常数[28]。我们的研究发现，动态数字信号图像同样可以用来测定动力学常数。我们将获取的动态数字信号图像应用于crp蛋白结合动力学分析。动力学常数值通过(如图3中的d所示)确定，拟合函数为y＝a(1-ebx)。从图中可以看到25μg/ml和50μg/mlcrp蛋白拟合曲线在反应一段时间后几乎重叠，这说明该体系在crp浓度为50μg/ml时达到饱和。crp蛋白和检测抗体(da)之间的生物分子相互作用可以建模为：[0073]d[da-crp]/dt＝ka[da][crp]-kd[da-crp]ꢀꢀ(4)[0074]这里ka为结合速率常数，kd为解离速率常数。方程(4)可改写为下式[29]：[0075][0076]这里rmax的值可以通过检测50μg/mlcrp下反应达到平衡时的数字信号相对变化率来确定，即最大信号变化。从图中可以看到25μg/ml和50μg/mlcrp拟合曲线在反应一段时间后几乎重叠，由于芯片表面crp捕获抗体的数量是一定的，因此可结合的crp分子数量有限，说明该体系在crp浓度为50μg/ml时达到了饱和。通过计算拟合系数较好(r2＞0.94)，且远离饱和值(＜90％rmax)的拟合曲线，得到ka与kd计算值分别3.328×106(±0.36×106)m-1s-1和2.15×10-2(±0.21×10-2)s-1。平衡解离常数kd由算式kd＝kd/ka得出，计算值为6.46×10-9(±0.31×10-9)m。kd的计算值接近用纳米粒子放大spr成像传感器测的结果[30]。[0077]我们使用从初始图像转换而来的数字信号图像来检测crp蛋白浓度。检测结果是从检测图像与参考图像的相对变化中获得的。不同浓度的crp可以通过数字信号图像直观的区分(如图3中的e所示)。图3中的f显示了数字方法检测crp蛋白浓度的结果。误差棒代表三个重复样本的标准偏差。在对照组中，数字信号图像值为1的像素点数目减少，导致变化率为负。相反的信号变化可能是由于表面抗体的分离和外部环境变化引起的误差。图3中的g显示了数字信号计数值(vdsc)随crp浓度(从1-500ng/m1)在对数刻度上的变化，拟合系数为0.985。拟合结果证明crp的对数浓度在1-500ng/ml的动态范围内与数字信号的相对变化率呈线性相关。lod经计算为2.36ng/ml。这至少比血浆crp水平低三个数量级。如表1所示，我们方法的crp检测性能与其他报道的生物传感器相当。[0078]表1crp检测方法性能的比较[0079][0080]纳米金颗粒增强的数字化动态蛋白检测[0081]纳米金颗粒在芯片表面能够抑制远场产生eot峰值，提供基于透射光强度变化的spr信号增强效果，hatice等通过在检测抗体上标记纳米金颗粒的方法极大的提高了等离子体器件检测蛋白浓度的性能[31]，但是他们并不能实时动态的检测芯片表面蛋白的相互作用。在本研究中，我们利用较小的纳米金颗粒(直径约30nm)标记检测抗体，采用基于图像像素点强度的阈值分割模式获得纳米金颗粒增强的数字化动态图片。来进一步增强实时动态检测芯片表面蛋白相互作用的灵敏度。[0082]图4中的a显示了1μg/mlcrp与aunps标记的crp检测抗体动态结合过程中不同时刻获得的初始图像。初始图像是通过增加50％的亮度和20％的对比度来显示的。由于金颗粒标记的抗体溶液呈现红色，初始图像的颜色呈鲜明的血红色，这与(如图3中的a所示)明显不同。另一个区别是当aunps标记的检测抗体与芯片表面上的crp结合时，透光率显著下降。图像亮度的下降反映了spr信号的变化，但肉眼几乎观察不到。图4中的b显示了从初始图像转换而来的数字信号图像的热图。通过图像热图的变化可以清楚地观察到反应过程中spr信号的变化。与图3中有b相比，可以观察到，从1分钟到5分钟，热图图像中更多的黄色像素变为红色像素。在100分钟时，红色像素的分布范围和密度远大于无金颗粒时100分钟时的热图(如图3中的b所示)。这表明在同样浓度crp的检测中金粒子增强后spr信号变化更快更大。[0083]图4中的c、d均用函数y＝a(1-ebx)进行拟合。图4中的c为1μg/mlcrp动态图像检测中金颗粒增强或空白的数字信号计数值随时间的动态变化。纳米金颗粒增强的数字信号计数值进一步增强了数字动态蛋白质检测的灵敏度，纳米金颗粒增强后的数字信号计数值的相对变化率在20min左右达到35％，相较于不加金颗粒的数字信号计数值在20min左右达到9％的相对变化率提升约4倍。从图4中的d可以观察到，在检测相对低浓度(1ng/ml)的crp蛋白时，加入带有金颗粒的检测抗体获得了相当大的相对变化率。这表明纳米金颗粒进一步增强了血浆装置蛋白质检测的性能。在纳米金颗粒的辅助增强下，有望进一步提高crp蛋白动态检测中的检测性能，将检测限提高到pg/ml水平。[0084]可见，本发明提出了一种基于纳米孔生物传感器的数字等离子免疫吸附测定法。该方法对低浓度蛋白检测有着高敏感性。与数字pcr检测类似，数字化spr图像分析方法结合泊松分布算法可用于对低浓度蛋白的定量检测。我们证明，使用此方法能有效获取spr图像中的蛋白结合信息。同时，我们的技术避免了复杂的光谱检测，我们将该方法应用于炎症标志物crp蛋白的检测中，lod为2.36ng/ml。通过对crp蛋白与抗crp抗体互作过程中的超灵敏动态成像，我们测定了蛋白质结合动力学，并证明了其可用于测定蛋白相互作用中的平衡解离常数。另外，我们的研究证明了纳米金颗粒可以进一步的提升等离子体蛋白动态检测的灵敏度。我们的研究为表面等离子体共振(spr)成像检测蛋白浓度提供了新的思路和方法。同时避免了使用昂贵的光谱检测仪器，仅使用普通的白光光源和拍照设备实现亮场成像，没有复杂冗长的信号放大步骤，有望开发一种便携式生物传感器用于疾病的早期检测。[0085]参考文献：[0086][1]stefan，malmqvistmagnus，inger，stenbergesa，liedbergbo，ingemar.bioanalysiswithsurfaceplasmonresonance[j].，1991，5(1-4).[0087][2]laustedchristopher，huzhiyuan，hoodleroy，campbellcharlest.sprimagingforhighthroughput，label-freeinteractionanalysis.[j].combinatorialchemistry&highthroughputscreening，2009，12(8).[0088][3]e.m.yeatman，e.a.ash，surfaceplasmonmiroscopy，electron.lett.23(1987)1091-1092.[0089][4]中国发明专利“一种人类唾液中c型反应性蛋白彩色成像的方法及装置”(cn110118875a)[0090][5]c.l.wong，m.olivo，surfaceplasmonresonanceimagingsensors:areview，plasmonics9(2014)809-824.[0091][6]gregoryd.vanwiggeren，maggiea.bynum，johnp.ertel，stanleyjefferson，karlam.robotti，evanp.thrush，douglasm.baney，kevinp.killeen.anovelopticalmethodprovidingforhigh-sensitivityandhigh-throughputbiomolecularinteractionanalysis[j].sensors&actuators:b.chemical，2007，127(2).[0092][7]y.li，h.j.lee，r.m.corn，detectionofproteinbiomarkersusingrnaaptamermicroarraysandenzymaticallyamplifiedsurfaceplasmonresonanceimaging，anal.chem.79(2007)1082-1088.[0093][8]w.h.hu，h.m.chen，z.z.shi，l.yu，dualsignalamplificationofsurfaceplasmonresonanceimagingforsensitiveimmunoassayoftumormarker，anal.biochem.453(2014)16-21.[0094][0095][9]c.walgama，z.h.almubarak，b.zhang，m.akinwale，a.pathiranage，j.p.deng，k.d.berlin，d.m.benbrook，s.krishnan，label-freereal-timemicroarrayimagingofcancerprotein-proteininteractionsandtheirinhibitionbysmallmolecules，anal.chem.88(2016)3130-3135.[0096][10]w.h.hu，h.m.chen，h.h.zhang，g.l.he，x.li，x.x.zhang，y.liu，c.m.li，sensitivedetectionofmultiplemycotoxinsbyspriwithgoldnanoparticlesassignalamplificationtags，j.colloidinterfacesci.431(2014)71-76.[0097][11]s.joshi，r.m.annida，h.zuilhof，t.a.vanbeek，m.w.f.nielen，analysisofmycotoxinsinbeerusingaportablenanostructuredimagingsurfaceplasmonresonancebiosensor，j.[0098][12]vogelsteinb，kinzlerkw，digitalpcr.procnatlacadsciusa1999；96:9236–41[0099][13]huggettjimf，cowensimon，foycarolea.considerationsfordigitalpcrasanaccuratemoleculardiagnostictool.[j].clinicalchemistry，2015，61(1).[0100][14]gevenslebenheidrun，garcia-muri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技术领域：
：，更具体地，涉及一种基于数字等离子免疫吸附测定法的蛋白质结合动力学超灵敏动态成像分析方法。
背景技术：
：：2.表面等离子体共振(spr)生物传感器因其产生的倏逝场对局部折射率(ri)的变化具有很高的灵敏度，现已成为研究生物分子相互作用动力学的重要工具[1-2]。表面等离子体共振(spr)成像的提出[3]将spr技术与成像系统紧密结合在一起，成为具有无标记、高通量、原位和实时检测分子相互作用等特性的技术[5]。可应用于测量大分子结合过程中的特异性、亲和力和动力学参数，如蛋白质-蛋白质、蛋白质-dna、受体药物和细胞/病毒-蛋白质结合[6]。在疾病的早期诊断[7，8]、药物筛选[9]和食品质量控制[10，11]中得到越来越广泛的应用。[0003]数字pcr(dpcr)的概念自1999年首次提出以来[12],便引发人们的持续关注，相比于实时定量pcr(qpcr)，dpcr能提供更敏感、更具重复性的临床方法[13]。数字pcr(dpcr)是一种应用日益广泛的技术，在核酸的检测和定量方面具有许多优点[14]。近年来，随着微流控和乳液化学的发展，工艺更加简化和自动化使得dpcr变得更加实用，越来越多地应用于临床检测中，包括肿瘤学[15，16]和传染病[17-18]以及胎儿基因筛查[19，20]和预测移植排斥反应[21]。[0004]本发明发明人在前研究得到了一种人类唾液中c型反应性蛋白彩色成像的方法及装置[4]，虽然能够在一定程度上解决c反应蛋白定量分析，但该专利中介绍的方法也仅能进行c反应蛋白定量分析。技术实现要素：[0005]针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种基于数字等离子免疫吸附测定法的蛋白质结合动力学超灵敏动态成像分析方法，通过引入金钛等离子体纳米孔阵列的高灵敏度成像传感器，以及基于该传感器的数字等离子体免疫吸附测定法，通过结合经典的泊松统计算法和数字表面等离子体共振(spr)图像技术，可以定量测定低浓度的蛋白质并表现出优越的性能。本发明使用该传感器从spr图像中检测c反应蛋白(crp)和抗crp抗体结合信息，避免了复杂的光谱检测，可用于通过使用正常白光检测lod为2.36ng/ml的炎症标志物crp蛋白。此外，我们分析了蛋白质结合动力学，并证明本发明方法还可用于通过crp蛋白与抗crp抗体相互作用期间的超灵敏动态成像来确定蛋白质相互作用中的平衡解离常数。并且，由于等离子体纳米孔阵列的高性能，本发明中的方法有望用于未来的可见光便携式光学传感等方面。[0006]为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种基于数字等离子免疫吸附测定法的c型反应性蛋白浓度定量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：[0007](i)准备不同crp蛋白浓度的标准品，对于每一个标准品：[0008](i-1)准备洁净的等离子传感芯片，用于产生等离光子谐振耦合效应的设备；[0009](i-2)在等离子传感芯片上覆盖crp抗体，用于特异性结合crp蛋白；[0010](i-3)将等离子传感芯片固定在光学显微镜中，然后将去离子水滴加到该等离子传感芯片上，通过光学显微镜得到明场显微彩色图片作为参考图像，并记录芯片采集区域，计算参考图像芯片采集区域内像素值不超过预先设置阈值的像素点的个数，记为count1；[0011](i-4)将该crp蛋白浓度的标准品滴加到所述等离子传感芯片上，待反应完全后通过光学显微镜得到明场显微彩色图片作为检测图像，保持芯片采集区域不变，计算该标准品处理所对应的检测图像芯片采集区域内像素值不超过预先设置阈值的像素点的个数count2；[0012](i-5)定义像素点数目的变化率表示为p，且p＝(count1-count2)/count1，得到与该标准品浓度相对应的p值；[0013](ii)根据不同crp蛋白浓度的标准品所对应的p值，基于泊松分布算法，推导出拟合公式：得到p与crp浓度c的标准拟合曲线，由拟合曲线确定系数k1、k2的值，得到浓度定量公式：c＝k1×in(1-k2×p)；[0014](iii)针对待检测crp蛋白浓度的待测液，先重复步骤(i-1)和步骤(i-2)和步骤(i-3)，接着将这一待测液滴加到该等离子传感芯片上，待反应完全后通过光学显微镜得到明场显微彩色图片，得到该待测液处理所对应的检测图像，保持芯片采集区域不变，计算检测图像芯片采集区域内像素值不超过预先设置阈值的像素点的个数count3；[0015](iv)定义p’＝p＝(count1-count3)/count1，然后将p’代入所述步骤(ii)得到的浓度定量公式中，得到该待测液的crp浓度值，从而完成crp蛋白浓度的测定。[0016]作为本发明的进一步优选，所述明场显微彩色图片均用matlab进行自动化图像处理，具体的，是先对初始明场显微彩色图片进行模拟信号化处理，得到模拟信号图像；该模拟信号图像中的任意一个像素点的像素值为初始图片中对应像素点处的r通道强度值与rgb三通道强度值之和的比；[0017]然后，根据预先设置的阈值，将所述模拟信号图像二值化处理，得到数字信号图像；该数字信号图像中的任意一个像素点的像素值为0或1。[0018]作为本发明的进一步优选，所述步骤(i)中，所述不同crp蛋白浓度的标准品它们的crp蛋白浓度均分布在0～50ng/ml；[0019]更优选的，所述不同crp蛋白浓度的标准品至少包括2种crp蛋白浓度的标准品；[0020]所述步骤(iii)中，所述待检测crp蛋白浓度的待测液是由待检测crp蛋白浓度的初始溶液经稀释得到的。[0021]作为本发明的进一步优选，所述步骤(i-1)中，所述等离子传感芯片具有纳米孔阵列，并且在纳米孔阵列的表面还设置有钛黏附层和黄金层；更优选的，所述纳米孔阵列的周期为350nm；上下直径分别为180nm和160nm，高度为500nm；所述钛黏附层的厚度为9nm，所述黄金层的厚度为110nm。[0022]作为本发明的进一步优选，所述检测图像均是在水中获得的。[0023]按照本发明的另一方面，本发明提供了一种基于数字等离子免疫吸附测定法的c型反应性蛋白动态结合动力学成像分析方法，其特征在于，包括以下步骤：[0024]s1：准备洁净的等离子传感芯片，用于产生等离光子谐振耦合效应的设备；[0025]s2：在等离子传感芯片上覆盖crp抗体，用于特异性结合crp蛋白；[0026]s3：将等离子传感芯片固定在光学显微镜中，接着将已知蛋白浓度的待分析样品滴加到该等离子传感芯片上，发生反应；[0027]其中，记滴加瞬间为0时刻，先通过光学显微镜采集得到0时刻所对应明场显微彩色图片，保持芯片采集区域不变，在反应过程中，按照预先设定的时间间隔，采集得到一系列与反应时间相关的明场显微彩色图片；将0时刻得到的芯片采集区域内像素值不超过预先设置阈值的像素点的个数，记为count1；记任意一张明场显微彩色图片所对应的芯片采集区域内像素值不超过预先设置阈值的像素点的个数为count2，即可得到一系列与反应时间相关的count2；[0028]s4：根据p＝(countl-count2)/count1，计算不同反应时间所对应的数字信号变化率p，用公式p＝a(1-e-bt)拟合p与反应时间t的关系曲线，进而计算得到该蛋白与抗体相互作用的平衡解离常数kd；其中，公式p＝a(1-e-bt)中，a、b为待拟合确定的系数。[0029]通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，本发明中的方法既可以进行c反应蛋白定量分析，又能进行c反应蛋白抗原抗体结合动力学分析。本发明首次将数字pcr中的泊松分布算式引入到spr成像检测技术中(如后文图1中的b-e所示)，实现了数字化spr图像技术对crp蛋白浓度的定量检测(如后文图1中的f所示)。同时，我们通过采集蛋白结合过程的动态spr图像，测定了crp和抗crp抗体结合动力学。不同于以往计算spr图像模拟信号均值的方法，数字信号图像通过直接计数变化的敏感像素点来进行检测，通过自动化图像处理的方式实现spr图像从初始图像(如后文图2中的d、g所示)到模拟信号图像(如后文图2中的e、h所示)再到数字信号图像(如后文图2中的f、i所示)的转变。我们使用此方法对缓冲液中人类c反应蛋白(crp，100kda)浓度进行了定量检测，这是一种广泛用于急性炎症疾病临床诊断和治疗的生物标记物[22-25]。我们证明了检测极限(lod)低至2.36ng/ml。这一结果至少比血浆crp水平低3个数量级。并且，本发明还可用于通过crp蛋白与抗crp抗体相互作用期间的超灵敏动态成像，先得到数字信号变化率p，并根据p利用公式p＝a(1-e-bt)拟合p与反应时间t的关系曲线，再基于现有技术，由该关系曲线即可确定蛋白质相互作用中的平衡解离常数。[0030]本发明为表面等离子体共振(spr)成像检测蛋白浓度提供了新的思路和方法。同时避免了使用昂贵的光谱检测仪器，仅使用普通的白光光源和拍照设备实现亮场成像，没有复杂冗长的信号放大步骤，有望开发一种便携式生物传感器用于疾病的早期检测。附图说明[0031]图1是本发明数字化图像蛋白检测原理图。其中，图1中的a对应实验系统示意图。图1中的b对应稀释后的crp蛋白随机分散到芯片表面各处并与固定在芯片表面的捕获抗体结合，从而附着在芯片表面。此时芯片表面将分为含有crp蛋白的区域和不含有crp蛋白的区域。图1中的c对应过量的检测抗体加入到芯片表面并与捕获的crp蛋白结合进行信号放大，检测抗体的附着引起较大的等离子体共振峰的红移。图1中的d对应利用图像处理手段对含有crp蛋白的区域和不含有crp蛋白的区域进行像素点统计计数。图1中的e对应结合经典数字pcr泊松分布算法推导出数字spr算法。图1中的f对应用推导公式对1-50ngcrp蛋白进行指数拟合，确定相关系数。[0032]图2是spr图像处理分析流程。其中，图2中的a对应纳米孔生物传感芯片在白光照明下进行明场成像，用ccd相机记录真彩色spr图像。图2中的b为芯片sem图像。图2中的c展示了三明治夹心法放大示意图，crp蛋白与固定在芯片表面的捕获抗体结合，接着被检测抗体所识别。图2中的d和图2中的g是从ccd相机中获取的原始图片经过预处理后的初始图片，初始图片记录了345ꢀ×345um2的芯片表面区域。包含了1000×1000个像素点。并增加了50％的亮度和20％的对比度用以显示。其中图2中的d为加入检测抗体前图2中的b获取的图片。图2中的g为加入检测抗体后图2中的c获取的图片。图2中的e和图2中的h分别是图2中的d和图2中的g计算每个像素点处r/(r g b)值后得到的模拟信号图像，并以热图的形式呈现。模拟信号均值由图2中的e到图2中的h图像均值的变化率所得。图2中的f和图2中的i分别是图2中的e和图2中的h经过二元化后得到的数字信号图像，并以热图的形式呈现。模拟信号计数值由图2中的f到图2中的i像素点数目的变化率所得。实现对crp蛋白的数字化spr信号检测。[0033]图3是crp的动态和定量分析。其中，图3中的a为1μg/mlcrp动态检测中，在不同时间获得的初始图像，亮度增加50％，对比度增加20％进行显示。图3中的b为初始图像图3中的a转换而来的数字信号图像。图3中的c显示加入检测抗体(crp浓度为1μg/ml)后数字信号计数值(vdsc)随时间的变化曲线。图3中的d不同浓度crp蛋白结合的vdsc随时间的动态变化。图3中的e不同浓度的crp可以从数字信号图像中直观地区分出来。图3中的f条形图显示了不同浓度的crp样品的数字信号计数值(vdsc)，误差条表示三个重复样品的标准偏差。图3中的g对应crp校准曲线(lod＝2.36ng/ml)，拟合系数为0.985。[0034]图4是纳米金颗粒增强的蛋白结合数字化动态信号提取。其中，图4中的a不同时刻下获取的初始图像，图像增加50％亮度和20％对比度用于显示。图4中的b对应时刻下初始图像数字化处理后的热图图像。图4中的c和图4中的d分别显示了在1μg/ml和1ng/mlcrp的动态图像检测中金颗粒增强和没有金颗粒的数字信号计数值随时间的动态变化对比。具体实施方式[0035]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。[0036]准备工作：[0037]等离子传感芯片的制造[0038]我们使用复制成型工艺来制备纳米等离子体传感器芯片。原始模具是通过激光干涉光刻在氧化硅片上制成的锥形纳米柱阵列。在复制之前，将模具硅烷化以获得疏水性。然后，将norland光学粘合剂(noa-61)均匀且无气泡地涂覆在清洁的模具上，然后将pet薄板放置在模具的顶部。经过90秒钟的紫外线(105mw/cm^2)照射后，将表面具有纳米孔阵列的pet薄片小心地从模具上剥离。最后，使用电子束蒸发机在具有纳米孔阵列的pet表面上沉积9nm钛和110nm金，以制成纳米等离子体传感器芯片。所得的纳米杯阵列具有350nm的周期，180nm的直径和500nm的高度。[0039]仿真设置[0040]我们使用市售的三维有限差分时域(3d-fdtd)方法来研究纳米杯芯片的远场透射光谱的相关变化。我们在厚度为1000nm的基板(ri＝1.56)上构建了一个纳米杯。纳米杯阵列的周期为350nm，纳米杯的顶部直径，底部直径和深度分别为180nm，160nm和500nm。依次在杯子的上方放置一个9nm的ti层和一个110nm的au层(johnson和christy的光学参数)。金颗粒小球的直径为30nm。光源放置在纳米杯结构上方，并沿法线入射方向传播到基板。模拟总面积为350nmx350nmx2000nm。沿x和y方向应用周期性边界条件，并沿z轴应用完美匹配的层以消除边界的任何干扰。[0041]光学设置[0042]使用olympusix73立式荧光显微系统获取透射模式下的明场显微彩色图片。使用100w的卤素灯作为光源，光路包括一块毛玻璃、na为0.3的聚光镜和10倍放大倍数，na为0.3的物镜。rgb真彩色图片由cellsens软件控制的基于电荷耦合器件的(ccd)相机采集,曝光时间设定为25ms,数字增益为1。利用光谱仪(ihr320horiba)来获取透射光谱。来自样品的透射光谱用光源光谱进行归一化以获得最终的透射数据。光谱数据的采集由定制的labview程序控制。[0043]图像处理[0044]获取的所有rgb图像先用imagej软件进行预处理，使用软件内置的registervirtualstack功能对图片进行刚性配准，将配准后的图片剪裁为1000×1000像素大小的图片作为初始图像。后续的图像处理与分析均在matlab软件中进行。模拟信号图像是通过计算初始图像每个像素点处r通道强度值与rgb三通道强度值和的比值(r/(r g b))得到的，通过这个简单的转换，在一定程度上消除了由光源和样品波动引起的图像总体强度的变化[32],获得了更加稳定可靠的具有等离子体特征的信号。[0045]数字信号图像是将模拟信号图像通过设定阈值进行二元化后获得的。我们通过matlab程序，将大于阈值的像素点的值设为1，小于阈值的像素点的值设为0,图像被分割为像素值为1的区域和值为0的区域。数字信号计数值是通过计算数字信号图像中像素值为0的像素点数目的变化率得到的：[0046]vdsc＝(count1-count2)/count1[0047]count1、count2分别为加入检测抗体前后获取的数字信号图像中像素值为0的像素点的个数。内置的matlab颜色图(autumn)用于模拟信号图像和数字信号图像的可视化。[0048]试剂[0049]蔗糖，己基硅烷，乙醇，碳酸钾，11-巯基烷酸(mua)，1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edc)，n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，牛血清白蛋白(bsa)，乙醇胺，纯化的crp和磷酸盐缓冲液(pbs)缓冲液购自sigma-aldrich，单克隆抗crp捕获和检测抗体购自sinobiological。[0050]纳米金颗粒标记抗crp抗体[0051]将1.5ml30nm金纳米粒子溶液与5μl1mg/ml抗crp抗体混合，通过添加稀释的0.01m碳酸钾溶液将胶体au-nps溶液的ph值调节至ph7.2，孵育后，将10μltris-hcl1×和1％bsa封闭液加入金标记溶液中10分钟。然后将au-nps悬浮液以7200rpm的速度离心20分钟。离心和重悬步骤重复3次。在最后的重悬步骤中，将au-nps沉淀重悬在100μl的pbs缓冲液中。标记的金颗粒溶液在4℃下储存用于进一步的实验。通过紫外可见分光光度计测定溶液的吸光度，计算出金nps的浓度为0.28nm。[0052]crp蛋白检测流程[0053]首先用70％乙醇和去离子水清洗芯片表面，然后在去离子水中采集透射光谱和图片，并记录采集区域。加入1mm的mua溶液(在乙醇中)到芯片表面，在室温下孵育24小时，去除mua溶液后，用70％乙醇和去离子水清洗芯片两次。然后在去离子水中采集记录区域的透射光谱和图片。在室温下将芯片在400mmedc和100mmnhs的1∶1混合物中孵育30分钟，然后立即与50μg/ml单克隆抗crp捕获抗体(在pbs中)在4℃下孵育12h。用pbs和去离子水清洗芯片表面，然后在去离子水中采集记录区域的透射光谱和图片。先后在60μg/mlbsa封闭溶液和10％乙醇胺溶液中各孵育芯片30分钟。用去离子水冲洗芯片两次，然后在去离子水中采集记录区域的透射光谱和图片。将芯片在不同浓度的crp(在pbs中)中孵育2小时。用pbs和去离子水冲洗后在去离子水中采集记录区域的透射光谱和图片。最后，加入50μg/ml单克隆抗crp检测抗体(在pbs中)至芯片表面，采集记录区域随时间变化的动态图片。2h后用pbs和去离子水冲洗芯片，在去离子水中采集记录区域的透射光谱和图片。[0054]结果讨论如下：[0055]数字化spr信号检测crp蛋白含量[0056]图1中的a显示了检测装置的示意图，我们的实验是在荧光倒置显微镜上进行的，用普通的100w卤素灯进行照明，透射模式的图像在2448×1920像素的真彩色ccd相机上曝光25ms后记录下来(如图2中的a所示)。使用0.3na的聚光镜和0.3nt，10倍放大的物镜，可以捕获覆盖844.6×662.4um2区域的图像。由此可以计算出每个像素所覆盖的芯片表面区域的大小约为345×345nm2，这近似于我们所使用的芯片的纳米孔阵列的周期350nm。此外，还可以计算瑞利衍射极限光斑的大小。[0057][0058]这里λ是照明光的波长，na是聚光镜和物镜的数值孔径之和。可以计算出r约为1220nm。注意到衍射限制区域对应于4×4纳米孔单元，这可能表明纳米孔产生的spr信号的变化将影响16个像素。[0059]我们采用三明治夹心法来检测crp蛋白的浓度。简单来说首先芯片表面在mua溶液中形成sam，在用edc和nhs活化羧基后，将crp捕获抗体结合至芯片表面。用bsa与乙醇胺溶液封闭非特异性位点并覆盖剩余nhs。接着将稀释后的crp蛋白溶液加入到芯片表面，溶液中游离的crp蛋白将被芯片表面固定的crp抗体捕获而留在芯片表面。当溶液中的crp浓度较低时，平均每个纳米孔包含一个至多个crp蛋白分子。crp蛋白随机分散至芯片表面的各处并被捕获，使得crp蛋白在芯片表面分布的不均匀性(如图1中的b所示)。最后，过量的crp检测抗体添加到芯片表面与被捕获的crp蛋白进行结合。crp检测抗体在芯片表面的结合改变所在区域环境的ri使得等离子体共振峰的红移，从而芯片表面区域将分为两个部分，含有crp蛋白的区域在与crp检测抗体结合后改变了原来的spr信号，而不含有crp蛋白的区域不能与crp检测抗体结合保持原有的spr信号(如图1中的c所示)。[0060]数字pcr(dpcr)是一种对核酸分子绝对定量及扩增的新技术，由于每个纳米孔中可能结合了两个或两个以上的crp蛋白分子，结合数字pcr的概念，我们引入泊松分布算式[26](如图1中的e所示)来检测低浓度crp蛋白含量。[0061][0062]这里，λ和crp蛋白浓度c有关，有λ＝k1*c。当k＝0(不含有crp蛋白分子)时，上式可化简为：此处概率p可看作spr信号未发生变化的纳米孔区域与检测的纳米孔区域的比值。纳米孔区域的比值可近似用像素点数目的变化来表示，我们将spr信号发生变化的像素点数目的变化率表示为p，即同时由于显微分辨率的限制，spr信号发生变化的区域与像素点数目的变化之间不是一一对应的，需要添加一个矫正系数k2来建立对应关系，则有：p(x＝0)将其表示为p与c的函数得到：[0063][0064]两边取对数可进一步可变性为通用公式：[0065]c＝k1×in(1-k2×p)ꢀꢀ(3)[0066]像素点数目变化率p随crp浓度的函数关系如图1中的f所示。用公式(2)进行拟合，我们发现当crp的浓度低于50ng/ml时，拟合结果较好，r2为0.983。当添加到芯片表面的蛋白溶液浓度过高时，会导致生物分子在芯片表面聚集。分子聚集会降低泊松分布计算的准确性发现使用高浓度crp结果进行拟合时拟合系数值小于0.9，这可能表明较低浓度的crp分子在芯片表面得到更好的分离，对应于dpcr中的关键稀释步骤。因此，可以确定系数的值，方程(3)可以表示为c(crp)＝0.10804×in(1-4.9094％×p)。注意修正系数值接近1/16，说明系数在合理范围内。[0067]图像处理流程[0068]采集的显微图片在经过imagej进行预处理(详见材料与方法)后成为1000×1000像素大小的初始图片(如图2中的d、g所示)，初始图片包含了345×345um2的芯片表面区域。图像预处理是必要的，它提高了检测的精确度和后续图像处理的运算速度。[0069]初始图片在导入到matlab软件后，我们使用上述方法计算每个像素点处r/(r g b)的值来作为每个像素点处的spr信号值，经过转换后的得到能准确反应spr信号的模拟信号图像(如图2中的e、h所示)。初始图片在crp检测中的变化微弱，肉眼难以看出区别。、我们使用二元化的方法进一步处理模拟信号图片，将其转换为数字信号图片(如图2中的f、i所示)。我们选择合适的阈值，将高于阈值的像素点的值设置为1，将低于阈值的像素点的值设置为0。阈值的选取是动态的，考虑到实验中使用的芯片之间的差异性，对于不同的芯片下拍摄的图片，应采取相同的阈值标准而不是相同的阈值大小。为保证提取信号的准确性和灵敏性，我们使用加入检测抗体前拍摄的模拟信号图片的中值作为阈值，加入检测抗体后拍摄的时间序列图片都使用此阈值，在检测抗体与固定于芯片表面的crp蛋白结合后，环境ri的值发生变化，等离子体共振峰红移。导致图像像素点r/(r g b)的值增大，原本低于阈值的像素点越过阈值成为值为1的像素点，值为1的像素点数目因而增多。crp的浓度越高，固定于芯片表面的crp蛋白数目则越多，crp蛋白和检测抗体结合后，导致发生跃迁的像素点数目变多，从而构建了crp蛋白浓度变化与跃迁像素点数目变化之间的联系。[0070]方法对比及动力学定量[0071]图3中的a-d为芯片表面crp与crp检测抗体动态结合过程的信号提取。加入检测抗体后得到时间序列图片集。取0时刻的图片作为参考图像，后续的图像作为检测图像。通过检测图像与不同时间获取的参考图像之间的相对变化，提取动态结合信息。图3中的a为动态检测1μg/mlcrp时不同时刻获得的初始图片。初始图片亮度增加50％，对比度增加20％用以显示。通过初始图像的对比，肉眼几乎看不到spr信号随反应过程的变化。图3中的b显示了从初始图像(如图3中的a所示)转换而来的数字信号图像的图像热图。通过比较不同时刻的数字信号图像，可以直观地观察到反映crp和抗crp抗体动态结合信息的spr信号变化。图3中的c为1μg/mlcrp与检测抗体结合的动态曲线，并且图中的每个点都是从检测图像中计算出来的。[0072]我们在之前的研究中己经证明了lspr系统可以提供分子间相互作用速率并用来测定动力学常数[28]。我们的研究发现，动态数字信号图像同样可以用来测定动力学常数。我们将获取的动态数字信号图像应用于crp蛋白结合动力学分析。动力学常数值通过(如图3中的d所示)确定，拟合函数为y＝a(1-ebx)。从图中可以看到25μg/ml和50μg/mlcrp蛋白拟合曲线在反应一段时间后几乎重叠，这说明该体系在crp浓度为50μg/ml时达到饱和。crp蛋白和检测抗体(da)之间的生物分子相互作用可以建模为：[0073]d[da-crp]/dt＝ka[da][crp]-kd[da-crp]ꢀꢀ(4)[0074]这里ka为结合速率常数，kd为解离速率常数。方程(4)可改写为下式[29]：[0075][0076]这里rmax的值可以通过检测50μg/mlcrp下反应达到平衡时的数字信号相对变化率来确定，即最大信号变化。从图中可以看到25μg/ml和50μg/mlcrp拟合曲线在反应一段时间后几乎重叠，由于芯片表面crp捕获抗体的数量是一定的，因此可结合的crp分子数量有限，说明该体系在crp浓度为50μg/ml时达到了饱和。通过计算拟合系数较好(r2＞0.94)，且远离饱和值(＜90％rmax)的拟合曲线，得到ka与kd计算值分别3.328×106(±0.36×106)m-1s-1和2.15×10-2(±0.21×10-2)s-1。平衡解离常数kd由算式kd＝kd/ka得出，计算值为6.46×10-9(±0.31×10-9)m。kd的计算值接近用纳米粒子放大spr成像传感器测的结果[30]。[0077]我们使用从初始图像转换而来的数字信号图像来检测crp蛋白浓度。检测结果是从检测图像与参考图像的相对变化中获得的。不同浓度的crp可以通过数字信号图像直观的区分(如图3中的e所示)。图3中的f显示了数字方法检测crp蛋白浓度的结果。误差棒代表三个重复样本的标准偏差。在对照组中，数字信号图像值为1的像素点数目减少，导致变化率为负。相反的信号变化可能是由于表面抗体的分离和外部环境变化引起的误差。图3中的g显示了数字信号计数值(vdsc)随crp浓度(从1-500ng/m1)在对数刻度上的变化，拟合系数为0.985。拟合结果证明crp的对数浓度在1-500ng/ml的动态范围内与数字信号的相对变化率呈线性相关。lod经计算为2.36ng/ml。这至少比血浆crp水平低三个数量级。如表1所示，我们方法的crp检测性能与其他报道的生物传感器相当。[0078]表1crp检测方法性能的比较[0079][0080]纳米金颗粒增强的数字化动态蛋白检测[0081]纳米金颗粒在芯片表面能够抑制远场产生eot峰值，提供基于透射光强度变化的spr信号增强效果，hatice等通过在检测抗体上标记纳米金颗粒的方法极大的提高了等离子体器件检测蛋白浓度的性能[31]，但是他们并不能实时动态的检测芯片表面蛋白的相互作用。在本研究中，我们利用较小的纳米金颗粒(直径约30nm)标记检测抗体，采用基于图像像素点强度的阈值分割模式获得纳米金颗粒增强的数字化动态图片。来进一步增强实时动态检测芯片表面蛋白相互作用的灵敏度。[0082]图4中的a显示了1μg/mlcrp与aunps标记的crp检测抗体动态结合过程中不同时刻获得的初始图像。初始图像是通过增加50％的亮度和20％的对比度来显示的。由于金颗粒标记的抗体溶液呈现红色，初始图像的颜色呈鲜明的血红色，这与(如图3中的a所示)明显不同。另一个区别是当aunps标记的检测抗体与芯片表面上的crp结合时，透光率显著下降。图像亮度的下降反映了spr信号的变化，但肉眼几乎观察不到。图4中的b显示了从初始图像转换而来的数字信号图像的热图。通过图像热图的变化可以清楚地观察到反应过程中spr信号的变化。与图3中有b相比，可以观察到，从1分钟到5分钟，热图图像中更多的黄色像素变为红色像素。在100分钟时，红色像素的分布范围和密度远大于无金颗粒时100分钟时的热图(如图3中的b所示)。这表明在同样浓度crp的检测中金粒子增强后spr信号变化更快更大。[0083]图4中的c、d均用函数y＝a(1-ebx)进行拟合。图4中的c为1μg/mlcrp动态图像检测中金颗粒增强或空白的数字信号计数值随时间的动态变化。纳米金颗粒增强的数字信号计数值进一步增强了数字动态蛋白质检测的灵敏度，纳米金颗粒增强后的数字信号计数值的相对变化率在20min左右达到35％，相较于不加金颗粒的数字信号计数值在20min左右达到9％的相对变化率提升约4倍。从图4中的d可以观察到，在检测相对低浓度(1ng/ml)的crp蛋白时，加入带有金颗粒的检测抗体获得了相当大的相对变化率。这表明纳米金颗粒进一步增强了血浆装置蛋白质检测的性能。在纳米金颗粒的辅助增强下，有望进一步提高crp蛋白动态检测中的检测性能，将检测限提高到pg/ml水平。[0084]可见，本发明提出了一种基于纳米孔生物传感器的数字等离子免疫吸附测定法。该方法对低浓度蛋白检测有着高敏感性。与数字pcr检测类似，数字化spr图像分析方法结合泊松分布算法可用于对低浓度蛋白的定量检测。我们证明，使用此方法能有效获取spr图像中的蛋白结合信息。同时，我们的技术避免了复杂的光谱检测，我们将该方法应用于炎症标志物crp蛋白的检测中，lod为2.36ng/ml。通过对crp蛋白与抗crp抗体互作过程中的超灵敏动态成像，我们测定了蛋白质结合动力学，并证明了其可用于测定蛋白相互作用中的平衡解离常数。另外，我们的研究证明了纳米金颗粒可以进一步的提升等离子体蛋白动态检测的灵敏度。我们的研究为表面等离子体共振(spr)成像检测蛋白浓度提供了新的思路和方法。同时避免了使用昂贵的光谱检测仪器，仅使用普通的白光光源和拍照设备实现亮场成像，没有复杂冗长的信号放大步骤，有望开发一种便携式生物传感器用于疾病的早期检测。[0085]参考文献：[0086][1]stefan，malmqvistmagnus，inger，stenbergesa，liedbergbo，ingemar.bioanalysiswithsurfaceplasmonresonance[j].，1991，5(1-4).[0087][2]laustedchristopher，huzhiyuan，hoodleroy，campbellcharlest.sprimagingforhighthroughput，label-freeinteractionanalysis.[j].combinatorialchemistry&highthroughputscreening，2009，12(8).[0088][3]e.m.yeatman，e.a.ash，surfaceplasmonmiroscopy，electron.lett.23(1987)1091-1092.[0089][4]中国发明专利“一种人类唾液中c型反应性蛋白彩色成像的方法及装置”(cn110118875a)[0090][5]c.l.wong，m.olivo，surfaceplasmonresonanceimagingsensors:areview，plasmonics9(2014)809-824.[0091][6]gregoryd.vanwiggeren，maggiea.bynum，johnp.ertel，stanleyjefferson，karlam.robotti，evanp.thrush，douglasm.baney，kevinp.killeen.anovelopticalmethodprovidingforhigh-sensitivityandhigh-throughputbiomolecularinteractionanalysis[j].sensors&actuators:b.chemical，2007，127(2).[0092][7]y.li，h.j.lee，r.m.corn，detectionofproteinbiomarkersusingrnaaptamermicroarraysandenzymaticallyamplifiedsurfaceplasmonresonanceimaging，anal.chem.79(2007)1082-1088.[0093][8]w.h.hu，h.m.chen，z.z.shi，l.yu，dualsignalamplificationofsurfaceplasmonresonanceimagingforsensitiveimmunoassayoftumormarker，anal.biochem.453(2014)16-21.[0094][0095][9]c.walgama，z.h.almubarak，b.zhang，m.akinwale，a.pathiranage，j.p.deng，k.d.berlin，d.m.benbrook，s.krishnan，label-freereal-timemicroarrayimagingofcancerprotein-proteininteractionsandtheirinhibitionbysmallmolecules，anal.chem.88(2016)3130-3135.[0096][10]w.h.hu，h.m.chen，h.h.zhang，g.l.he，x.li，x.x.zhang，y.liu，c.m.li，sensitivedetectionofmultiplemycotoxinsbyspriwithgoldnanoparticlesassignalamplificationtags，j.colloidinterfacesci.431(2014)71-76.[0097][11]s.joshi，r.m.annida，h.zuilhof，t.a.vanbeek，m.w.f.nielen，analysisofmycotoxinsinbeerusingaportablenanostructuredimagingsurfaceplasmonresonancebiosensor，j.[0098][12]vogelsteinb，kinzlerkw，digitalpcr.procnatlacadsciusa1999；96:9236–41[0099][13]huggettjimf，cowensimon，foycarolea.considerationsfordigitalpcrasanaccuratemoleculardiagnostictool.[j].clinicalchemistry，2015，61(1).[0100][14]gevenslebenheidrun，garcia-muri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