一种诱导墨兰根状茎增殖的培养基及其制备方法与流程

1.本发明涉及墨兰种植技术领域，具体涉及一种诱导墨兰根状茎增殖的培养基及其制备方法。


背景技术：

2.墨兰，兰科兰属地生植物；生于海拔300-2000米的林下、灌木林中或溪谷旁湿润但排水良好的荫蔽处。
3.中国专利cn106035090b公开了通过培养基的设计，实现春兰根状茎的快速繁殖和分化。其过程包括将无菌春兰根状茎接种至增殖培养基中，增殖9倍，转至分化培养基中，15天后有幼芽的分化，获得春兰试管苗。本发明方法使用的两种培养基，所用成分均为常规培养基成分，但却可以大大减少根状茎和培养基的褐化率；
4.现有技术中，墨兰在生长过程中，其根状茎增殖率不高，主要靠分株繁殖，但繁殖周期长而且繁殖率低，不能形成规模种植的问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的就在于解决上述背景技术的问题，而提出一种诱导墨兰根状茎增殖的培养基及其制备方法，在磷酸酯钾盐类主诱导剂和6-苄氨基嘌呤、氯化胆碱副促进剂的配合下，对墨兰的根状茎增殖具有很好的促进作用，大大提高墨兰根茎的增殖系数。
6.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
7.一种诱导墨兰根状茎增殖的培养基的制备方法，包括以下步骤:
8.步骤一、配制诱导剂：通过向4-羟基香豆素的乙酸乙酯溶液中，先加入三乙胺，再滴加三氯氧磷的乙酸乙酯溶液，反应2h，抽滤，滤液用氢氧化钾调节ph至中性，得到磷酸酯钾盐类主诱导剂；然后向磷酸酯钾盐类主诱导剂中添加以6-苄氨基嘌呤、氯化胆碱为原料的副诱导剂，将主诱导剂与副诱导剂混匀，得到培养基诱导剂；
9.步骤二、配制复合基质：将草炭与沙土混合，灭菌、冷却，得到复合基质；
10.步骤三、将诱导剂和复合基质在无菌条件下混匀后，加入到含有中药提取物的琼脂中，得到培养基。
11.中药提取物的制备工艺包括以下步骤：
12.步骤1：取30g玉竹和紫参，用300-500ml水溶解后，加入800-1000ml无水乙醇，以5000r/min的转速进行离心沉淀，倾去上清液，再用100-120ml的乙醇洗涤两次，离心后取沉淀物进行干燥，得到初品；
13.步骤2：按照质量比1:10将初品与去离子水混合后，过纤维素柱，用蒸馏水以50ml/h的流速洗脱后，收集，再通过旋蒸去除溶剂，得到中药提取物；
14.其中，玉竹与紫参的质量比为1-2:1-2。
15.作为本发明进一步的方案：在步骤一中，4-羟基香豆素的乙酸乙酯溶液的质量分数为16％，三氯氧磷的乙酸乙酯溶液的质量分数为50％。
16.作为本发明进一步的方案：在步骤一中，4-羟基香豆素的乙酸乙酯溶液、三乙胺和三氯氧磷的乙酸乙酯溶液的质量比为110-130:8-12:40-50。
17.作为本发明进一步的方案：在步骤一中，反应温度控制在-5-0℃。
18.作为本发明进一步的方案：在步骤一中，ph调节后，通过先旋蒸除去溶剂和水，再烘干得到粗品，粗品经柱层析进行后处理。
19.作为本发明进一步的方案：在步骤一中，6-苄氨基嘌呤与氯化胆碱的质量比为2-3:150-160；主诱导剂与副诱导剂的质量比为10-20:0.5-0.8。
20.作为本发明进一步的方案：在步骤二中，草炭与沙土的质量比为4-6:4-6；灭菌的温度为100-150℃，灭菌的时间为6-8min。
21.作为本发明进一步的方案：在步骤三中，诱导剂、复合基质、中药提取物和琼脂的质量比为50-60mg：500-800g:80-100mg:60-100g。
22.一种诱导墨兰根状茎增殖的培养基，包括以下重量份原料:诱导剂、复合基质、中药提取物和琼脂的质量比为50-60mg：500-800g:80-100mg:60-100g；
23.其中，诱导剂包括以下重量份原料：主诱导剂与副诱导剂的质量比为10-20:0.5-0.8；
24.复合基质包括以下重量份原料：草炭与沙土的质量比为4-6:4-6。
25.本发明的有益效果：
26.本发明以4-羟基香豆素与三氯氧磷原料合成得到磷酸酯钾盐类物质，其磷酸酯钾盐类化合物对墨兰根状茎增殖具有很好促进作用，而6-苄氨基嘌呤、氯化胆碱对墨兰的根状茎也具有着促进的作用，所以，在磷酸酯钾盐类主诱导剂和6-苄氨基嘌呤、氯化胆碱副促进剂的配合下，对墨兰的根状茎增殖具有很好的促进作用，大大提高墨兰根茎的增殖系数；以及，本发明的主诱导剂的合成路线简易，原料易得，价格低廉，产率较高；
27.本发明的中草药对墨兰的根状茎起到促进作用，将玉竹与紫参组合制成一种绿色、天然根茎诱导剂。
具体实施方式
28.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
29.实施例1
30.一种诱导墨兰根状茎增殖的培养基，包括以下重量份原料:诱导剂、复合基质、中药提取物和琼脂的质量比为50mg：500g:80mg:60g；
31.其中，诱导剂包括以下重量份原料：主诱导剂与副诱导剂的质量比为10:0.5；
32.复合基质包括以下重量份原料：草炭与沙土的质量比为4:4。
33.一种诱导墨兰根状茎增殖的培养基的制备方法，包括以下步骤:
34.步骤一、配制诱导剂：通过向4-羟基香豆素的乙酸乙酯溶液中，先加入三乙胺，再滴加三氯氧磷的乙酸乙酯溶液，反应2h，抽滤，滤液用氢氧化钾调节ph至中性，得到磷酸酯钾盐类主诱导剂；然后向磷酸酯钾盐类主诱导剂中添加以6-苄氨基嘌呤、氯化胆碱为原料
的副诱导剂，将主诱导剂与副诱导剂混匀，得到培养基诱导剂；
35.其中，4-羟基香豆素的乙酸乙酯溶液的质量分数为16％，三氯氧磷的乙酸乙酯溶液的质量分数为50％，4-羟基香豆素的乙酸乙酯溶液、三乙胺和三氯氧磷的乙酸乙酯溶液的质量比为110:8:40；反应温度控制在-5℃，ph调节后，通过先旋蒸除去溶剂和水，再烘干得到粗品，粗品经柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝3:1)进行后处理；
36.6-苄氨基嘌呤与氯化胆碱的质量比为2:150；主诱导剂与副诱导剂的质量比为10:0.5；
37.步骤二、配制复合基质：将草炭与沙土混合，灭菌、冷却，得到复合基质；
38.其中，草炭与沙土的质量比为4:4；灭菌的温度为100℃，灭菌的时间为6min；
39.步骤三、将诱导剂和复合基质在无菌条件下混匀后，加入到含有中药提取物的琼脂中，得到培养基。
40.其中，诱导剂、复合基质、中药提取物和琼脂的质量比为50mg：500g:80mg:60g；
41.中药提取物的制备工艺包括以下步骤：
42.步骤1：取30g玉竹和紫参，用300ml水溶解后，加入800ml无水乙醇，以5000r/min的转速进行离心沉淀，倾去上清液，再用100ml的乙醇洗涤两次，离心后取沉淀物进行干燥，得到初品；
43.步骤2：按照质量比1:10将初品与去离子水混合后，过纤维素柱，用蒸馏水以50ml/h的流速洗脱后，收集，再通过旋蒸去除溶剂，得到中药提取物；
44.其中，玉竹与紫参的质量比为1:1。
45.实施例2
46.一种诱导墨兰根状茎增殖的培养基，包括以下重量份原料:诱导剂、复合基质、中药提取物和琼脂的质量比为55mg：650g:90mg:80g；
47.其中，诱导剂包括以下重量份原料：主诱导剂与副诱导剂的质量比为15:0.6；
48.复合基质包括以下重量份原料：草炭与沙土的质量比为5:5。
49.一种诱导墨兰根状茎增殖的培养基的制备方法，包括以下步骤:
50.步骤一、配制诱导剂：通过向4-羟基香豆素的乙酸乙酯溶液中，先加入三乙胺，再滴加三氯氧磷的乙酸乙酯溶液，反应2h，抽滤，滤液用氢氧化钾调节ph至中性，得到磷酸酯钾盐类主诱导剂；然后向磷酸酯钾盐类主诱导剂中添加以6-苄氨基嘌呤、氯化胆碱为原料的副诱导剂，将主诱导剂与副诱导剂混匀，得到培养基诱导剂；
51.其中，4-羟基香豆素的乙酸乙酯溶液的质量分数为16％，三氯氧磷的乙酸乙酯溶液的质量分数为50％，4-羟基香豆素的乙酸乙酯溶液、三乙胺和三氯氧磷的乙酸乙酯溶液的质量比为120:10:45；反应温度控制在-2℃，ph调节后，通过先旋蒸除去溶剂和水，再烘干得到粗品，粗品经柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝3:1)进行后处理；
52.6-苄氨基嘌呤与氯化胆碱的质量比为2:155；主诱导剂与副诱导剂的质量比为15:0.7；
53.步骤二、配制复合基质：将草炭与沙土混合，灭菌、冷却，得到复合基质；
54.其中，草炭与沙土的质量比为5:5；灭菌的温度为120℃，灭菌的时间为7min；
55.步骤三、将诱导剂和复合基质在无菌条件下混匀后，加入到含有中药提取物的琼脂中，得到培养基。
56.其中，诱导剂、复合基质、中药提取物和琼脂的质量比为55mg：700g:90mg:80g；
57.中药提取物的制备工艺包括以下步骤：
58.步骤1：取30g玉竹和紫参，用400ml水溶解后，加入900ml无水乙醇，以5000r/min的转速进行离心沉淀，倾去上清液，再用110ml的乙醇洗涤两次，离心后取沉淀物进行干燥，得到初品；
59.步骤2：按照质量比1:10将初品与去离子水混合后，过纤维素柱，用蒸馏水以50ml/h的流速洗脱后，收集，再通过旋蒸去除溶剂，得到中药提取物；
60.其中，玉竹与紫参的质量比为1.5:1.5。
61.实施例3
62.一种诱导墨兰根状茎增殖的培养基，包括以下重量份原料:诱导剂、复合基质、中药提取物和琼脂的质量比为60mg：800g:100mg:100g；
63.其中，诱导剂包括以下重量份原料：主诱导剂与副诱导剂的质量比为20:0.8；
64.复合基质包括以下重量份原料：草炭与沙土的质量比为6:6。
65.一种诱导墨兰根状茎增殖的培养基的制备方法，包括以下步骤:
66.步骤一、配制诱导剂：通过向4-羟基香豆素的乙酸乙酯溶液中，先加入三乙胺，再滴加三氯氧磷的乙酸乙酯溶液，反应2h，抽滤，滤液用氢氧化钾调节ph至中性，得到磷酸酯钾盐类主诱导剂；然后向磷酸酯钾盐类主诱导剂中添加以6-苄氨基嘌呤、氯化胆碱为原料的副诱导剂，将主诱导剂与副诱导剂混匀，得到培养基诱导剂；
67.其中，4-羟基香豆素的乙酸乙酯溶液的质量分数为16％，三氯氧磷的乙酸乙酯溶液的质量分数为50％，4-羟基香豆素的乙酸乙酯溶液、三乙胺和三氯氧磷的乙酸乙酯溶液的质量比为130:12:50；反应温度控制在0℃，ph调节后，通过先旋蒸除去溶剂和水，再烘干得到粗品，粗品经柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝3:1)进行后处理；
68.6-苄氨基嘌呤与氯化胆碱的质量比为3:160；主诱导剂与副诱导剂的质量比为20:0.8；
69.步骤二、配制复合基质：将草炭与沙土混合，灭菌、冷却，得到复合基质；
70.其中，草炭与沙土的质量比为6:6；灭菌的温度为150℃，灭菌的时间为8min；
71.步骤三、将诱导剂和复合基质在无菌条件下混匀后，加入到含有中药提取物的琼脂中，得到培养基。
72.其中，诱导剂、复合基质、中药提取物和琼脂的质量比为60mg：800g:100mg:100g；
73.中药提取物的制备工艺包括以下步骤：
74.步骤1：取30g玉竹和紫参，用500ml水溶解后，加入1000ml无水乙醇，以5000r/min的转速进行离心沉淀，倾去上清液，再用120ml的乙醇洗涤两次，离心后取沉淀物进行干燥，得到初品；
75.步骤2：按照质量比1:10将初品与去离子水混合后，过纤维素柱，用蒸馏水以50ml/h的流速洗脱后，收集，再通过旋蒸去除溶剂，得到中药提取物；
76.其中，玉竹与紫参的质量比为2:2。
77.对比例1
78.本对比例未加入任何诱导剂，为空白对照组；
79.对比例2
80.本对比采用中国专利号为cn104206270b的培养基；
81.对比例3
82.本对比例与实施例1相比，未加入磷酸酯钾盐类主诱导剂；
83.墨兰根茎增殖试验方法：取墨兰即将开裂的蒴果在75％酒精中浸泡30s，再在2％次氯酸钠溶液中浸泡20min(其间不时用手轻轻摇动容器)后，用无菌水冲洗5-6次，在超净工作台上剖开蒴果，均匀播于1/2ms 蔗糖30g/l 琼脂7.0g/l培养基中，90d后形成圆球茎，将形成的圆球茎接种于实施例1-3和对比例1-3培养基中诱导根状茎，试验用110ml柱状瓶(30ml培养基)，每瓶接种3个外植体，每处理接种5瓶，培养45d后统计根状茎增殖数，并计算其增殖系数，其见表1；
84.表1
[0085] 增殖系数实施例111.8实施例212.9实施例313.8对比例12.4对比例27.6对比例35.4
[0086]
从上表中，可以看出由磷酸酯钾盐类主诱导剂和以6-苄氨基嘌呤、氯化胆碱为原料的副诱导剂组成的培养基诱导剂，对墨兰根状茎增殖具有很好的诱导作用，使得增殖系数保持在11.8-13.8，而未添加磷酸酯钾盐类主诱导剂，其增殖系数为5.4，所以可以看出该磷酸酯钾盐类主诱导剂对墨兰的具有很好的促进作用，以及，相对于现有技术中的培养基，也表现出很好的诱导作用。
[0087]
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。