一种利用地顶孢霉滤液生产复合微生物肥料的方法与流程

5g/l，葡萄糖 5g/l，定容至1 l，ph值等于7.0。
8.（2）发酵复合微生物肥料将蜡状芽孢杆菌从种子液按照5%（w/w）接入含50 ml地顶孢霉滤液培养液的100 ml三角瓶进行发酵，温度为30 ℃，150 rpm，发酵时间24~28 h，获得复合微生物肥料。
9.地顶孢霉滤液培养液配方如下：地顶孢霉滤液、添加无机营养元素n 1%、p2o
5 1.5%~4%、k2o 2%~4%，ph值等于6.0。
10.作为优选，所述利用地顶孢霉滤液生产复合微生物肥料的方法中步骤（2）的发酵条件为：蜡状芽孢杆菌从种子液按照5%（w/w）接入地顶孢霉滤液培养液进行发酵，所述地顶孢霉滤液培养液中：地顶孢霉滤液占体积比20%~80%、添加无机营养元素n 1%、p2o
5 1.5%~4%、k2o 2%~4%，温度为30 ℃，150 rpm，发酵时间24~28 h ，获得复合微生物肥料。
11.作为优选，所述利用地顶孢霉滤液生产复合微生物肥料的方法中步骤（2）的发酵条件为：蜡状芽孢杆菌从种子液按照5%（w/w）接入地顶孢霉滤液培养液进行发酵，所述地顶孢霉滤液培养液中：地顶孢霉滤液占体积比80%、添加无机营养元素n 1%、p2o
5 2%、k2o 3%，温度为30 ℃，150 rpm，发酵时间24~28 h ，获得复合微生物肥料。
12.本发明的目的二，是提供一种采用上述方法生产的复合微生物肥料，所述复合微生物肥料中蜡状芽孢杆菌总活菌数≥0.9亿cfu/ml，总养分（n、p2o
5 和k2o总含量）≥6%。
13.本发明提供的利用地顶孢霉滤液生产复合微生物肥料的方法中，使用的主要发酵原料为地顶孢霉滤液。地顶孢霉滤液为地顶孢霉生产过程中产生的滤液，其含有丰富的养分，其中有机质15.3 g/l、p2o
5 0.06%。将地顶孢霉滤液作为为具有益生功能的蜡状芽孢杆菌提供生长所需营养物质的主要原料。通过将蜡状芽孢杆菌从肉汤固体斜面接入液体培养基培养发酵得到蜡状芽孢杆菌种子液，将蜡状芽孢杆菌种子液按照5%（w/w）接入已添加无机营养元素n 1%、p2o
5 2%、k2o 3%（w/w）的含80%（w/w）地顶孢霉滤液培养液中，进行发酵获得一种含有功能菌株有效活菌数不少于0.9
×
108cfu/ml、无机养分不少于6%的复合微生物肥料。使用地顶孢霉滤液发酵生产蜡状芽孢杆菌复合微生物肥料，简化了蜡状芽孢杆菌的发酵工艺，降低了蜡状芽孢杆菌的发酵成本，解决了地顶孢霉滤液资源化利用的难题，提高了地顶孢霉滤液的产值，同时生产出的蜡状芽孢杆菌复合微生物肥料具有应用广泛、生产成本低廉、生态环境友好的特点。
具体实施方式
14.下面结合具体实施实例对本发明进行详细说明。以下实施实例有助于此领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
15.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
16.下述实施例中所使用的其他材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
17.下述实施例中使用的地顶孢霉滤液来源为地顶孢霉生产过程中产生的废弃滤液，其养分成分为：有机质15.3 g/l、p2o
5 0.06%。
18.下述实施例中所使用的菌株均由中国工业微生物菌种保藏管理中心甘肃分中心提供。
19.下述实施例中所添加的所述添加的无机营养元素n由尿素（n含量46.7%）提供，无机营养元素p2o5由磷酸二氢钾（p2o
5 52.17%）提供，k2o由磷酸二氢钾（k2o 34.54%）和硫酸钾
（k2o 54.02%）提供。
20.实施例1将蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌从肉汤固体斜面接入含125 ml肉汤液体培养基的250 ml三角瓶放入30 ℃培养箱，150 rpm，培养16~24 h。然后按照5%（w/w）接种量将蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌接入装液量为50 ml地顶孢霉滤液/100 ml三角瓶，调节ph值为6.0，温度为30 ℃，150 rpm，发酵时间24~28 h。地顶孢霉滤液含量分别为20%、80%，剩余用水补充。测定发酵后的总活菌数量，结果见表1。由表1所知，在含有地顶孢霉滤液培养条件下，与枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌活性的比较，蜡状芽孢杆菌增长率较高，表明蜡状芽孢杆菌能够在含有地顶孢霉滤液条件下更好的生长。在地顶孢霉滤液含量为80%时，总活菌数增长率最高，为59.65%。
21.表1不同地顶孢霉滤液含量对发酵后3株菌活性的影响实施例2本实施例对地顶孢霉滤液的不同含量进行了考察。将蜡状芽孢杆菌从肉汤固体斜面接入含125 ml肉汤液体培养基的250 ml三角瓶放入30 ℃培养箱，150 rpm，培养16~24 h。然后按照5%（w/w）接种量将蜡状芽孢杆菌接入装液量为50 ml地顶孢霉滤液/100 ml三角瓶，调节ph值为6.0，温度为30 ℃，150 rpm，发酵时间24~28 h。地顶孢霉滤液含量分别为20%、40%、60%、80%、100%，剩余用水补充。测定发酵后的总活菌数量，结果见表2。由表2所知，最佳地顶孢霉滤液含量为80%，总活菌数为1.56
×
10
8 cfu/ml。
22.表2不同地顶孢霉滤液含量对发酵后蜡状芽孢杆菌总活菌数的影响处理地顶孢霉滤液体积（ml）补充的水体积（ml）总活菌数（cfu/ml）处理110400.65
×
108处理220300.89
×
108处理330201.16
×
108处理440101.56
×
108处理55000.94
×
108实施例3本实施例针对添加不同n含量对地顶孢霉滤液培养液发酵的影响进行了考察。将蜡状芽孢杆菌种子液按照5%（w/w）接种量将蜡状芽孢杆菌接入装液量为50 ml地顶孢霉滤
液培养液（地顶孢霉滤液含量为80%）/100 ml三角瓶，调节ph值为6.0，温度为30 ℃，150 rpm，发酵时间24~28 h。固定无机营养元素p2o5、k2o添加量，添加无机营养元素n，至n含量分别为0%、1%、2%、3%、4%，测定发酵后的总活菌数量。结果表明，不添加n时，总活菌数为0.79
×
10
8 cfu/ml，添加1% n时，总活菌数为0.53
×
10
8 cfu/ml。然而，添加2%、3%、4% n时，菌株不在生长。因此本发明设定n添加量为1%。
23.实施例4本实施例针对添加p2o5、k2o对地顶孢霉滤液培养液发酵的影响进行了考察。将蜡状芽孢杆菌种子液按照5%（w/w）接种量将蜡状芽孢杆菌接入装液量为50 ml地顶孢霉滤液培养液（地顶孢霉滤液含量为80%）/100 ml三角瓶，调节ph值为6.0，温度为30 ℃，150 rpm，发酵时间24~28 h。固定添加n为1%，添加无机营养元素1.5% p2o5、3.5% k2o，测定发酵后的总活菌数量和ph值，结果见表3。结果表明，无机营养元素添加比例为n 1%、p2o
5 1.5%、k2o 3.5%时，总活菌数为3.30
×
10
4 cfu/ml，ph值为7.70。
24.实施例5本发明针对添加p2o5、k2o对地顶孢霉滤液培养液发酵的影响进行了考察。将蜡状芽孢杆菌种子液按照5%（w/w）接种量将蜡状芽孢杆菌接入装液量为50 ml地顶孢霉滤液培养液（地顶孢霉滤液含量为80%）/100 ml三角瓶，调节ph值为6.0，温度为30 ℃，150 rpm，发酵时间24~28 h。固定添加n为1%，添加无机营养元素3% p2o5、2% k2o，测定发酵后的总活菌数量和ph值，结果见表3。结果表明，无机营养元素添加比例为n 1%、p2o
5 3%、k2o 2%时，总活菌数为0.53
×
10
8 cfu/ml，ph值为7.22。
25.实施例6本实施例针对添加p2o5、k2o对地顶孢霉滤液培养液发酵的影响进行了考察。将蜡状芽孢杆菌种子液按照5%（w/w）接种量将蜡状芽孢杆菌接入装液量为50 ml地顶孢霉滤液培养液（地顶孢霉滤液含量为80%）/100 ml三角瓶，调节ph值为6.0，温度为30 ℃，150 rpm，发酵时间24~28 h。固定添加n为1%，添加无机营养元素4% p2o5、2.64% k2o，测定发酵后的总活菌数量和ph值，结果见表3。结果表明，无机营养元素添加比例为n 1%、p2o
5 4%、k2o 2.64%时，总活菌数为1.58
×
10
6 cfu/ml，ph值为6.67。
26.实施例7本实施例针对添加p2o5、k2o对地顶孢霉滤液培养液发酵的影响进行了考察。将蜡状芽孢杆菌种子液按照5%（w/w）接种量将蜡状芽孢杆菌接入装液量为50 ml地顶孢霉滤液培养液（地顶孢霉滤液含量为80%）/100 ml三角瓶，调节ph值为6.0，温度为30 ℃，150 rpm，发酵时间24~28 h。固定添加n为1%，添加无机营养元素2% p2o5、3% k2o，测定发酵后的总活菌数量和ph值，结果见表3。结果表明，无机营养元素添加比例为n 1%、p2o
5 2%、k2o 3%时，总活菌数为0.95
×
10
8 cfu/ml，ph值为7.78。
27.实施例8本实施例针对添加p2o5、k2o对地顶孢霉滤液培养液发酵的影响进行了考察。将蜡状芽孢杆菌种子液按照5%（w/w）接种量将蜡状芽孢杆菌接入装液量为50 ml地顶孢霉滤液培养液（地顶孢霉滤液含量为80%）/100 ml三角瓶，调节ph值为6.0，温度为30 ℃，150 rpm，发酵时间24~28 h。固定添加n为1%，添加无机营养元素2% p2o5、4% k2o，测定发酵后的总活菌数量和ph值，结果见表3。结果表明，无机营养元素添加比例为n 1%、p2o
5 2%、k2o 4%时，总
活菌数为0.11
×
10
8 cfu/ml，ph值为7.86。
28.表3添加不同p2o5、k2o含量对发酵后蜡状芽孢杆菌总活菌数的影响实施例n（%）p2o5（%）k2o（%）活菌（cfu/ml）ph值实施例411.53.53.30
×
1047.7实施例51320.53
×
1087.22实施例6142.641.58
×
1066.67实施例71230.95
×
1087.78实施例81240.11
×
1087.86