用于胰高血糖素样肽-2抗体检测的包被抗原及纯化方法、重组工程菌及培养方法与流程

protein-ncbi(nih.gov)。
12.胰高血糖素样肽－2(glucagons-like peptide 2，glp-2)是由33个氨基酸组成的单链多肽，分子量约为3900道尔顿。其氨基酸序列为：hadgsfsdem ntildnlaar dfinwliqtkitd。
13.本发明的第二方面，提供一种重组工程菌，所述重组基因工程菌是将包含vegf和glp-2 的质粒转入大肠杆菌获得。
14.本发明的第三方面，提供一种重组基因工程菌的培养方法，包括如下步骤：
15.步骤一、将上述重组工程菌单菌落接入lb培养液中，在35～40℃下培养；
16.步骤二、按照0.5～2％的比例转接入新的lb培养液，在35～40℃下培养3～5h；
17.步骤三、再向lb培养液中加入异丙基硫代半乳糖苷，异丙基硫代半乳糖苷的终浓度为 0.3～0.5mm，继续培养，离心收集菌体
18.其中，所述lb培养液中含有40～60μg/ml的硫酸卡那霉素。
19.于本发明的一实施例中，所述lb培养液中含有50μg/ml的硫酸卡那霉素。
20.于本发明的一实施例中，所述步骤一至步骤三的培养温度为37℃；
21.所述步骤二的接种比例为1％；
22.所述异丙基硫代半乳糖苷的终浓度为0.4mm。
23.本发明的第四方面，提供一种用于胰高血糖素样肽-2抗体检测的包被抗原的纯化方法，包括如下步骤：
24.s1、将上述菌体进行裂解，弃上清；
25.s2、将沉淀洗涤后放入7～9m尿素溶解液中进行溶解，尿素溶解液中二硫苏糖醇的浓度为15～25mm；
26.s3、将s2中的溶液装入透析袋，依次采用5.5～6.5m尿素透析液、3.5～4.5m尿素透析液、 1.5～2.5m尿素透析液、透析缓冲液、柱层析缓冲液中透析；s4、将s3制得的上清液进行柱层析分离，收集含有目的蛋白的洗脱液，再用蒸馏水透析，弃沉淀，上清冻干，即得；
27.其中，3.5～4.5m尿素透析液和1.5～2.5m尿素透析液的ph均为9.4～10.0，透析缓冲液的ph为8.4～8.8，柱层析缓冲液的ph为7.8～8.2；所述1.5～2.5m尿素透析液中含有0.8～1.2mm 还原型谷胱苷肽和0.1～0.3mm的氧化型谷胱苷肽。
28.于本发明的一实施例中，所述二硫苏糖醇的浓度为18～22mm；所述1.5～2.5m尿素透析液中含有0.9～1.1mm还原型谷胱苷肽和0.15～0.25mm的氧化型谷胱苷肽。
29.于本发明的一实施例中，所述二硫苏糖醇的浓度为20mm；所述1.5～2.5m尿素透析液中含有1.0mm还原型谷胱苷肽和0.2mm的氧化型谷胱苷肽。
30.于本发明的一实施例中，所述s3步骤具体为：将s2中的溶液装入透析袋，依次于 5.5～6.5m尿素透析液尿素中透析5～7h，3.5～4.5m尿素透析液中透析5～7h，1.5～2.5m尿素透析液中透析10～14h，透析缓冲液中透析10～14h，柱层析缓冲液中透析10～14h。
31.于本发明的一实施例中，所述s3步骤具体为：将s2中的溶液装入透析袋，依次于6m 尿素透析液尿素中透析6h，4m尿素透析液中透析6h，2m尿素透析液中透析12h，透析缓冲液中透析12h，柱层析缓冲液中透析12h。
32.于本发明的一实施例中，所述4尿素透析液和2m尿素透析液的ph均为9.6，透析缓冲液的ph为8.6，柱层析缓冲液的ph为8.0。
33.如上所述，本发明的用于胰高血糖素样肽-2抗体检测的包被抗原及纯化方法、重组工程菌及培养方法，具有以下有益效果：
34.1、通过vegf-glp-2对抗胰高血糖素相关肽－2的疫苗(ansb-ttp-glp-2)产生的抗体进行检测，弥补了现在胰高血糖素相关肽－2抗体检测领域的空白。
35.2、在菌体诱导表达时采用终浓度为0.4mm左右的iptg为诱导剂，结果表达量显著提高。
36.3、在溶解包涵体时在8m尿素中加入终浓度为20mm左右的dtt来充分的破坏目的蛋白内的二硫键使其溶解，结果表达量显著提高。
37.4、在透析复性的过程中，采取先升高ph到9.6再分两步降低到8.0的做法，并且在包涵体开始复性时采用梯度透析，在透析液中加入还原型谷胱苷肽1mm，氧化型谷胱苷肽 0.2mm，以使变性蛋白处于一个氧化/还原体系中而利于其中的二硫键形成正确的配对，使得 vegf-glp-2的纯化效果更好。
附图说明
38.图1为glp-2的生成示意图。
39.图2为哺乳动物胰高血糖素原的结构示意图。
40.图3为pcr扩增的ttp-glp-2基因的琼脂糖凝胶电泳分析示意图。
41.图4为重组质粒pet-atg2的结构示意图。
42.图5为ansb-ttp-glp-2的基因序列测序报告。
43.图6为pcr扩增的glp-2基因片段的琼脂糖凝胶电泳分析示意图。
44.图7为重组质粒vegf-glp-2的结构示意图。
45.图8为vegf-glp-2的基因序列测序报告。
46.图9为deae阴离子交换色谱法对vegf-glp-2融合蛋白的洗脱曲线。
47.图10为vegf-glp-2融合蛋白的表达和纯化分析示意图。
48.图11为ansb-ttp-glp-2蛋白疫苗的免疫结果柱状图。
49.图12为ansb-ttp-glp-2蛋白疫苗的免疫结果曲线图。
具体实施方式
50.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
51.一、ansb-ttp-glp-2重组基因工程菌的构建
52.1、ttp-glp-2基因片段的设计和获得
53.由于在用作载体的质粒pet28ansb-ttp-p277的ttp和p277之间不存在限制性内切酶位点，只是在ttp的5’端和p277的3’端分别存在bamhⅰ和hindⅲ位点，无法直接将glp-2 片断连接到ttp之后。所以采用加端pcr的方法分三次将ttp序列连接到glp-2序列的5’端。
54.上述破伤风毒素辅助性t细胞表位，其氨基酸序列分别为 cqyikanskfigiteliysyfpsvissgthgdgsf。
55.胰高血糖素样肽－2(glucagons-like peptide 2，glp-2)是由33个氨基酸组成的单链多肽，分子量约为3900道尔顿。其氨基酸序列为：hadgsfsdem ntildnlaar dfinwliqtk
itd。
56.1.1借助于计算机软件设计四条引物，由上海博亚生物技术有限公司合成：上游引物a (seqid no：1所示的核苷酸序列)，b(seqid no：2所示的核苷酸序列)，c(seqid no： 3所示的核苷酸序列)；下游引物(seqid no：4所示的核苷酸序列)，上游引物a中引入了 bamhⅰ位点(ggatcc)，下游引物中引入了hindⅲ位点(aagctt)。
57.1.2三次pcr过程依次使用上游引物c 下游引物、上游引物b 下游引物b、上游引物a 下游引物。
58.pcr反应体系：1μl模板质粒pet28ansb-c-glp-2，上下游引物各5μl(10pmol/μl)， 5μl(10mmol/l)dntps，5μl 10
×
pcr缓冲液(100mm tris
–
hcl ph 8.8,20mm mgcl2,500 mm kcl,1％triton x-100)，1μl pfu dna聚合酶，29μl ddh2o，总体系为50μl。
59.pcr反应条件：94℃10min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，循环数30；72℃10min。
60.每次扩增的产物经pcr产物纯化试剂盒纯化后取1μl用作下一次扩增的模板。第三次扩增产物经2.0％琼脂糖凝胶电泳检测后，用试剂盒纯化得到ttp-glp-2片段并用于酶切。
61.2、质粒ansb-ttp-glp-2(抗胰高血糖素相关肽－2疫苗)的构建
62.2.1将上述扩增纯化后的ttp-glp-2片段用bamhⅰ和hindⅲ进行双酶切。反应体系如下：ttp-glp-2片段25μl，bamhⅰ和hindⅲ限制性内切酶各1μl，限制性内切酶通用buffer 3μl，总体系为30μl，37℃，反应2h得到ttp-glp-2片段。
63.2.2采用碱裂解法对质粒pet28ansb-ttp-p277进行抽提，抽提得到的质粒也用bamhⅰ和hindiii进行双酶切。酶切体系如下：质粒pet28ansb-ttp-p27725μl，bamhⅰ和hindⅲ限制性内切酶各1μl，限制性内切酶通用缓冲液3μl，总体系为30μl，37℃，反应4h。酶切产物经胶回收纯化试剂盒回收pet28ansb-ttp-p277质粒大片段，并经0.8％agroase电泳检测确证。
64.2.3将2.1酶切回收后得到的ttp-glp-2片段和2.2酶切回收后得到的 pet28ansb-ttp-p277质粒大片段进行连接。连接反应体系如下：10
×
t4 dna连接酶缓冲液 1μl，ttp-glp-2dna片段4μl，pet28ansb-ttp-p277质粒大片段4μl，t4 dna连接酶1μl，共10μl，4℃连接过夜。
65.2.4将2.3得到的连接产物转化大肠杆菌escherichia coli bl21(de3)，筛选阳性菌落并采用碱裂解法抽提质粒(2.2步骤)，以任一条上游引物和下游引物进行pcr扩增以进行初步的验证。
66.筛选得到的阳性重组子委托上海博亚生物技术有限公司进行核酸的序列分析，进一步验证ansb-ttp-glp-2融合蛋白基因及其读码框的正确性。
67.二、vegf-glp-2重组基因工程菌的构建
68.1、glp-2基因片段的设计和获得
69.根据glp-2的基因序列，借助于计算机软件设计一条上游引物(seqid no：5所示的核苷酸序列序列)，下游引物(seqid no：4所示的核苷酸序列序列)。上游引物中引入了bamh
ꢀⅰ
位点(ggatcc)，下游引物中引入了hindⅲ位点(aagctt)。
70.pcr反应体系：1μl模板质粒pet28ansb-c-glp-2，上下游引物各5μl(10pmol/μl)，5μl (10mmol/l)dntps，5μl 10
×
pcr缓冲液(100mm tris
–
hcl ph 8.8,20mm mgcl2,500mm
35－40min，于4℃，12000rpm离心20min，弃上清。
90.2.3包涵体的溶解
91.将上一步所得沉淀按1g/30ml放入8m尿素(20mm tris-hcl，ph9.6)中，并加入20mmdtt，于4℃搅拌过夜。
92.2.4包涵体的复性
93.将上一步所得溶液于4℃，12000rpm离心25min，弃沉淀。上清灌入透析袋中，在4℃下，依次于6m尿素透析6h，4m尿素(20mm tris-hcl，ph9.6)中透析6h，2m尿素(20mmtris-hcl，ph9.6，还原型谷胱苷肽1mm，氧化型谷胱苷肽0.2mm)中透析12h，然后于透析缓冲液(20mm tris-hcl，ph8.6)中透析12h，隔6h更换一次缓冲液，于柱层析缓冲液(20mmtris-hcl，ph8.0)中透析12h，隔6h更换一次缓冲液。复性好的蛋白溶液于4℃，12000rpm 离心20min，弃沉淀。
94.2.5融合蛋白的柱层析分离
95.装柱与柱平衡：取适量已经处理的deae-52树脂，悬于1.5倍体积的蒸馏水中，边搅拌边加入固定于铁架台的层析柱中，用离子交换缓冲液(20mm tris-hcl，ph8.0)平衡过夜。
96.上样与洗涤：用4.2.4得到的上清上样，上完样品后用离子交换缓冲液洗涤至基线。
97.梯度洗脱：0～300mm nacl的离子交换缓冲液各250ml，进行梯度洗脱，收集各组分峰，进行15％sds-page检测。
98.2.6脱盐冻干
99.将含有目的蛋白的洗脱液，于4℃对蒸馏水透析(截留分子量14000da)24h，每6h换液一次。透析后的样品于4℃，12000rpm离心20min弃沉淀，上清冻干，取样进行15％sds-page 检测，-20℃保存。
100.四、ansb-ttp-glp-2融合蛋白(抗胰高血糖素相关肽－2疫苗)的免疫学研究
101.1、免疫方案
102.选用5周龄的雄性balb/c小鼠12只，分为两组，一组为生理盐水加佐剂对照组，一组为ansb-ttp-glp-2融合蛋白加佐剂给药组。初次免疫时，对照组每只小鼠皮下注射200μl 的生理盐水和弗氏完全佐剂的混合液(各100μl)，给药组每只小鼠皮下注射200μl的融合蛋白和弗氏完全佐剂的混合液(含100μl佐剂和100μl融合蛋白，融合蛋白的浓度为1μg/μl)。初次免疫后每隔2周进行一次加强免疫，共进行两次加强免疫，在加强免疫中所用佐剂改为弗氏不完全佐剂其他相同。每次免疫后1周，内眦取血一次，血量为0.3-0.5ml，离心，取血清冷冻保存。第四次与第五次取血分别与前一次间隔一周。
103.2、抗体elilsa检测
104.用纯化的包被抗原(vegf-glp-2)4℃过夜包被96孔elisa酶标板，每孔100μl含 50μg包被抗原。包被后，用5％牛血清白蛋白(bsa)溶液在37℃满孔封闭1h。免疫后取血所得抗血清，用5％bsa(于ph7.4的pbs中)稀释20倍，然后每孔加入100μl稀释后的抗血清于37℃作用1h。用pbst(含0.05％tween-20)洗涤6次后加入100μl以1：20000稀释的羊抗小鼠igg二抗(辣根过氧化物酶标记)，每孔100μl，37℃作用1h。pbst洗涤6次，每孔加入100μl显色液，于37℃闭光显色30min后，加入50μl 2mol/l h2so4终止反应，测定a450nm。
105.五、材料来源
106.1、主要试剂
107.表格1
108.[0109][0110]
2、实验动物
[0111]
表格2
[0112]
名称来源balb/c小鼠扬州大学比较医学中心
[0113]
3.、溶液与缓冲液
[0114]
表格3
[0115]
[0116][0117]
六、结果检测
[0118]
1.ansb-ttp-glp-2重组基因工程菌的构建
[0119]
1.1 ttp-glp-2基因片段的设计和获得
[0120]
三次pcr扩增的结果见图3(第一道：dna标记物；第二道：第一次pcr扩增的产物；第三道：第二次pcr扩增的产物；第四道：第三次pcr扩增的产物)。
[0121]
由于ttp共75bp，分三次连接到glp-2的5’端，每次连接25bp，加上glp-2本身的 99bp和引入的酶切位点及保护碱基，故三次扩增的结果理论上应该是134bp，159bp，194bp。通过2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，实际扩增结果与理论结果相符。
[0122]
1.2重组质粒ansb-ttp-glp-2的构建
[0123]
将pet28ansb-ttp-p277质粒用bamhⅰ和hindiii双酶切，回收的大片段通过相同的酶切位点与pcr扩增的ttp-glp-2基因片段连接，筛选获得pet28ansb-ttp-glp-2重组质粒，简称pet-atg2。构建具体过程见图4。
[0124]
以t7终止子为测序引物进行反向序列分析，测序报告见图5，从图5中可以看出基因序列完全正确。
[0125]
2.vegf-glp-2重组基因工程菌的构建
[0126]
2.1 glp-2基因片段的设计和获得
[0127]
pcr扩增得到的产物经2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，实际得到的片段长度与理论长度 119bp相符，结果见图6(第一道：dna标记物；第二道：pcr扩增的产物)。
[0128]
2.2重组质粒vegf-glp-2的构建
[0129]
将pet28a-vegf-aβ42质粒用bamhⅰ和hindiii双酶切，回收的大片段通过相同的酶切位点与pcr扩增的glp-2基因片段连接，筛选获得vegf-glp-2重组质粒，简称pet-vg2。构建具体过程见图7。
[0130]
以t7终止子为测序引物进行反向序列分析，基因序列完全正确，测序报告见图8。
[0131]
3.vegf-glp-2融合蛋白的表达与分离纯化
[0132]
3.1包被抗原vegf-glp-2的制备
[0133]
在包被抗原vegf-glp-2的制备过程中遇到了一些问题：第一，菌体在乳糖的诱导下对 vegf-glp-2的表达量比较低，较低的表达量使得后续的分离纯化很难进行；第二， vegf-glp-2是以包涵体形式表达的，而且vegf-glp-2内能形成二硫键的半胱氨酸(cys) 和甲硫氨酸(met)比较多，所以其形成的包涵体十分紧密。以至于8m尿素 2％巯基乙醇都不能将其完全溶解；第三，虽然vegf-glp-2的理论等电点为5.09，但在透析复性过程中往往全部沉淀出来(复性液的ph为8.0)，sds-page电泳检测上清中无目的蛋白。
[0134]
针对以上问题，我们采用了如下方法加以解决：
[0135]
第一，在菌体诱导表达时采用终浓度为0.4mm的iptg为诱导剂，结果表达量显著提高，见图10；
[0136]
第二，在溶解包涵体时在8m尿素中加入终浓度为20mm的dtt来充分的破坏目的蛋白内的二硫键使其溶解.
[0137]
第三，在透析复性的过程中，采取先升高ph到9.6再分两步降低到8.0的做法，并且在包涵体开始复性时，即透析液中尿素浓度为2m时(变性的蛋白一般在尿素浓度为4m时开始复性，我们的透析液采用的尿素梯度为8m，6m，4m，2m，故当透析液由4m换到2m时透析袋中的变性蛋白开始复性)，在透析液中加入还原型谷胱苷肽1mm，氧化型谷胱苷肽0.2mm，以使变性蛋白处于一个氧化/还原体系中而利于其中的二硫键形成正确的配对。采用了以上方法后，我们得到了较纯的包被抗原，见图10。
[0138]
3.2 vegf-glp-2融合蛋白的纯化过程及结果
[0139]
图9为deae阴离子交换色谱法对vegf-glp-2融合蛋白的洗脱曲线。第一峰为用 tris-hcl缓冲液(20mm，ph8.0)的洗脱峰；第二峰为用nacl(0～300mm)的洗脱峰。
[0140]
图10为atg2蛋白的表达和纯化分析，第一道为蛋白分子量标记物，第二道为诱导前 vegf-glp-2融合蛋白的总细胞蛋白，第三道为诱导后vegf-glp-2融合蛋白的总细胞蛋白，第四道为洗涤前vegf-glp-2包涵体的总细胞蛋白，第五道为洗涤后vegf-glp-2包涵体的总细胞蛋白，第六道为柱层析后vegf-glp-2的总细胞蛋白。说明：我们的分离和纯化方法能很好的纯化出vegf-glp-2融合蛋白。
[0141]
4.有关免疫实验的讨论
[0142]
elisa检测结果显示，融合蛋白加佐剂给药组能诱发小鼠产生抗glp-2抗体。具体见图 11和12。结合图11和12可以看出，给药组小鼠在第三次给药一周后产生了较高水平的抗体，在其后的两周内，抗体水平虽然有所下降但仍维持在一个较高的水平。
[0143]
5.小结
[0144]
本发明通过构建包被抗原(vegf-glp-2)用于检测抗胰高血糖素相关肽－2的疫苗 (ansb-ttp-glp-2)的免疫性能，主要通过改进诱导方法和纯化方法从而制备较纯的包被抗原。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
[0145]
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。