一种具有改善睡眠功效的新型发酵栀子甘草豉汤的制备方法与流程

1.本发明涉及食品发酵技术领域，具体为一种具有改善睡眠功效的新型发酵栀子甘草豉汤的制备方法。


背景技术：

2.抑郁症是一种情绪障碍综合症，其特点是思维迟钝、情绪低落和兴趣减退，具有极大的危害性和复发率。目前临床上常用的抑郁症治疗药物有阿米替林、丙咪嗪等，但是仅依靠西药治疗抑郁症不仅疗程时间长，而且具有口干、视力模糊、窦性心动过速、青光眼加剧、记忆功能障碍等不良反应。现今，随着中医药的研究不断深入，应用中药治疗抑郁症、改善睡眠障碍越来越受到重视。
3.栀子甘草豉汤为经典名方，出自汉代张仲景所著《伤寒论》,为治疗“发汗吐下后,虚烦不得眠”并“少气”之良方,全方由栀子、甘草和淡豆豉3 味药材水煎而成。中药材受提取和加工技术的限制，往往会造成有效物质难以得到充分的吸收利用的现象。并且煎煮后的中药渣往往直接被丢弃，会造成一定的资源浪费。而微生物发酵转化属于中药二次开发的范畴，是中药渣高值化利用的重要途径。相关研究表明，益生菌和中草药在许多方面有相得益彰的协同作用。利用益生菌发酵中药不但可以节约中药资源，而且还可以促进中药有效成分溶出、改善口感、提高药效、降低中药的毒副作用。但在栀子甘草豉汤中，鲜见益生菌发酵对其功效、风味、口感的研究。


技术实现要素：

4.本发明目的在于针对目前存在的现状，为解决上述问题，本发明提供一种具有改善睡眠、抗抑郁功效的发酵栀子甘草豉汤，主要由经根霉发酵的发芽黑豆、甘草、栀子等组成，经复合菌种发酵制备而得，旨在提高栀子甘草豉汤的保健功效，改善栀子甘草豉汤的口感。该发明有助于改善睡眠、缓解抑郁症状。
5.一种具有改善睡眠功效的新型发酵栀子甘草豉汤的制备方法，包括以下步骤：
6.s1、挑选：挑选成熟，颗粒饱满均匀、无虫蚀、无霉烂变质的黑豆、米荞和苦荞；
7.s2、发芽：将黑豆、米荞、黑苦荞用水冲洗干净后加入清水，浸泡12-24h，取出黑豆、米荞、黑苦荞沥干，平铺于泡沫箱中，盖上经润湿后的纱布，避光放置，每隔4-8h后再次润湿纱布，经36-72h培养后可得发芽的黑豆、米荞和黑苦荞，并挑选出新鲜无腐烂的发芽黑豆、发芽米荞和发芽黑苦荞；
8.s3、根霉菌种活化：取中国根霉12保藏菌种1-2环，接入斜面pda固体培养基中，经32℃培养3-5d后，将接种培养好的斜面菌种扩大培养到不含琼脂的pda液体培养基中，32℃震荡培养3-5d，备用；
9.s4、固态发酵：将扩大培养pda液体培养基按0.15：1-0.3：1的质量比接种到发芽黑豆、发芽米荞和发芽黑苦荞中；
10.s5、煎煮：将栀子和甘草于冷水中浸泡30-120min，煎煮15-120min，然后再加入发
酵好的发芽黑豆、发芽米荞、发芽黑苦荞煎煮20-60min，发芽黑豆、发芽米荞、发芽黑苦荞的比例为4：1：1-1：1：1，栀子和甘草的添加比例为3：1-1：1；
11.s6、乳酸芽孢杆菌du-106和植物乳杆菌复合发酵：取煮好的栀子甘草豉汤原液和药材一起进行发酵，将乳酸菌于生理盐水中活化后按1％-5％接种，白砂糖添加量为2％-6％，发酵温度为28℃-36℃，发酵天数为3-7天，发酵结束后得发酵栀子甘草豉汤；
12.s7、浓缩：对发酵栀子甘草豉汤进行浓缩。
13.具体的，步骤s4中，根霉固态发酵质量比按0.20：1接种至发芽黑豆、发芽米荞和发芽黑苦荞中。
14.具体的，步骤s5中，发芽黑豆、发芽米荞、发芽黑苦荞的比例为3：1： 1，栀子和甘草的添加比例为3：1。
15.具体的，步骤s6中，乳酸菌发酵温度为28℃，发酵天数为7天，菌种添加量为2％，白砂糖添加量为2％。
16.本发明的有益效果：
17.1、黑豆在萌发过程中多种营养物质会发生转化富集，形成更易被人体吸收的营养成分，比如发芽后黑豆的溶栓酶酶活力、异黄酮、γ-氨基丁酸等含量显著增加吗，使黑豆的营养价值提高。
18.2、豆豉的传统发酵工艺为自然发酵，受环境条件影响较大，地域性较强，导致豆豉的品质及药理作用无法保证。本发明对发芽黑豆进行根霉发酵制备豆豉，使得豆豉风味、营养成分均有一定的改善。
19.3、该发明以经根霉固态发酵的发芽黑豆、发芽米荞、发芽黑苦荞、甘草和栀子为原料，煎煮后带中药渣一起进行乳酸菌复合发酵。复合菌种发酵的作用效果常常比单一菌种更好，其原因可能是菌种间的协同效果。不同的微生物具有不同的酶系，采用菌种混合发酵，可以使系统的酶系多样化和互补，对于成分复杂的中药生物转化效率更高，菌种混合发酵还可使功效成分及营养成分充分的溶出和利用，提高中药材的综合利用率和生物转化率。经乳酸菌复合发酵的栀子甘草豉汤的抗抑郁效果相比栀子甘草豉汤有所增强。
20.4、对于脾气虚寒的人，服用完栀子豉汤后会更伤阳气，严重者会导致呕吐。而甘草有益气之功效，故该发明以栀子甘草豉汤为基础。并且对栀子甘草豉汤进行乳酸菌发酵处理后，可将有毒成分进行分解或结构修饰，降低中药的毒副作用，起到缓和效果。
21.5、栀子苦寒，豆豉味苦。由《伤寒论》所论述的栀子甘草豉汤煎煮方法，所得的栀子甘草豉汤味苦。乳酸菌发酵能改善口感，发酵后赋予其酸甜口感，使“良药不再苦口”。
附图说明
22.图1为各组大鼠海马体中gaba含量变化柱形图；
23.图2为各组大鼠海马体中bdnf含量变化柱形图；
24.图3为各组大鼠海马体中5-ht含量变化柱形图；
25.图4为各组大鼠海马体中ne含量变化柱形图；
26.图5为各组大鼠血清中ne含量变化柱形图；
27.图6为各组大鼠血清中bdnf含量变化柱形图；
28.图7为各组大鼠血清中cort含量变化柱形图。
具体实施方式
29.下面将结合本发明实施例中的附图表，对本发明的技术方案进行进一步详细的描述，但本发明并不局限于下述实施例。基于本发明中的实施例，在本领域中的普通技术人员没有做出创造性劳动的前提下所取得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
30.实施例1：
31.一种具有改善睡眠功效的新型发酵栀子甘草豉汤的制备方法，包括以下步骤：
32.s1、挑选：挑选成熟，颗粒饱满均匀、无虫蚀、无霉烂变质的黑豆、米荞、黑苦荞；
33.s2、发芽：将黑豆、米荞、黑苦荞用水冲洗干净后加入一定量的清水，浸泡12-24h，取出黑豆、米荞、黑苦荞沥干，平铺于泡沫箱中，盖上经润湿后的纱布，避光放置，每隔4-8h后再次润湿纱布，经36-72h培养后可得发芽的黑豆、米荞和黑苦荞，并挑选出新鲜无腐烂的发芽黑豆、发芽米荞和发芽黑苦荞；
34.s3、根霉菌种活化：取中国根霉12保藏菌种1-2环，接入斜面pda固体培养基中，经32℃培养3-5d后，将接种培养好的斜面菌种扩大培养到不含琼脂的pda液体培养基中，32℃震荡培养3d，备用；
35.s4、固态发酵：将扩大培养pda液体培养基按0.20：1的质量比接种到发芽黑豆、发芽米荞和发芽黑苦荞中；
36.s5、煎煮：将栀子和甘草于冷水中浸泡30-120min，煎煮15-120min，然后再加入发酵好的发芽黑豆、发芽米荞、发芽黑苦荞煎煮20-60min，发芽黑豆、发芽米荞、发芽黑苦荞的比例为3：1：1；栀子和甘草的添加比例为3：1；
37.s6、乳酸芽孢杆菌du-106和植物乳杆菌复合发酵：取煮好的栀子甘草豉汤原液和药材一起进行发酵，将乳酸菌于生理盐水中活化后按2％接种，白砂糖添加量为2％，发酵温度为28℃，发酵天数为7天，发酵结束后得发酵栀子甘草豉汤。
38.实施例2：
39.一种具有改善睡眠功效的新型发酵栀子甘草豉汤的制备方法，包括以下步骤：
40.s1、挑选：挑选成熟，颗粒饱满均匀、无虫蚀、无霉烂变质的黑豆、米荞、黑苦荞；
41.s2、发芽：将黑豆、米荞、黑苦荞用水冲洗干净后加入2-5倍质量的清水，浸泡12-24h，取出黑豆、米荞、黑苦荞沥干，平铺于泡沫箱中，盖上经润湿后的纱布，避光放置，每隔4-8h后再次润湿纱布，经36-72h培养后可得发芽黑豆、米荞、黑苦荞，并挑选出新鲜无腐烂的发芽黑豆、发芽米荞和发芽黑苦荞；
42.s3、根霉菌种活化：取中国根霉12保藏菌种1-2环，接入斜面pda培养基中，经32℃培养3-5d后，将接种培养好的斜面菌种扩大培养到不含琼脂的pda液体培养基中，32℃震荡培养3d，备用；
43.s4、固态发酵：将扩大培养pda液体培养基按0.20：1的质量比接种到发芽黑豆、发芽米荞和发芽黑苦荞中；
44.s5、煎煮：将栀子和甘草于冷水中浸泡30-120min，煎煮15-120min，然后再加入发酵好的发芽黑豆、发芽米荞、发芽黑苦荞煎煮20-60min，发芽黑豆、发芽米荞、发芽黑苦荞的比例为3：1：1；栀子和甘草的添加比例为3：1；
45.s6、乳酸芽孢杆菌du-106和植物乳杆菌复合发酵：取煮好的栀子甘草豉汤原液和药材一起进行发酵，将乳酸菌于生理盐水中活化后按2％接种，白砂糖添加量为2％，发酵温
度为28℃，发酵天数为7天，发酵结束后得发酵栀子甘草豉汤；
46.s7、浓缩：对发酵栀子甘草豉汤进行浓缩。
47.对比案例1：
48.按照栀子甘草豉汤在《伤寒论》中的煎煮方法：先将栀子和甘草加水煎煮1h，再加淡豆豉煎煮1h，过滤，滤液浓缩至100ml。
49.对比案例2：
50.按照栀子豉汤在《伤寒论》中的煎煮方法：先将栀子加水煎煮1h，再加淡豆豉煎煮1h，过滤，滤液浓缩至100ml。
51.实验例1：
52.栀子甘草豉汤的感官评定
53.表1不同对照例和实施例发酵栀子甘草豉汤的感官评价表
54.[0055][0056]
综上，实施例2所述方法发酵栀子豉汤感官评价最佳(95分)，对照例1、实施例1、实施例2被用于进行以下抗抑郁、改善睡眠活性试验。
[0057]
实验例2：
[0058]
新型发酵栀子甘草豉汤抗抑郁活性动物实验
[0059]
1.1实验动物
[0060]
雄性sd大鼠50只，spf级，体重180g-220g，由广东省医学实验动物中心提供，许可证号：scxk(粤)2018-0002。
[0061]
1.2实验方法
[0062]
采用孤养和慢性不可预见性温和应激(cums)构建sd大鼠抑郁模型。正式试验开始前，适应性饲养两周，在此期间对大鼠进行1％的糖水消耗实验训练。两周后，将大鼠随机分为4组：阴性对照组(cd)、慢性束缚应激模型组(cums)、栀子甘草豉汤组(对照例1)、低浓度发酵栀子甘草豉汤组(实施案例1)、高浓度发酵栀子甘草豉汤组(实施案例2)。除cd 组外，其余大鼠均进行慢性束缚应激刺激三周。建模结束后，对各组大鼠进行糖水消耗实验及抑郁行为学测试(迫游泳实验、明暗穿梭实验)。
[0063]
建模成功后，对照组和cums模型组灌胃生理盐水，对照例1、实施案例1、实施案例2组分别灌胃样品，灌胃时间为4周，在灌胃期间模型组和样品组同时也将进行cums刺激。灌胃结束后，对各组大鼠进行糖水消耗实验及抑郁行为学测试。
[0064]
对海马体中bdnf、5-羟色胺(5-ht)、γ-氨基丁酸(gaba)、去甲肾上腺素(ne)的进行测定。称取160mg海马体，放入组织研磨器(匀浆管) 中，加入1600μl生理盐水，制成匀浆，然后置于-20℃过夜。经过反复冻融2次处理破坏细胞膜后，将组织匀浆于2-8℃5000rmp离
心5分钟，收集上清，待测。并且对血清中bdnf、5-羟色胺(5-ht)、皮质酮(cort)的进行测定。
[0065]
1.3实验结果
[0066]
1.3.1糖水偏好
[0067]
建模前，各组大鼠糖水偏好程度无显著差异(p》0.05)。建模后，与 cd组相比，cums模型组、对比案例1、实施案例1、实施案例2的大鼠的糖水偏好程度均显著降低(p《0.05)，说明cums刺激使大鼠糖水消耗程度降低，快感缺失程度明显。给药后，与cums模型组相比，对比案例1、实施案例1、实施案例2组大鼠的糖水偏好程度显著增加(p《0.05)，说明对比案例和实施案例均可改善cums模型大鼠糖水消耗程度降低的现象。
[0068]
表2各组大鼠糖水偏好程度变化(g，n＝10)
[0069][0070][0071]
注：与对照组比较**p《0.01；与cums模型组比较##p《0.01。
[0072]
1.3.2抑郁行为学测试
[0073]
大鼠强迫游泳实验及明暗穿梭实验结果如表3所示。在大鼠强迫游泳实验中，记录大鼠游泳5min内不动的时间。建模后，与cd组相比，cums 组、对比案例1、实施案例1、实施案例2组大鼠游泳不动时间均显著增加 (p《0.05)，说明cums刺激能使大鼠行为绝望程度增加。给药后，与cums 模型组相比，对比案例1、实施案例1、实施案例2组大鼠的游泳不动时间程度显著降低(p《0.05)，并且实施案例2降低的幅度最大，说明例2制备得的发酵栀子甘草豉汤可显著改善cums模型大鼠应激后的绝望程度。而在明暗穿梭实验中，灌胃后样品组和cums模型组大鼠在暗处所处时间无显著差别。大鼠抑郁行为学测试说明，说明实施案例1、2制备得的发酵栀子甘草豉汤在一定程度上可改善大鼠抑郁症状。
[0074]
表3大鼠行为学测试中游泳不动时间及暗处所处时间的变化(min，n＝8)
[0075][0076]
注：与空白对照组比较**p《0.01*p《0.05；与cums模型组比较#p《0.05。
[0077]
1.3.3海马体中bdnf、5-ht、gaba、ne的测定
[0078]
与对照组相比，模型组大鼠海马体中gaba、bdnf、5-ht、ne含量显著降低。而与模型
组相比，对比案例1、实施案例1、实施案例2大鼠海马体中gaba、bdnf、5-ht、ne的含量显著增加，并且实施案例1和实施案例2 中gaba、bdnf、5-ht、ne含量增加的幅度比对比案例1大，说明实施案例均有一定的缓解抑郁的功效。
[0079]
图1注：对照组比较**p《0.01；与cums模型组比较##p《0.01。
[0080]
图2注：与对照组比较**p《0.01；与cums模型组比较##p《0.01。
[0081]
图3注：与对照组比较**p《0.01；与cums模型组比较#p《0.05，##p《0.01。
[0082]
图4注：与对照组比较**p《0.01；与cums模型组比较##p《0.01。
[0083]
1.3.4血清中bdnf、5-ht、cort的测定
[0084]
与对照组相比，模型组大鼠血清中的ne、bdnf的含量显著降低，而cort 的含量显著增加，说明cums应激会导致大鼠抑郁。与cums模型组相比，对比案例1、实施案例1、实施案例2大鼠血清中ne、bdnf含量显著增加， cort含量显著下降，并且实施案例2向好变化的趋势更显著，说明实施案例2能改善由cums引起的大鼠抑郁程度。
[0085]
图5注：与对照组比较**p《0.01；与cums模型组比较##p《0.01。
[0086]
图6注：与对照组比较**p《0.01；与cums模型组比较##p《0.01。
[0087]
图7注：与对照组比较**p《0.01；与cums模型组比较##p《0.01。
[0088]
综上，与对照例相比，实施案例所制备得的发酵栀子甘草豉汤均提高 cums模型抑郁大鼠糖水偏好程度，缓解抑郁大鼠应激后的绝望程度，一定程度上改善其抑郁样行为，具有一定安神除烦作用；还提高了大鼠海马体中gaba、bdnf、5-ht、ne的含量和大鼠血清中ne、bdnf的含量。并且实施案例2改善cums模型抑郁大鼠抑郁样行为的能力最佳，并由感官评价可得，其风味最佳，可有效的改善栀子豉汤原方的苦涩味。
[0089]
实验例3：
[0090]
具有改善睡眠功效的新型发酵栀子甘草豉汤改善睡眠活性动物实验
[0091]
1.1实验动物
[0092]
雄性icr小鼠40只，spf级，体重18-22g，由广东省医学实验动物中心提供，许可证号：scxk(粤)2018-0002。
[0093]
1.2实验方法
[0094]
适应性喂养结束后，将小鼠随机分为4组(n＝10)：阴性对照组(cd)、栀子甘草豉汤组(对照例1)、低浓度发酵栀子甘草豉汤组(实施案例1)、高浓度发酵栀子甘草豉汤组(实施案例2)。对照组灌胃生理盐水，对照例 1、实施案例1、实施案例2组分别灌胃样品。每天灌胃一次，灌胃时间为 4周。
[0095]
1.3实验结果
[0096]
1.3.1直接睡眠和自主活动实验
[0097]
末次给药后25min，将小鼠放入小鼠自主活动仪内适应3min，并记录 5min内小鼠的自主活动次数。结果表明，给药后各剂量组未见睡眠动物，对直接睡眠无影响。对比案例1、实施案例1、实施案例2小鼠自主活动次数减少，与对照组比较有显著性差异(p《0.05)，并且实施案例2的小鼠活动次数最少，说明实施案例2制备的发酵栀子甘草豉汤具有一定的镇静作用。
[0098]
表4各组小鼠自主活动时间变化(min)
[0099][0100]
注：与对照组比较##p《0.01。
[0101]
1.3.2巴比妥钠小鼠睡眠实验
[0102]
小鼠末次给药25min后，各组动物腹腔注射47.5mg/kg戊巴比妥钠，注射体积为10ml/kg，以翻正反射消失为指标，观察记录小鼠睡眠潜伏期和睡眠时长。与对照组相比，对比案例1、实施案例1、实施案例2均能明显延长戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间，具有显著性差异(p《0.01)，并且实施案例2延长小鼠睡眠时间最长，说明实施案例2具有明显的催眠作用。
[0103]
表5各组小鼠睡眠潜伏期合睡眠时长变化(min)
[0104][0105]
注：与空白对照组比较##p《0.01。
[0106]
1.3.3小鼠脑glu、gaba、5-ht含量的测定
[0107]
由表6可得，与对照组相比，对比案例1、实施案例1、实施案例2均能升高小鼠脑内gaba和5-ht含量，但对比案例1没有显著差异性，而实施案例1、实施案例2与对照组相比显著性差异(p《0.01)，并且实施案例 2的效果更好。与对照组相比，对比案例1、实施案例1、实施案例2均能降低小鼠脑内glu含量，并且实施案例2使小鼠脑内glu的含量更低。说明实施案例2可以通过增加脑中主要的抑制性神经递质5-ht和gaba含量，发挥镇静和改善睡眠的作用。
[0108]
表6各组小鼠睡眠潜伏期合睡眠时长变化(min)
[0109][0110]
注：与空白对照组比较##p《0.01。
[0111]
综上可得，实施案例所制备得的具有改善睡眠功效的发酵栀子甘草豉汤均有减少小鼠自主活动时间和延长睡眠时间的作用、提高小鼠脑中主要的抑制性神经递质5-ht和gaba含量，表明实施案例均有镇静作用和辅助睡眠的功效，并且实施案例2改善小鼠睡眠情况的能力最佳。
[0112]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0113]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。