肿瘤相关抗原特异性T细胞应答的制作方法

肿瘤相关抗原特异性t细胞应答
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年7月25日提交的美国临时申请no.62/878,511的权益，其要求于2019年6月7日提交的美国临时申请no.62/858,756的权益，其各自在此通过引用整体并入。
3.关于联邦政府资助的研究和开发的声明
4.本发明是在国家癌症研究所(national cancer institute)授予的授权号r44 ca180177-03的政府支持下完成的。政府对本发明具有一定的权利。
5.电子提交的序列表的引用
6.与本中请一起提交的电子提交的ascii文本文件(名称4153_012pc02_sl_st25；大小：3,591字节；以及创建日期：2020年5月27日)中序列表的内容通过引用整体并入本文。


背景技术：

7.基于巨细胞病毒(cytomegalovirus，cmv)的疫苗以及其他基于疱疹病毒的疫苗即将成为针对感染性疾病和癌症的武器库的有希望的补充。这些基于疱疹病毒的载体不仅在其诱导针对其异源编码的病原体(或癌症)靶抗原的高水平t细胞免疫方面是独特的，而且在免疫的持久性和其“即时效应”品质方面也是独特的。
8.许多肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，taa)是由癌细胞异常表达的自身抗原。针对引发taa特异性t细胞应答的主要挑战是，作为自身抗原，在mhc-i或mhc-ii的情况下强烈识别来源于这些抗原的肽的“典型”t细胞通过负选择从免疫组库(immune repertoire)中除去。因此，有效的癌症疫苗应通过以通过表达低亲和力tcr或通过识别与mhc以低亲和力结合的肽来刺激已逃脱负选择的“非典型”t细胞来破坏免疫耐受。所有当前可用的t细胞诱导疫苗，例如dna、rna、痘载体(poxvector)、腺载体(adenovector)或基于甲病毒的疫苗，均旨在引发典型t细胞。因此，本领域仍然需要能够破坏针对肿瘤相关抗原的免疫耐受的治疗方法。


技术实现要素：

9.本公开内容涉及在对象中产生针对肿瘤相关抗原的免疫应答的方法，所述方法包括将编码肿瘤相关抗原的cmv载体以有效引发针对所述肿瘤相关抗原的cd8 t细胞应答的量施用于所述对象，其中所述cmv载体不表达活性ul128、ul130、ul146和ul147蛋白、或其直系同源物，并且所述肿瘤相关抗原包含以下氨基酸序列：
10.本公开内容还涉及在对象中治疗癌症的方法，所述方法包括将编码肿瘤相关抗原的cmv载体以有效引发针对所述肿瘤相关抗原的cd8 t细胞应答的量施用于所述对象，其中所述cmv载体不表达活性ul128、ul130、ul146和ul147蛋白、或其直系同源物，并且所述肿瘤相关抗原包含以下氨基酸序列：下氨基酸序列：
11.本公开内容还涉及编码肿瘤相关抗原的cmv载体，其用于在对象中产生针对所述肿瘤相关抗原的免疫应答，其中所述cmv载体不表达活性ul128、ul130、ul146和ul147蛋白、或其直系同源物，并且所述肿瘤相关抗原包含以下氨基酸序列：
[0012][0013]
本公开内容还涉及编码肿瘤相关抗原的cmv载体，其用于在对象中治疗癌症，其中所述cmv载体不表达活性ul128、ul130、ul146和ul147蛋白、或其直系同源物，并且所述肿瘤相关抗原包含以下氨基酸序列：
[0014][0015]
本公开内容还涉及编码肿瘤相关抗原的cmv载体在制备用于在对象中产生针对所述肿瘤相关抗原的免疫应答的药物中的用途，其中所述cmv载体不表达活性ul128、ul130、ul146和ul147蛋白、或其直系同源物，并且所述肿瘤相关抗原包含以下氨基酸序列：ul146和ul147蛋白、或其直系同源物，并且所述肿瘤相关抗原包含以下氨基酸序列：ul146和ul147蛋白、或其直系同源物，并且所述肿瘤相关抗原包含以下氨基酸序列：
[0016]
本公开内容还涉及编码肿瘤相关抗原的cmv载体在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述cmv载体不表达活性ul128、ul130、ul146和ul147蛋白、或其直系同源物，并且所述肿瘤相关抗原包含以下氨基酸序列：且所述肿瘤相关抗原包含以下氨基酸序列：
[0017]
本公开内容还涉及在对象中治疗由肿瘤病毒引起的癌症的方法，其包括将编码肿瘤病毒抗原的cmv载体以有效引发针对肿瘤相关抗原的cd8 t细胞应答的量施用于所述对象，其中所述cmv载体不表达活性ul128、ul130、ul146和ul147蛋白、或其直系同源物。
[0018]
本公开内容还涉及在对象中治疗由肿瘤病毒引起的癌症的方法，所述方法包括将编码肿瘤病毒抗原的cmv载体以有效引发针对所述肿瘤病毒抗原的cd8 t细胞应答的量施用于所述对象，其中所述cmv载体不表达活性ul128、ul130、ul146和ul147蛋白、或其直系同源物。
[0019]
本公开内容还涉及编码肿瘤病毒抗原的cmv载体，其用于在对象中治疗癌症，其中所述cmv载体不表达活性ul128、ul130、ul146和ul147蛋白、或其直系同源物。
[0020]
本公开内容还涉及编码肿瘤病毒抗原的cmv载体在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述cmv载体不表达活性ul128、ul130、ul146和ul147蛋白、或其直系同源物。
[0021]
在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含以下氨基酸序列：
[0022][0023][0024]
在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列araaslslgflfllf(seq id no：2)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列kelkfvtlvfrhgdr(seq id no：3)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列qltqlgmeqhyelge(seq id no：4)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列lnesykheqvyirst(seq id no：5)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列nhmkratqmpsykkl(seq id no：6)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列mvllfihirrgpcwq(seq id no：7)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列vpepasqhtlrsgpg(seq id no：8)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列saerlqgrrsrgasg(seq id no：9)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列ideslifykkwelea(seq id no：10)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列pftyeqldvlkhkld(seq id no：11)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列fmklrtdavlpltva(seq id no：12)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列lqgrrsrgasgsepq(seq id no：13)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列hedpmgqqgslgeqq(seq id no：14)。
[0025]
在一些实施方案中，由cmv载体引发的cd8 t细胞中的至少10％是mhc-e或其直系同源物，或者mhc-ii或其直系同源物限制性的。在另一个实施方案中，由cmv载体引发的cd8 t细胞中的至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％或至少75％是mhc-e或其直系同源物限制性的。在另一个实施方案中，由cmv载体引发的cd8 t细胞中少于10％是mhc-1a类或其直系同源物限制性的。在另一个实施方案中，mhc-e限制性的cd8 t细胞中有一些识别在至少90％的其他用载体进行免疫接种的对象中共有的肽。
[0026]
在一些实施方案中，特定的mhc-e超表位(supertope)包含来源于前列腺酸性磷酸酶表位的肽。在另一个实施方案中，mhc-e超表位与对应于seq id no：5的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。在另一个实施方案中，mhc-e超表位与对应于seq id no：6的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。在另一个实施方案中，mhc-e超表位与对应于seq id no：8的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。在另一
个实施方案中，mhc-e超表位与对应于seq id no：9的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。在另一个实施方案中，mhc-e超表位与对应于seq id no：13的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。在另一个实施方案中，mhc-e超表位与对应于seq id no：14的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。
[0027]
在一些实施方案中，mhc-ii限制性的cd8 t细胞中有一些识别在至少90％的其他用载体进行免疫接种的对象中共有的肽。
[0028]
在一些实施方案中，肽包含来源于前列腺酸性磷酸酶表位的肽。在另一个实施方案中，mhc-ii表位与对应于seq id no：2的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。在另一个实施方案中，mhc-ii表位与对应于seq id no：3的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。在另一个实施方案中，mhc-ii表位与对应于seq id no：4的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。在另一个实施方案中，mhc-ii表位与对应于seq id no：7的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。
[0029]
本公开内容还涉及产生识别mhc-e-肿瘤相关抗原肽复合体的cd8 t细胞的方法，所述方法包括：(a)将包含表达肿瘤相关抗原的核酸的重组cmv载体以有效产生识别mhc-e/肽复合体的第一组cd8 t细胞的量施用于第一对象，其中所述cmv载体不表达活性ul128、ul130、ul146和ul147蛋白、或其直系同源物；(b)从所述第一组cd8 t细胞中鉴定第一cd8 tcr，其中所述第一cd8 tcr识别mhc-e/肿瘤相关抗原来源的肽复合体；(c)从第二对象中分离第二组一种或更多种cd8 t细胞；以及(d)用表达载体转染所述第二组一种或更多种cd8 t细胞，其中所述表达载体包含编码第二cd8 tcr的核酸序列和与编码所述第二cd8 tcr的所述核酸序列可操作地连接的启动子，其中所述第二cd8 tcr包含所述第一cd8 tcr的cdr3α和cdr3β，从而产生识别mhc-e/肿瘤相关抗原肽复合体的cd8 t细胞。
[0030]
本公开内容还涉及产生识别mhc-e-肿瘤相关抗原肽复合体的cd8 t细胞的方法，所述方法包括：(a)从第一对象中分离第一组cd8 t细胞，其中所述第一对象已施用了有效产生识别mhc-e/肽复合体的第一组cd8 t细胞的量的包含表达肿瘤相关抗原的核酸的重组cmv载体，其中所述cmv载体不表达活性ul128、ul130、ul146和ul147蛋白、或其直系同源物；(b)从所述第一组cd8 t细胞中鉴定第一cd8 tcr，其中所述第一cd8 tcr识别mhc-e/肿瘤相关抗原来源的肽复合体；(c)从第二对象中分离第二组一种或更多种cd8 t细胞；以及(d)用表达载体转染所述第二组一种或更多种cd8 t细胞，其中所述表达载体包含编码第二cd8 tcr的核酸序列和与编码所述第二cd8 tcr的所述核酸序列可操作地连接的启动子，其中所述第二cd8 tcr包含所述第一cd8 tcr的cdr3α和cdr3β，从而产生识别mhc-e/肿瘤相关抗原肽复合体的cd8 t细胞。
[0031]
在一些实施方案中，重组cmv载体是重组人cmv载体或重组恒河猴cmv载体。
[0032]
在一些实施方案中，肿瘤相关抗原与选自以下的癌症相关：前列腺癌、肾癌、间皮瘤、乳腺癌和宫颈癌。在另一个实施方案中，肿瘤相关抗原选自前列腺酸性磷酸酶、维尔姆
斯瘤抑制蛋白、间皮素和her-2，或其直系同源物。
[0033]
在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含以下氨基酸序列：
[0034][0035][0036]
在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列araaslslgflfllf(seq id no：2)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列kelkfvtlvfrhgdr(seq id no：3)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列qltqlgmeqhyelge(seq id no：4)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列lnesykheqvyirst(seq id no：5)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列nhmkratqmpsykkl(seq id no：6)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列mvllfihirrgpcwq(seq id no：7)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列vpepasqhtlrsgpg(seq id no：8)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列saerlqgrrsrgasg(seq id no：9)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列ideslifykkwelea(seq id no：10)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列pftyeqldvlkhkld(seq id no：11)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列fmklrtdavlpltva(seq id no：12)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列lqgrrsrgasgsepq(seq id no：13)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列hedpmgqqgslgeqq(seq id no：14)。
[0037]
在一些实施方案中，第一cd8 t细胞识别特定的mhc-e超表位。在另一个实施方案中，特定的mhc-e超表位包含来源于前列腺酸性磷酸酶表位的肽。在另一个实施方案中，mhc-e超表位与对应于seq id no：5的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。在另一个实施方案中，mhc-e超表位与对应于seq id no：6的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。在一些实施方案中，特定的mhc-e超表位包含来源于维尔姆斯瘤抑制蛋白表位的肽。在另一个实施方案中，mhc-e超表位与对应于seq id no：8的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。在另一个实施方案中，mhc-e超表位与对应于seq id no：9的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。在另一个实施方案中，mhc-e超表位与对应于seq id no：13的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。在另一个实施方案中，mhc-e超表位与对应于seq id no：14的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。
[0038]
在一些实施方案中，第二cd8 t细胞识别特定的mhc-e超表位。在另一个实施方案
中，特定的mhc-e超表位包含来源于前列腺酸性磷酸酶表位的肽。在另一个实施方案中，mhc-e超表位与对应于seq id no：5的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。在另一个实施方案中，mhc-e超表位与对应于seq id no：6的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。在另一个实施方案中，特定的mhc-e超表位包含来源于维尔姆斯瘤抑制蛋白表位的肽。在另一个实施方案中，mhc-e超表位与对应于seq id no：8的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。在另一个实施方案中，mhc-e超表位与对应于seq id no：9的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。在另一个实施方案中，mhc-e超表位与对应于seq id no：13的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。在另一个实施方案中，mhc-e超表位与对应于seq id no：14的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。
[0039]
在一些实施方案中，第一cd8 tcr通过dna或rna测序来鉴定。
[0040]
在一些实施方案中，编码第二cd8 tcr的核酸序列与编码第一cd8 tcr的核酸序列相同。
[0041]
在一些实施方案中，第一对象是人或非人灵长类。在另一个实施方案中，第一对象是非人灵长类并且第二对象是人，并且其中第二cd8 tcr是包含第一cd8 tcr的非人灵长类cdr3α和cdr3β的嵌合非人灵长类-人cd8 tcr。在另一个实施方案中，第二cd8 tcr包含第一cd8 tcr的非人灵长类cdr1α、cdr2α、cdr3α、cdr1β、cdr2β和cdr3β。在另一个实施方案中，第二cd8 tcr包含第一cd8 tcr的cdr1
α
、cdr2α、cdr3α、cdr1β、cdr2β和cdr3β。在另一个实施方案中，编码第二cd8 tcr的核酸序列与编码第一cd8 tcr的核酸序列相同。
[0042]
在一些实施方案中，第二cd8 tcr是嵌合cd8 tcr。在另一个实施方案中，第二cd8 tcr包含第一cd8 tcr的cdr1α、cdr2α、cdr3α、cdr1β、cdr2β和cdr3β。
[0043]
在一些实施方案中，将cmv载体施用于第一对象包括将cmv载体静脉内、肌内、腹膜内或经口施用于第一对象。在另一个实施方案中，将经转染的cd8 t细胞施用于第二对象以治疗或预防癌症。在另一个实施方案中，癌症是前列腺癌、肾癌、间皮瘤、乳腺癌或宫颈癌。
[0044]
本公开内容还涉及识别mhc-ii-肿瘤肽复合体的cd8 t细胞的方法，所述方法包括：(a)将包含表达肿瘤抗原的核酸的重组cmv载体以有效产生识别mhc-ii/肽复合体的第一组cd8 t细胞的量施用于第一对象，其中所述cmv载体不表达活性ul128、ul130、ul146和ul147蛋白、或其直系同源物；(b)从所述第一组cd8 t细胞中鉴定第一cd8 tcr，其中所述第一cd8 tcr识别mhc-ii/肿瘤抗原来源的肽复合体；(c)从第二对象中分离第二组一种或更多种cd8 t细胞；以及(d)用表达载体转染所述第二组一种或更多种cd8 t细胞，其中所述表达载体包含编码第二cd8 tcr的核酸序列和与编码所述第二cd8 tcr的所述核酸序列可操作地连接的启动子，其中所述第二cd8 tcr包含所述第一cd8 tcr的cdr3α和cdr3β，从而产生识别mhc-ii/肿瘤抗原肽复合体的cd8 t细胞。
[0045]
本公开内容还涉及产生识别mhc-ii-肿瘤抗原肽复合体的cd8 t细胞的方法，所述方法包括：(a)
[0046]
从第一对象中分离第一组cd8 t细胞，其中所述第一对象已施用了有效产生识别mhc-ii/肽复合体的第一组cd8 t细胞的量的包含表达肿瘤抗原的核酸的重组cmv载体，其中所述cmv载体不表达活性ul128、ul130、ul146和ul147蛋白、或其直系同源物；(b)
[0047]
从所述第一组cd8 t细胞中鉴定第一cd8 tcr，其中所述第一cd8 tcr识别mhc-ii/肿瘤抗原来源的肽复合体；(c)
[0048]
从第二对象中分离第二组一种或更多种cd8 t细胞；以及(d)
[0049]
用表达载体转染所述第二组一种或更多种cd8 t细胞，其中所述表达载体包含编码第二cd8 tcr的核酸序列和与编码所述第二cd8 tcr的所述核酸序列可操作地连接的启动子，其中所述第二cd8 tcr包含所述第一cd8 tcr的cdr3α和cdr3β，从而产生识别mhc-ii/肿瘤抗原肽复合体的cd8 t细胞。
[0050]
在一些实施方案中，至少一种重组cmv载体是重组人cmv载体或重组恒河猴cmv载体。
[0051]
在一些实施方案中，至少一种重组cmv载体不表达活性ul128蛋白或其直系同源物，不表达活性ul130蛋白或其直系同源物，不表达活性ul146或其直系同源物，不表达活性ul147或其直系同源物，并且不表达活性us11蛋白或其直系同源物。在另一个实施方案中，编码ul128、ul130、ul146、ul147或us11的核酸序列中的突变选自点突变、移码突变、截短突变和编码病毒蛋白的核酸序列全部缺失。
[0052]
在一些实施方案中，肿瘤相关抗原与前列腺癌、肾癌、间皮瘤、乳腺癌或宫颈癌相关。在另一个实施方案中，肿瘤相关抗原是前列腺酸性磷酸酶、维尔姆斯瘤抑制蛋白、间皮素或her-2，或其直系同源物。
[0053]
在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含以下氨基酸序列：
[0054][0055]
在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列araaslslgflfllf(seq id no：2)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列kelkfvtlvfrhgdr(seq id no：3)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列qltqlgmeqhyelge(seq id no：4)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列lnesykheqvyirst(seq id no：5)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列nhmkratqmpsykkl(seq id no：6)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列mvllfihirrgpcwq(seq id no：7)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列vpepasqhtlrsgpg(seq id no：8)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列saerlqgrrsrgasg(seq id no：9)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列ideslifykkwelea(seq id no：10)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包
含氨基酸序列pftyeqldvlkhkld(seq id no：11)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列fmklrtdavlpltva(seq id no：12)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列lqgrrsrgasgsepq(seq id no：13)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含氨基酸序列hedpmgqqgslgeqq(seq id no：14)。
[0056]
在一些实施方案中，第一cd8 t细胞识别mhc-ii超表位。
[0057]
在一些实施方案中，mhc-ii超表位包含来源于前列腺酸性磷酸酶表位的肽。在另一个实施方案中，mhc-ii超表位与对应于seq id no：2的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。在另一个实施方案中，mhc-ii超表位与对应于seq id no：3的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。在另一个实施方案中，mhc-ii超表位与对应于seq id no：4的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。在另一个实施方案中，mhc-ii超表位与对应于seq id no：7的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。
[0058]
在一些实施方案中，第二cd8 t细胞识别mhc-ii超表位。
[0059]
在一些实施方案中，mhc-ii超表位包含来源于前列腺酸性磷酸酶表位的肽。在另一个实施方案中，mhc-ii超表位与对应于seq id no：2的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。在另一个实施方案中，mhc-ii超表位与对应于seq id no：3的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。在另一个实施方案中，mhc-ii超表位与对应于seq id no：4的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。在另一个实施方案中，mhc-ii超表位与对应于seq id no：7的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。
[0060]
在一些实施方案中，第一cd8 tcr通过dna或rna测序来鉴定。
[0061]
在一些实施方案中，编码第二cd8 tcr的核酸序列与编码第一cd8 tcr的核酸序列相同。
[0062]
在一些实施方案中，第一对象是人或非人灵长类。在另一个实施方案中，第二对象是人或非人灵长类。
[0063]
在一些实施方案中，第一对象是非人灵长类并且第二对象是人，并且其中第二cd8 tcr是包含第一cd8 tcr的非人灵长类cdr3α和cdr3β的嵌合非人灵长类-人cd8 tcr。在另一个实施方案中，第二cd8 tcr包含第一cd8 tcr的非人灵长类cdr1α、cdr2α、cdr3α、cdr1β、cdr2β和cdr3β。在另一个实施方案中，第二cd8 tcr包含第一cd8 tcr的cdr1α、cdr2α、cdr3α、cdrlβ、cdr2β和cdr3β。在另一个实施方案中，编码第二cd8 tcr的核酸序列与编码第一cd8 tcr的核酸序列相同。在另一个实施方案中，第二cd8 tcr是嵌合cd8 tcr。在另一个实施方案中，第二cd8 tcr包含第一cd8 tcr的cdr1α、cdr2α、cdr3α、cdr1β、cdr2β和cdr3β。
[0064]
在一些实施方案中，将cmv载体施用于第一对象包括将cmv载体静脉内、肌内、腹膜内或经口施用于第一对象。在另一个实施方案中，将经转染的cd8 t细胞施用于第二对象以治疗癌症。在另一个实施方案中，癌症是前列腺癌、肾癌、间皮瘤、乳腺癌或宫颈癌。
[0065]
在一些实施方案中，产生cd8 t细胞。在另一个实施方案中，将cd8 t细胞施用于对象以治疗或预防癌症。在另一个实施方案中，将cd8 t细胞施用于对象以诱导针对宿主自身抗原的免疫应答。在一些实施方案中，cd8 t细胞用于制备用于治疗或预防癌症的药物。在一些实施方案中，将cd8 t细胞施用于对象以诱导针对宿主自身抗原的免疫应答。在一些实施方案中，cd8 t细胞用于在对象中诱导针对宿主自身抗原的免疫应答。在一些实施方案中，cd8 t细胞用于制备用于诱导针对宿主自身抗原的免疫应答的药物。
[0066]
本公开内容还涉及长度为约8至约15个氨基酸的分离的mhc-e或mhc-ii超表位肽，其能够被cd8 t细胞受体识别，其中所述超表位包含肿瘤相关抗原。
[0067]
在一些实施方案中，肽是在一些实施方案中，肽是
[0068]
本公开内容还涉及在有此需要的对象中克服针对肿瘤相关抗原的免疫耐受的方法，其包括将有效量的表达所述肿瘤相关抗原的巨细胞病毒(cmv)载体施用于所述对象。
[0069]
在一些实施方案中，cmv载体是人cmv载体或恒河猴cmv载体。
[0070]
在一些实施方案中，cmv载体不表达活性ul128或其直系同源物，不表达活性ul130或其直系同源物，不表达活性ul146或其直系同源物，并且不表达活性ul147或其直系同源物。在另一个实施方案中，由于在编码ul238、ul130、ul146或ul147的核酸序列中存在一个或更多个突变，cmv载体不表达活性ul128、ul130、ul146或ul147、或其直系同源物。在另一个实施方案中，编码ul128、ul130、ul146或ul147的核酸序列中的突变是点突变、移码突变、截短突变和编码病毒蛋白的核酸序列全部缺失中的一种或更多种。
[0071]
在一些实施方案中，cmv载体是恒河猴cmv毒株68-1。
[0072]
在一些实施方案中，cmv载体不表达活性ul82蛋白或其直系同源物。在另一个实施方案中，由于编码ul82的核酸序列中存在一个或更多个突变，cmv载体不表达活性ul82蛋白或其直系同源物。在另一个实施方案中，编码ul82的核酸序列中的突变是点突变、移码突变、截短突变和编码ul82的核酸序列全部缺失中的一种或更多种。
[0073]
在一些实施方案中，肿瘤相关抗原来源于前列腺癌、肾癌、间皮瘤、乳腺癌或宫颈癌。在另一个实施方案中，肿瘤相关抗原是前列腺酸性磷酸酶、维尔姆斯瘤抑制蛋白、间皮素或her-2。
[0074]
在一些实施方案中，有效量包括在对象中有效引发针对肿瘤相关抗原的cd8 t细胞应答的量。
[0075]
在一些实施方案中，cd8 t细胞中的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％是mhc-i或其直系同源物限制性的。
[0076]
在一些实施方案中，从由cmv载体引发的cd8 t细胞中鉴定cd8 tcr，其中所述cd8
tcr识别mhc-i/肿瘤相关抗原来源的肽复合体。在另一个实施方案中，其中cd8 tcr通过dna或rna测序来鉴定。在一些实施方案中，对象是人。
附图说明
[0077]
图1示出了在用表达癌抗原pap的rhcmv毒株68-1(68-1/pap)和表达siv gag抗原的rhcmv毒株68-1(68-1/sivgag)接种的六只恒河猴(rhesus macaques，rm)中引发的平均t细胞应答频率。rm中的三只另外地用表达癌抗原wt1的rhcmv毒株68-1(68-1/wt1)共接种，并且另外三只用表达癌抗原msln的rhcmv毒株68-1(68-1/msln)共接种。cd4 和cd8 t细胞应答是在每个指定的时间点在外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，pbmc)中通过胞内细胞因子染色(intracellular cytokine staining，ics)使用每种抗原的重叠肽库进行测量的。示出了平均应答频率。
[0078]
图2示出了在用表达癌抗原her2的rhcmv毒株68-1(68-1/her2)接种的六只雌性rm中引发的平均t细胞应答频率。cd4 和cd8 t细胞应答是在每个指定的时间点在外周血单个核细胞中通过胞内细胞因子染色使用her2的重叠肽库进行测量的。示出了平均应答频率。
[0079]
图3示出了在用表达hpv16和hpv18的e6和e7蛋白的融合蛋白的rhcmv毒株68-1(68-1/hpv)(实线)或rhcmv毒株68-1.2(68-1.2/hpv)(虚线)接种的八只雌性rm中引发的平均t细胞应答频率。cd4 和cd8 t细胞应答是在每个指定的时间点在pbmc中通过ics使用hpv抗原的重叠肽库进行测量的。示出了个体应答频率。
[0080]
图4示出了来自用68-1/hpv进行免疫接种的rm的cd8 t细胞对hpv抗原的mhc-e依赖性识别。四只雌性rm用表达hpv16和hpv18的e6和e7蛋白的融合蛋白的68-1接种(参见图3)。t细胞应答是通过针对tnfα和ifnγ的ics来测量的。对tnfα和ifnγ二者的产生作出响应的cd8 t细胞显示在右上象限。vmaprtlll(seq id no：1)(vl9)是mhc-e配体肽。
[0081]
图5示出了来自用68-1/pap进行免疫接种的rm的cd8 t细胞对pap的mhc-e依赖性识别。分离cd8 t细胞并将其与表达mhc-e的k562细胞以及表达mhc-e和pap或者mhc-e和hpv融合蛋白的k562细胞共孵育。t细胞应答是通过针对tnfα和ifnγ的ics来测量的。对tnfα和ifnγ二者的产生作出响应的cd8 t细胞显示在右上象限。vmaprtlll(seq id no：1)(vl9)是mhc-e配体肽。
[0082]
图6示出了来自用68-1/pap和68-1/wt1免疫接种的rm的cd8 t细胞对pap和wt1的mhc-e依赖性识别。六只雄性rm用68-1/pap和68-1/wt1共接种。分离cd8 t细胞并将其与表达mhc-e的k562细胞以及表达mhc-e和pap或者mhc-e和wt1的k562细胞共孵育。t细胞应答是通过针对tnfα和ifnγ的ics来测量的。
[0083]
图7示出了pbmc中cd4 和cd8 t细胞应答是在指定时间点通过ics使用tnfα和ifnγ的重叠肽库进行测量的。示出了记忆t细胞中pap特异性t细胞的频率。
[0084]
图8示出了pap特异性cd8 t细胞的mhc限制性分析。针对单独肽的cd8 t细胞应答显示为沿pap序列的正方形。被mhc-i特异性抗体w6/32阻断的肽应答表明mhc-i限制性，被mhc-ii特异性肽clip阻断的肽应答表明mhc-ii限制性，以及被mhc-e特异性肽阻断的肽应答表明mhc-e限制性。还示出了在存在阻断剂的情况下尚未测试的肽。灰色框：限制性待定；白色框：常规mhc-ia限制性；点线框：非常规mhc-e限制性；虚线框：非常规mhc-ii限制性；黑色框：阻断不确定。
[0085]
图9示出了pap、wt1和msln特异性cd8 t细胞的肽作图(peptide mapping)。针对单独肽的cd8 t细胞应答显示为沿序列的正方形。肽在存在阻断剂的情况下尚未进行测试。“超表位
”‑
在所有68-1/pap动物中产生应答的肽被加框：灰色虚线框：mhc-ii或mhc-e超表位，黑色框：mhc-ii超表位(基于来自图8的结果)，黑色虚线框：mhc-e超表位(基于来自图8的结果)。
[0086]
图10示出了wt1特异性cd8 t细胞的mhc限制性分析。针对单独肽的cd8 t细胞应答显示为沿wt1序列的正方形。被mhc-i特异性抗体w6/32阻断的肽应答、被mhc-ii特异性肽clip阻断的肽应答、被mhc-e特异性肽阻断的肽应答、在存在阻断剂的情况下尚未进行测试的肽。以下“超表位”一在所有68-1/wt1免疫接种的动物中产生应答的肽：#3、#13、#14、#58。在三只动物中获得的结果表明所有这些超表位均是mhc-e限制性的。灰色框：限制性待定；黑色框：常规mhc-ia限制性；白色框：非常规mhc-ie限制性；虚线框：非常规mhc-ii限制性；点线框：阻断不确定。
具体实施方式
[0087]
i.术语
[0088]
除非另有说明，否则根据常规用法使用技术术语。
[0089]
本文引用的所有出版物、专利、专利申请、互联网站点和登录号/数据库序列(包括多核苷酸和多肽序列二者)在此出于所有目的通过引用整体并入，其程度如同每个单独的出版物、专利、专利申请、互联网站点或登录号/数据库序列被具体且单独地指示为如此通过引用并入。
[0090]
尽管与本文描述的方法和材料类似或等同的方法和材料可用于本公开内容的实践或测试中，但下文描述了合适的方法和材料。另外，材料、方法和实例仅是举例说明性的而不旨在限制。为了便于查阅本公开内容的多个实施方案，提供了以下特定术语的说明。
[0091]
除非上下文另有要求，否则在本说明书和权利要求书通篇，词语“包含/包括”及其变化形式，例如“包含”和“包括”，将被解释为开放性的包含/包括的意义，即解释为“包含/包括但不限于”。“由
……
组成”应意指排除本文中公开的其他成分和实质性方法步骤的超过痕量的要素。术语“基本上由
……
组成”将权利要求的范围限制为特定的材料或步骤，或者限制为不实质性影响所要求保护的发明的基本特征的材料或步骤。例如，基本上由本文中定义的要素组成的组合物不排除来自分离和纯化方法的痕量污染物，和可药用载体，例如磷酸缓冲盐水、防腐剂等。类似地，当蛋白质包含占蛋白质长度的至多20％并且实质上不影响蛋白质活性(例如，改变蛋白质的活性不多于50％)的另外的氨基酸时，蛋白质基本上由特定氨基酸序列组成。由这些过渡术语中每一个限定的实施方案均在本发明的范围内。
[0092]
约：本文中使用的术语“约”可意指在定义值的1％、5％、10％或20％内。
[0093]
抗原：本文中使用的术语“抗原”或“免疫原”可互换使用以用于指能够在对象中诱导免疫应答的物质，通常是蛋白质。该术语还指具有免疫活性的蛋白质，从这个意义上说，其一旦施用于对象(直接施用或通过向对象施用编码该蛋白质的核苷酸序列或载体)，该蛋白质能够引起针对该蛋白质的体液和/或细胞类型的免疫应答。
[0094]
抗原特异性t细胞：识别特定抗原的cd8

或cd4

淋巴细胞。通常，抗原特异性t细胞与由mhc分子呈递的特定抗原特异性结合，而不是与由同一mhc呈递的其他抗原特异性结
合。
[0095]
施用：本文中使用的术语“施用”意指通过任何有效途径向对象提供或给予药剂，例如包含有效量的包含外源抗原的cmv载体的组合物。一些示例性施用途径包括但不限于注射(例如皮下、肌内、皮内、腹膜内和静脉内)、经口、舌下、直肠、经皮、鼻内、阴道和吸入途径。
[0096]
有效量：本文中使用的术语“有效量”是指药剂的量，例如包含异源抗原的cmv载体或者识别mhc-e/异源抗原来源的肽复合体、mhc-ii/异源抗原来源的肽复合体或mhc-i/异源抗原来源的肽复合体的经转染的cd8 t细胞的量，所述量足以产生所期望的响应，例如降低或消除病症或疾病的体征或症状或者诱导针对抗原的免疫应答。在一些实例中，“有效量”是治疗(包括预防)任何病症或疾病的一种或更多种症状和/或根本原因的量。有效量可以是治疗有效量，包括防止特定疾病或病症的一种或更多种体征或症状，例如与感染性疾病或癌症相关的一种或更多种体征或症状的发生的量。
[0097]
异源抗原：本文中使用的术语“异源抗原”是指非来源于cmv的任何蛋白质或其片段。异源抗原可以是病原体特异性抗原、肿瘤病毒抗原、肿瘤相关抗原、宿主自身抗原或任何其他抗原。
[0098]
过度增殖性疾病：特征在于细胞不受控制的增殖的疾病或病症。过度增殖性疾病包括但不限于恶性和非恶性肿瘤。
[0099]
免疫耐受：本文中使用的“免疫耐受”是指免疫系统对具有诱导免疫应答潜力的物质没有响应的状态。对个体自身抗原(例如肿瘤相关抗原)的自身耐受是通过中枢耐受和外周耐受机制二者来实现的。
[0100]
表位：本文中使用的“表位”包含等位基因特异性基序或其他序列(例如n端重复)，使得包含该基序的肽将结合mhc分子并诱导细胞毒性t淋巴细胞(cytotoxic t lymphocyte，“ctl”)应答，或针对从中获得表位的抗原的b细胞应答(例如抗体产生)。
[0101]
在一些实施方案中，表位是使用序列基序或其他方法，例如本领域已知的神经网络或多项式确定来鉴定的。通常，算法用于确定肽的“结合阈值”以选择具有使其在一定的亲和力下有高的结合概率并将具有免疫原性的评分的肽。所述算法基于特定位置处的特定氨基酸对mhc结合的影响、特定位置处的特定氨基酸对抗体结合的影响、或包含基序的肽中特定替换对结合的影响。在表位的情况下，“保守残基”是以显著高于肽中特定位置处随机分布所预期的频率出现的残基。在一些实施方案中，保守残基是其中mhc结构可提供与表位的接触点的残基。
[0102]
突变：本文中使用的术语“突变”是指核酸或多肽序列与正常序列、共有序列或“野生型”序列的任何差异。突变体是包含突变的任何蛋白质或核酸序列。另外，具有突变的细胞或生物体也可称为突变体。一些类型的编码序列突变包括点突变(在单个核苷酸或氨基酸上的差异)、沉默突变(在不导致氨基酸变化的核苷酸上的差异)、缺失(其中缺失一个或更多个核苷酸或氨基酸，直至并包括缺失基因的整个编码序列的差异)、移码突变(其中不能被3整除的数目的核苷酸的缺失导致氨基酸序列改变的差异)。导致氨基酸差异的突变也可称为氨基酸替换突变。氨基酸替换突变可通过氨基酸序列中特定位置处相对于野生型的氨基酸变化来描述。
[0103]
核苷酸序列或核酸序列：术语“核苷酸序列”和“核酸序列”是指脱氧核糖核酸
(deoxyribonucleic acid，dna)或核糖核酸(ribonucleic acid，rna)序列，其包括但不限于信使rna(messenger rna，mrna)、dna/rna杂合体或合成核酸。核酸可以是单链的、或者部分或完全双链的(双链体)。双链体核酸可以是同源双链体或异源双链体。
[0104]
可操作地连接：本文中使用的术语“可操作地连接”，当第一核酸序列以对第二核酸序列有影响这样的方式放置时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。可操作地连接的dna序列可以是连续的，或者其可远距离操作。
[0105]
启动子：本文中使用的术语“启动子”可指指导核酸转录的许多核酸控制序列中的任一个。通常，真核启动子包含转录起始位点附近的必需核酸序列，例如在聚合酶ii型启动子的情况下tata元件或者被一种或更多种转录因子识别的任何其他特定dna序列。启动子的表达还可通过增强子或阻遏子元件来调节。启动子的许多实例是可获得的并且是本领域普通技术人员公知的。包含与编码特定多肽的核酸序列可操作地连接的启动子的核酸可称为表达载体。
[0106]
重组：本文中使用的关于核酸或多肽的术语“重组”是指具有非天然存在的序列或者具有通过人工组合两种或更多种以其他方式分离的序列区段来制备的序列的核酸或多肽，例如包含异源抗原的cmv载体。这种人工组合通常通过化学合成，或者更常见地通过人工操作分离的核酸区段来实现，例如通过遗传改造技术来实现。重组多肽还可指使用重组核酸制备的多肽，所述重组核酸包括转移至不是多肽天然来源的宿主生物体的重组核酸(例如，编码形成包含异源抗原的cmv载体的多肽的核酸)。
[0107]
可操作地连接：本文中使用的术语“可操作地连接”意指当编码序列与核酸控制序列或启动子以将所述编码序列的表达或转录和/或翻译置于所述核酸控制序列的影响或控制之下这样的方式共价连接时，所述编码序列与所述核酸控制序列或启动子被称为“可操作地连接”。“核酸控制序列”可以是任何核酸元件，例如但不限于启动子、增强子、ires、内含子和本文所述的指导与其可操作地连接的核酸序列或编码序列的表达的其他元件。对于待表达的公开的肿瘤相关抗原，肿瘤相关抗原的蛋白质编码序列应与指导蛋白质转录和翻译的调节序列或核酸控制序列“可操作地连接”。
[0108]
可药用载体：如本文中所使用的，“可药用载体”的使用是常规的。remington
′
s pharmaceutical sciences，e.w.martin，mack publishing co.，easton，pa，第19版，1995描述了适合于本文中公开的组合物的药物递送的组合物和制剂。一般而言，载体的性质将取决于所采用的特定施用方式。例如，肠胃外制剂通常包含可注射流体，其包括药学上和生理学上可接受的流体例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等作为载剂。对于固体组合物(例如散剂、丸剂、片剂或胶囊剂形式)，常规的无毒固体载体可包括例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物中性载体之外，待施用的药物组合物可包含少量无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和ph缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨醇单月桂酸酯。
[0109]
多核苷酸：本文中使用的术语“多核苷酸”是指核糖核酸(rna)或脱氧核糖核酸(dna)的聚合物。多核苷酸由以下四个碱基组成：腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶/尿嘧啶(尿嘧啶用于rna)。来自核酸的编码序列指示由该核酸编码的蛋白质的序列。
[0110]
多肽：术语“蛋白质”、“肽”、“多肽”和“氨基酸序列”在本文中可互换使用以用于指任何长度的氨基酸残基的聚合物。聚合物可以是直链或支链的，其可包含经修饰的氨基酸
或氨基酸类似物，并且其可被除了氨基酸之外的化学部分中断。该术语还涵盖了经天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，例如与标记或生物活性组分缀合。
[0111]
蛋白质的直系同源物的典型特征在于具有大于75％的序列同一性，其是使用设置为缺省参数的align在与特定蛋白质的氨基酸序列的全长比对中计数的。当通过这种方法评估时，与参考序列具有更大相似性的蛋白质将显示提高的百分比同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％或至少98％的序列同一性。另外，可在公开的肽的特定结构域的全长上比较序列同一性。
[0112]
启动子：本文中使用的术语“启动子”是指这样的一组转录控制模块，其聚集在rna聚合酶ii的起始位点周围，并且当与本公开内容的蛋白质编码序列可操作地连接时实现编码蛋白质的表达。本公开内容的转基因表达可在组成型启动子或诱导型启动子的控制下，诱导型启动子仅在暴露于一些特定的外部刺激(例如但不限于抗生素(例如四环素)、激素(例如蜕皮素)或重金属)时启动转录。启动子也可对特定的细胞类型、组织或器官具有特异性。许多合适的启动子和增强子是本领域已知的，并且任何这样的合适的启动子或增强子均可用于本公开内容的转基因的表达。例如，合适的启动子和/或增强子可选自真核启动子数据库(eukaryotic promoter database，epdb)。
[0113]
序列同一性/相似性：本文中使用的两个或更多个核酸序列或者两个或更多个氨基酸序列之间的同一性/相似性以序列之间的同一性或相似性表示。序列同一性可根据百分比同一性来测量；百分比越高，序列越相同。序列相似性可根据百分比同一性或相似性(考虑到保守氨基酸替换)来测量；百分比越高，序列越相似。具有显著量的序列同一性并且还彼此功能相同或相似的多肽或其蛋白质结构域(例如，在不同物种中发挥相同功能的蛋白质或者不改变蛋白质的功能或其大小的蛋白质的突变体形式)可称为“同源物”。
[0114]
序列同一性或同源性通过在比对以使得重叠和同一性最大化而序列空位最小化时比较序列来确定。特别地，可使用多种数学算法中的任何一种来确定序列同一性。用于比较两个序列的数学算法的一个非限制性实例是以下的算法：karlin&altschul，proc.natl.acad.sci.usa 1990；87：2264-2268，其修改为karlin&altschul，proc.natl.acad.sci.usa 1993；90：5873-5877。
[0115]
用于比较的序列比对方法是本领域公知的。多种程序和比对算法描述于：smith&waterman，adv appl math 2，482(1981)；needleman&wunsch，j mol biol 48，443(1970)；pearson&lipman，proc natl acad sci usa 85，2444(1988)；higgins&sharp，gene 73，237-244(1988)；higgins&sharp，cabios 5，151-153(1989)；corpet et al，nuc acids res 16，10881-10890(1988)；huang et al，computerapp biosci 8，155-165(1992)；以及pearson et al，meth mol bio 24,307-331(1994)。另外，altschul et al，j mol biol 215，403-410(1990)提出了对序列比对方法和同源性计算的详细考虑。
[0116]
ncbi基本局部比对检索工具(basic local alignment search tool，blast)(altschul et al，(1990)同上)可从数种来源获得，包括国家生物技术信息中心(national center for biological information，ncbi，国家医学图书馆(national library of medicine)，38a楼，8n805室，bethesda，md 20894)和互联网上，用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。另外的信息可在ncbi网站上找到。
[0117]
blastn用于比较核酸序列，而blastp用于比较氨基酸序列。如果两个比较的序列共有同源性，则指定的输出文件将那些同源性区域显示为比对序列。如果两个比较的序列不共有同源性，则指定的输出文件将不显示比对序列。
[0118]
一旦进行比对，匹配的数目是通过计算两个序列中存在相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数目来确定的。百分比序列同一性是通过以下确定的：将匹配的数目除以所鉴定序列中示出的序列的长度或除以铰接长度(例如来自所鉴定序列中示出的序列的100个连续核苷酸或氨基酸残基)，随后将结果值乘以100。例如，当与具有1154个核苷酸的测试序列比对时，具有1166个匹配的核酸序列与该测试序列具有75.0百分比同一性(1166
÷
1554*100＝75.0)。百分比序列同一性值四舍五入至最近的十分之一。例如，75.11、75.12、75.13和75.14向下舍去至75.1，而75.15、75.16、75.17、75.18和75.19向上舍入至75.2。长度值将始终是整数。在另一个实例中，包含与来自所鉴定序列的20个连续核苷酸比对的20个核苷酸区域的靶序列包含与该所鉴定序列共有75百分比序列同一性(即，15
÷
20*100＝75)的区域。
[0119]
对于大于约30个氨基酸的氨基酸序列的比较，采用blast 2序列函数，其使用设置为缺省参数的缺省blosum62矩阵(空位存在成本为11，并且每个残基空位成本为1)。同源物的典型特征在于具有至少70％的序列同一性，其是使用ncbi basic blast 2.0、具有数据库(例如nr数据库、swissprot数据库和专利序列数据库)的gapped blastp在与氨基酸序列的全长比对中计算的。使用blastn程序检索的查询用dust进行过滤(hancock&armstrong，comput appl biosci 10，67-70(1994.)，其他程序使用seg。另外，可进行手动比对。当通过这种方法评估时，具有甚至更大相似性的蛋白质将显示出与蛋白质具有提高的百分比同一性，例如至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性。
[0120]
当比对短肽(少于约30个氨基酸)时，使用采用设置为缺省参数(开放空位9，延伸空位1罚分)的pam30矩阵的blast 2序列函数进行比对。当通过这种方法评估时，与参考序列具有甚至更大相似性的蛋白质将显示出与蛋白质具有提高的百分比同一性，例如至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性。当比较少于整个序列的序列同一性时，同源物通常在10至20个氨基酸的短窗口内具有至少75％的序列同一性，并且可具有至少85％、90％、95％或98％的序列同一性，这取决于其与参考序列的同一性。在ncbi网站上描述了用于在这样的短窗口内确定序列同一性的方法。
[0121]
两个核酸分子密切相关的一个指示是两个分子在严格条件下彼此杂交，如上所述。然而，由于遗传密码的简并性，不显示高度同一性的核酸序列可编码相同或相似(保守)的氨基酸序列。可使用这种简并性来改变核酸序列以产生全部编码基本相同蛋白质的多个核酸分子。例如，这样的同源核酸序列可与编码蛋白质的核酸具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的序列同一性。
[0122]
对象：本文中使用的术语“对象”是指活的多细胞脊椎动物生物体，其是包括人和非人哺乳动物二者的类别。术语“对象”包括所有动物，包括非人灵长类和人，而“动物”包括除了人之外的所有脊椎动物物种；并且“脊椎动物”包括所有脊椎动物，包括动物(如本文中使用的“动物”)和人。并且，当然，“动物”的一个子集是“哺乳动物”，出于本说明书的目的其包括除了人之外的所有哺乳动物。
[0123]
超表位：本文中使用的术语“超表位”或“超表位肽”是指不管mhc单倍型如何，即在
存在或不存在给定的mhc-i、mhc-ii或mhc-e等位基因的情况下，在大于约90％的人群体中被t细胞识别的表位或肽。
[0124]
肿瘤相关抗原：本文中使用的术语“肿瘤相关抗原”是指由癌细胞异常表达的自身抗原。taa包括：(i)在癌细胞中表达的种系/睾丸抗原，(ii)在成体组织中不表达的细胞谱系分化抗原，或(iii)在癌细胞中过表达的抗原。肿瘤相关抗原相对受限于肿瘤细胞，并且可以是诱导免疫应答的任何蛋白质。然而，许多肿瘤相关抗原是宿主(自身)蛋白质，并且因此通常不被宿主免疫系统视为抗原。肿瘤相关抗原也可由癌细胞异常表达。肿瘤相关抗原也可以是在癌细胞中表达的种系/睾丸抗原、在成体组织中不表达的细胞谱系分化抗原或在癌细胞中过表达的抗原。
[0125]
肿瘤病毒：本文中使用的术语“肿瘤病毒”、“癌病毒”或“肿瘤病毒”是指在一些情况下诱导癌症发生(例如，在慢性感染之后、在具有受损免疫系统的个体中等)的病毒。
[0126]
治疗：本文中使用的术语“治疗”是指改善疾病或病理状况的体征或症状的干预。本文中使用的关于疾病、病理状况或症状的术语“治疗”及其变化形式也指治疗的任何可观察到的有益作用。有益作用可例如通过以下来证实：易感对象中疾病的临床症状的发作延迟、疾病的一些或所有临床症状的严重程度降低、疾病的进展较慢、疾病复发次数降低、对象的整体健康或健康状况(well-being)的改善，或者本领域公知的特定于特定疾病的其他参数。预防性治疗是出于降低发生病理状况的风险的目的，向未表现出疾病体征或仅表现出早期体征的对象施用的治疗。治疗性治疗是在疾病的体征和症状已发生之后向对象施用的治疗。
[0127]
疫苗：免疫原性组合物，其可施用于哺乳动物(例如人)以赋予针对疾病或其他病理状况的免疫，例如主动免疫。疫苗可用于预防或治疗。因此，疫苗可用于降低发生疾病(例如肿瘤或病理性感染)的可能性，或者用于降低疾病或病症的症状的严重程度、限制疾病或病症(例如肿瘤或病理性感染)的进展，或者限制疾病或病症(例如肿瘤)的复发。在一些具体实施方案中，疫苗是表达异源抗原的复制缺陷型cmv，所述异源抗原例如来源于肺、前列腺、卵巢、乳房、结肠、子宫颈、肝、肾、骨的肿瘤或者黑素瘤的肿瘤相关抗原。
[0128]
载体：可将特定序列的核酸分子并入到载体中，随后将载体引入到宿主细胞中，从而产生经转化的宿主细胞。载体可包含允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可包含一种或更多种选择标记基因和本领域已知的包括指导核酸表达的启动子元件的其他遗传元件。载体可以是病毒载体，例如cmv载体。病毒载体可由野生型或包括复制缺陷型病毒的减毒病毒构建。
[0129]
根据本公开内容，可使用本公开内容的允许病毒表达的任何载体。在某些实施方案中，所公开的病毒可在体外使用(例如使用无细胞表达系统)和/或在体外生长的培养的细胞中使用，以产生编码的异源抗原(例如，肿瘤病毒抗原、hiv抗原、肿瘤相关抗原和抗体)，其然后可用于多种应用，例如产生蛋白质疫苗。对于这样的应用，可使用允许病毒在体外和/或培养的细胞中表达的任何载体。根据本公开内容使用的载体可包含合适的基因调控区，例如启动子或增强子，使得本公开内容的抗原可表达。
[0130]
ii.用于治疗和预防癌症的方法
[0131]
本文中公开了用于治疗或预防癌症的方法。该方法涉及向对象施用有效量的至少一种包含至少一种肿瘤相关抗原或肿瘤病毒抗原的重组cmv载体。在一些实施方案中，该方
法还包括施用包含mhc-e限制性t细胞受体的t细胞。
[0132]
动物实验已表明cmv疫苗在其以下方面是独特的：a)诱导和维持高频率的淋巴外t细胞应答(所谓的效应记忆t细胞)；b)超感染cmv阳性宿主；以及c)即使当宿主间传播中出现缺陷时仍维持免疫原性。此外，动物模型中的实验显示，来源于动物cmv的疫苗载体诱导针对感染性疾病和癌症的保护性免疫应答(us 20080199493、us 20100142823、us 20130136768和us 20140141038)。特别引人注目的是，发现恒河猴cmv(rhcmv)载体的猿猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，siv)疫苗不仅能够预防非人灵长类中的aids，而且最终治愈了这些动物的siv(hansen s g et al.，nature 502，100-104(2013))。
[0133]
针对引发肿瘤相关抗原(taa)特异性t细胞的主要挑战是，作为自身抗原，在mhc-i或mhc-ii的情况下强烈识别来源于这些抗原的肽的“典型”t细胞已通过负选择从免疫组库中除去。因此，癌症疫苗必须通过以通过表达低亲和力tcr或通过识别与mhc以低亲和力结合的肽来刺激已逃脱负选择的“非典型”t细胞来破坏免疫耐受。所有当前可用的t细胞诱导疫苗，例如dna、rna、痘载体、腺载体或基于甲病毒的疫苗，均旨在引发典型t细胞。因此，这些载体难以破坏免疫耐受。此外，抗载体免疫防止重复使用同一载体以加强免疫，导致复杂的异源初免/加强疫苗方案，或者其需要与耐受破坏检查点抑制剂组合。例如，prostvac是针对表达psa(前列腺特异性抗原)的前列腺癌的基于痘病毒的疫苗。免疫接种方案需要用由痘苗病毒表达的psa进行一次免疫接种，随后用编码psa的禽痘病毒进行六次加强免疫接种。尽管做出了努力，prostvac仅能够引发占总cd8 t细胞约0.03％的cd8 t细胞。因此，iii期临床试验因无效而停止。
[0134]
在一些实施方案中，该方法提供与肿瘤相关抗原相关的癌症的治疗。在一些实施方案中，治疗起因于破坏对象中的耐受性使得针对taa的免疫应答升高。
[0135]
在一些实施方案中，癌症是由病原体引起的。在一些实施方案中，病原体是肿瘤病毒并且抗原是来源于肿瘤病毒的蛋白质。肿瘤病毒包括但不限于人t淋巴细胞病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒(human papillomavirus，hpv)、人多瘤病毒、卡波西肉瘤相关疱疹病毒(kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus)、梅克尔细胞多瘤病毒和eb病毒(epstein-barr virus)。在一些实施方案中，肿瘤病毒抗原是来自hpv毒株16的e6和e7或者来自hpv毒株18的e6和e7。在一些实施方案中，肿瘤病毒抗原是来自hpv的e6和e7的融合物。肿瘤病毒抗原可以是来源于肿瘤病毒任何部分的蛋白质。例如，在一些实施方案中，肿瘤病毒抗原可来源于核心、包膜、表面或聚合酶蛋白。
[0136]
肿瘤相关抗原包括但不限于以下：前列腺酸性磷酸酶(pap)；维尔姆斯瘤抑制蛋白(wt1)；间皮素(msln)；her-2(her2)；毒株hpv16的人乳头瘤病毒抗原e6；毒株hpv16的人乳头瘤病毒抗原e7；毒株hpv18的人乳头瘤病毒抗原e6；毒株hpv18的人乳头瘤病毒抗原e7；来自hpv16和hpv18的人乳头瘤病毒e6和e7的融合蛋白；黏蛋白1(muc1)；lmp2；表皮生长因子受体(egfr)；p53；纽约食道1(new york esophagus 1，ny-eso-1)；前列腺特异性膜抗原(psma)；gd2、癌胚抗原(cea)；黑素瘤抗原a/t细胞所识别的黑素瘤抗原1(melanoma antigen a/melanoma antigen recognized by t cells 1，melana/mart1)；ras；gp100、蛋白酶3(pr1)、bcr-abl；存活蛋白；前列腺特异性抗原(psa)；人端粒酶逆转录酶(htert)；epha2；ml-iap；甲胎蛋白(afp)；epcam；erg；na17；pax3；alk；雄激素受体(ar)；细胞周期蛋白b1；mycn；rhoc；酪氨酸相关蛋白2(trp-2)；gd3；岩藻糖基gm1；psca；sle(a)；cyp1b1；
plca1；gm3；boris；tn；globoh；ets变体基因6/急性髓性白血病1基因ets(etv6-aml)；ny-br-1；rgs5；鳞状抗原排斥肿瘤或3(sart3)；stn；碳酸酐酶ix；pax5；oy-tes1；精子蛋白17；lck；hmwmaa；akap-4；ssx2；b7h3；豆荚蛋白；tie 2；page4；vegfr2；mad-ct-1；fap；pdgfr；mad-ct-2；fos相关抗原1；tag-72；9d7；epha3；端粒酶；sap-1；bage家族；cage家族；gage家族；mage家族；sage家族；xage家族；黑素瘤优先表达抗原(preferentially expressed antigen ofmelanoma，prame)；黑皮质素1受体(mc1r)；β-联蛋白；brca1/2；cdk4；慢性髓细胞性白血病66(chronic myelogenous leukemia 66，cml66)和tgf-β。在某些实施方案中，宿主自身抗原包括前列腺酸性磷酸酶、维尔姆斯瘤抑制蛋白、间皮素或her-2。
[0137]
在一些实施方案中，该方法涉及癌症的预防或治疗。癌症包括但不限于：急性淋巴母细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia)；急性髓性白血病(acute myeloid leukemia)；肾上腺皮质癌；aids相关癌症；aids相关淋巴瘤；肛门癌；阑尾癌；星形细胞瘤，儿童小脑或脑；基底细胞癌；胆管癌，肝外；膀胱癌；骨癌，骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤；脑干胶质瘤；脑肿瘤；脑肿瘤，小脑星形细胞瘤；脑肿瘤，脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤；脑肿瘤，室管膜瘤；脑肿瘤，髓母细胞瘤；脑肿瘤，幕上原始神经外胚叶肿瘤(supratentorial primitive neuroectodermal tumor)；脑肿瘤，视觉通路和下丘脑胶质瘤；乳腺癌；支气管腺瘤/类癌；伯基特淋巴瘤(burkitt lymphoma)；类癌瘤，儿童；类癌瘤，胃肠道；不明原发癌(carcinoma of unknown primary)；中枢神经系统淋巴瘤，原发性；小脑星形细胞瘤，儿童；脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤，儿童；宫颈癌；儿童癌症；慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia)；慢性髓细胞性白血病；慢性骨髓增殖性疾病；结肠癌；皮肤t细胞淋巴瘤；结缔组织增生性小圆细胞肿瘤；子宫内膜癌；室管膜瘤；食管癌；尤因家族肿瘤中的尤因肉瘤(ewing
′
ssarcoma in the ewing family oftumor)；颅外生殖细胞瘤，儿童；性腺外生殖细胞瘤；肝外胆管癌；眼癌，眼内黑素瘤；眼癌，视网膜母细胞瘤；胆囊癌；胃(胃部)癌；胃肠道类癌瘤；胃肠道间质瘤(gist)；生殖细胞瘤：颅外、性腺外或卵巢；妊娠滋养细胞肿瘤；脑干胶质瘤；胶质瘤，儿童脑星形细胞瘤；胶质瘤，儿童视觉通路和下丘脑；胃类癌；毛细胞白血病；头颈癌；心脏癌；肝细胞(肝)癌；霍奇金淋巴瘤(hodgkin lymphoma)；下咽癌；下丘脑和视觉通路胶质瘤，儿童；眼内黑素瘤；胰岛细胞癌(内分泌胰腺)；卡波西肉瘤(kaposi sarcoma)；肾癌(肾细胞癌)；喉癌；白血病；白血病，急性淋巴母细胞(也称为急性淋巴细胞白血病)；白血病，急性髓性(也称为急性髓细胞性白血病)；白血病，慢性淋巴细胞性(也称为慢性淋巴细胞性白血病)；白血病，慢性髓细胞性(也称为慢性髓性白血病)；白血病，毛细胞；唇癌与口腔癌；肝癌(原发性)；肺癌，非小细胞；肺癌，小细胞；淋巴瘤；淋巴瘤，aids相关；淋巴瘤，伯基特；淋巴瘤，皮肤t细胞；淋巴瘤，霍奇金；淋巴瘤，非霍奇金(除霍奇金之外的所有淋巴瘤的旧分类)；淋巴瘤，原发性中枢神经系统；marcus whittle，致命疾病；巨球蛋白血症，瓦氏(waldenstrim)；骨/骨肉瘤的恶性纤维组织细胞瘤；髓母细胞瘤，儿童；黑素瘤；黑素瘤，眼内(眼)；梅克尔细胞癌(merkel cell carcinoma)；间皮瘤，成人恶性；间皮瘤，儿童；具有隐匿性、原发性的转移性鳞状颈癌；口癌；多发性内分泌瘤综合征，儿童；多发性骨髓瘤/浆细胞赘生物；蕈样肉芽肿病；骨髓增生异常综合征；骨髓增生异常/骨髓增殖性疾病；髓细胞性白血病，慢性；髓性白血病，成人急性；髓性白血病，儿童急性；骨髓瘤，多发性(骨髓癌)；骨髓增殖性疾病，慢性；鼻腔和鼻旁窦癌；鼻咽癌；神经母细胞瘤；非霍奇金淋巴瘤；非小细胞肺癌；口腔癌；口咽癌；骨肉瘤/恶性骨纤维组织细胞瘤；卵巢癌；卵巢
ii限制性的。在一些实施方案中，mhc-ii限制性的cd8 t细胞识别在至少90％的其他用载体进行免疫接种的对象中共有的肽。在一些实施方案中，cd8 t细胞针对由mhc-ii呈递的超表位。
[0142]
在一些实施方案中，该方法还包括从由人中的ul128-130和ul146-147缺失的hcmv载体、或者恒河猴中的rhcmv毒株68-1载体、或者食蟹猴(cynomolgus macaques)中的ul128-130和ul146-147缺失的cycmv载体引发的cd8 t细胞中鉴定cd8 t细胞受体。在一些实施方案中，cd8 t细胞受体通过rna或dna测序来鉴定。在一些实施方案中，该方法还包括识别mhc-e或mhc-ii超表位的cd8 t细胞受体。在一些实施方案中，mhc-e超表位包含来源于pap、wt1、msln、her2、来自毒株16的hpv e6和e7、来自毒株18的hpv e6和e7或者hpv e6/e7融合蛋白的肽。
[0143]
在一些实施方案中，mhc-e或mhc-ii超表位肽与对应于以下的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性：96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性：
[0144]
在一些实施方案中，mhc-e或mhc-ii超表位肽与对应于以下的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性：或
[0145]
在一些实施方案中，mhc-e或mhc-ii超表位肽与对应于以下的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性：
[0146][0147]
在一些实施方案中，该方法还包括从由人中的ul128-130和ul146-147缺失的hcmv载体、或者恒河猴中的rhcmv毒株68-1载体、或者食蟹猴中的ul128-130和ul146-147缺失的cycmv载体引发的cd8 t细胞中鉴定cd8 t细胞受体，其中cd8 t细胞受体识别mhc-ii/异源抗原来源的肽复合体。在一些实施方案中，cd8 t细胞受体通过rna或dna测序来鉴定。
[0148]
在一些实施方案中，该方法还包括识别特定mhc-ii超表位的cd8 t细胞受体。在一些实施方案中，特定mhc-ii超表位包含来源于pap、wt1、msln、her2、来自毒株16的hpv e6和e7、来自毒株18的hpv e6和e7或者hpv e6/e7融合蛋白的肽。
[0149]
在一些实施方案中，重组cmv载体表达活性ul128和ull30，以及无活性的us11。在一些实施方案中，由该载体引发的cd8 t细胞应答的特征在于具有至少10％的针对由mhc-i呈递的表位的cd8 t细胞。在另一些实例中，至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少
50％、至少60％、至少75％、至少90％、至少95％或至少95％的cd8 t细胞是mhc-i限制性的。
[0150]
在一些实施方案中，该方法还包括从由cmv载体引发的cd8 t细胞中鉴定cd8 t细胞受体，其中cd8 t细胞受体识别mhc-i/异源抗原来源的肽复合体。在一些实施方案中，t细胞受体来自人或猴t细胞。在一些实施方案中，cd8 t细胞受体通过rna或dna测序来鉴定。
[0151]
在一些实施方案中，施用重组cmv载体以预防或治疗癌症。在一些实施方案中，癌症是急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、骨髓增生异常综合征、急性淋巴母细胞白血病、慢性淋巴母细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、恶性黑素瘤、间皮瘤、恶性间皮瘤、肾癌、宫颈癌、口咽癌、肛门癌、阴茎癌、阴道癌、外阴癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌、肾细胞癌或生殖细胞瘤。
[0152]
在一些实施方案中，施用重组cmv载体以预防或治疗肿瘤病毒阳性癌症。在一些实施方案中，肿瘤病毒阳性癌症是急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、骨髓增生异常综合征、急性淋巴母细胞白血病、慢性淋巴母细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、恶性黑素瘤、间皮瘤、恶性间皮瘤、肾癌、宫颈癌、口咽癌、肛门癌、阴茎癌、阴道癌、外阴癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌、肾细胞癌或生殖细胞瘤。
[0153]
术语肿瘤病毒包括但不限于人t淋巴细胞病毒、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒(hpv)、人多瘤病毒、卡波西肉瘤相关疱疹病毒、梅克尔细胞多瘤病毒和eb病毒。在一些实施方案中，肿瘤病毒抗原是来自hpv毒株16的e6和e7或者来自hpv毒株18的e6和e7。在一些实施方案中，肿瘤病毒抗原是来自hpv的e6和e7的融合物。肿瘤病毒抗原可以是来源于肿瘤病毒任何部分的蛋白质。例如，在一些实施方案中，肿瘤病毒抗原可来源于核心、包膜、表面或聚合酶蛋白。
[0154]
本文中还公开了在对象中产生针对至少一种肿瘤相关抗原的免疫应答的方法。该方法涉及向对象施用有效量的包含至少一种肿瘤相关抗原的重组cmv载体。在一些实施方案中，cmv载体的特征在于具有不表达活性ul128、ul130或us11蛋白的核酸序列。
[0155]
在一些实施方案中，由于编码ul128、ul130、或us11或者其同源物、或者其直系同源物(感染其他物种的cmv同源基因)的核酸序列中存在突变，载体不表达活性ul128、ul130或us11蛋白。突变可以是导致活性蛋白质缺乏表达的任何突变。这样的突变可包括点突变、移码突变、编码蛋白质的序列少于全部的缺失(截短突变)、或编码蛋白质的核酸序列全部缺失、或任何其他突变。
[0156]
在另一些实例中，由于载体中的包含抑制ul128、ul130或us11蛋白表达的反义或rnai序列(sirna或mirna)的核酸序列的存在，载体不表达活性ul128、ul130或us11蛋白。突变和/或反义和/或rnai可以以任何组合使用以产生缺乏活性ul128、ul130或us11的cmv载体。
[0157]
在一些实施方案中，该方法还包括从由cmv载体引发的cd8 t细胞中鉴定cd8 t细胞受体，其中cd8 t细胞受体识别mhc-i异源抗原来源的肽复合体。在一些实施方案中，cd8 t细胞受体通过rna或dna测序来鉴定。
[0158]
本文中还公开了产生识别mhc-e-肽复合体的cd8 t细胞的方法。该方法涉及将cmv载体以有效产生识别mhc-e/肽复合体的一组cd8 t细胞的量施用于第一对象(或动物)。cmv载体包含编码至少一种异源抗原的第一核酸序列，并且不表达：活性ul128蛋白或其直系同源物；活性ul130蛋白或其直系同源物；或者活性ul146蛋白或其直系同源物、活性ul147蛋
白或其直系同源物。抗原可以是任何抗原，包括病原体特异性抗原、肿瘤病毒抗原、肿瘤相关抗原或宿主自身抗原。在一些实施方案中，宿主自身抗原是来源于t细胞受体或b细胞受体的可变区的抗原。
[0159]
在一些实施方案中，肿瘤相关抗原与对应于以下的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性：97％、至少98％、至少99％或100％的同一性：
[0160]
在一些实施方案中，肿瘤相关抗原与对应于以下的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性：少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性：
[0161]
在一些实施方案中，肿瘤相关抗原与对应于以下的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性：97％、至少98％、至少99％或100％的同一性：
[0162]
该方法还包括：将包含表达肿瘤相关抗原的核酸的重组cmv载体以有效产生识别mhc-e/肽复合体的第一组cd8 t细胞的量施用于第一对象，其中cmv载体不表达活性ul128、ul130、ul146和ul147蛋白或其直系同源物。在一些实施方案中，该方法还可包括从第一组cd8 t细胞中鉴定第一cd8 tcr，其中第一cd8 tcr识别mhc-e/肿瘤相关抗原来源的肽复合体。在一些实施方案中，该方法还可包括从第二对象中分离第二组一种或更多种cd8 t细胞。在一些实施方案中，该方法还可包括用表达载体转染第二组一种或更多种cd8 t细胞，其中表达载体包含编码第二cd8 tcr的核酸序列和与编码第二cd8 tcr的核酸序列可操作地连接的启动子，其中第二cd8 tcr包含第一cd8 tcr的cdr3α和cdr3β，从而产生识别mhc-e/肿瘤相关抗原肽复合体肿瘤相关抗原的cd8 t细胞。
[0163]
该方法还包括：从第一对象中分离第一组cd8 t细胞，其中所述第一对象已施用了有效产生识别mhc-e/肽复合体的第一组cd8 t细胞的量的包含表达肿瘤相关抗原的核酸的重组cmv载体，其中cmv载体不表达活性ul128、ull30、ull46和ul147蛋白、或其直系同源物。在一些实施方案中，该方法还包括从第一组cd8 t细胞中鉴定第一cd8 tcr，其中第一cd8 tcr识别mhc-e/肿瘤相关抗原来源的肽复合体。在一些实施方案中，该方法还包括从第二对象中分离第二组一种或更多种cd8 t细胞。在一些实施方案中，该方法还包括用表达载体转染第二组一种或更多种cd8 t细胞，其中表达载体包含编码第二cd8 tcr的核酸序列和与编码第二cd8 tcr的核酸序列可操作地连接的启动子，其中第二cd8 tcr包含第一cd8 tcr的cdr3α和cdr3β，从而产生识别mhc-e/肿瘤相关抗原肽复合体的cd8 t细胞。
[0164]
用于用表达载体转染的一种或更多种cd8 t细胞可从第一对象或第二对象中分离。
[0165]
在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含以下氨基酸序列：
[0166][0167]
在一些实施方案中，该方法还包括从由cmv载体引发的cd8 t细胞中鉴定cd8 t细胞受体，其中cd8 t细胞受体识别mhc-e/异源抗原来源的肽复合体。在一些实施方案中，cd8 t细胞受体通过rna或dna测序来鉴定。在一些实施方案中，该方法还包括识别mhc-e超表位的cd8 t细胞受体。在一些实施方案中，mhc-e超表位包含来源于pap、wt1、msln、her2以及hpv16或hpv18的e6或e7中的一种或更多种的肽。
[0168]
还公开了识别mhc-e-肽复合体的经转染的cd8 t细胞，其通过包括以下步骤的过程来制备：(a)将包含表达肿瘤相关抗原的核酸的重组cmv载体以有效产生识别mhc-e/肽复合体的第一组cd8 t细胞的量施用于第一对象，其中cmv载体不表达活性ul128、ul130、ul146和ul147蛋白、或其直系同源物；(b)从第一组cd8 t细胞中鉴定第一cd8 tcr，其中第一cd8 tcr识别mhc-e/肿瘤相关抗原来源的肽复合体；(c)从第二对象中分离第二组一种或更多种cd8 t细胞；以及(d)用表达载体转染第二组一种或更多种cd8 t细胞，其中表达载体包含编码第二cd8 tcr的核酸序列和与编码第二cd8 tcr的核酸序列可操作地连接的启动子，其中第二cd8 tcr包含第一cd8 tcr的cdr3α和cdr3β，从而产生识别mhc-e/肿瘤相关抗原肽复合体肿瘤相关抗原的cd8 t细胞。
[0169]
还公开了识别mhc-e-肽复合体的经转染的cd8 t细胞，其通过包括以下步骤的过程来制备：(a)从第一对象中分离第一组cd8 t细胞，其中所述第一对象已施用了有效产生识别mhc-e/肽复合体的第一组cd8 t细胞的量的包含表达肿瘤相关抗原的核酸的重组cmv载体，其中cmv载体不表达活性ul128、ul130、ul146和ul147蛋白、或其直系同源物；(b)从第一组cd8 t细胞中鉴定第一cd8 tcr，其中第一cd8 tcr识别mhc-e/肿瘤相关抗原来源的肽复合体；(c)从第二对象中分离第二组一种或更多种cd8 t细胞；以及(d)用表达载体转染第二组一种或更多种cd8 t细胞，其中表达载体包含编码第二cd8 tcr的核酸序列和与编码第二cd8 tcr的核酸序列可操作地连接的启动子，其中第二cd8 tcr包含第一cd8 tcr的cdr3α和cdr3β，从而产生识别mhc-e/肿瘤相关抗原肽复合体的cd8 t细胞。
[0170]
cmv载体包含编码至少一种异源抗原的第一核酸序列，并且不表达：活性ul128蛋白或其直系同源物；活性ul130蛋白或其直系同源物；活性ul146蛋白或其直系同源物；或者活性ul147蛋白或其直系同源物。表达载体包含编码第二cd8 t细胞受体的核酸序列和与编码第二cd8 t细胞受体的核酸序列可操作地连接的启动子，其中第二cd8 t细胞受体包含第一cd8 t细胞受体的cdr3α和cdr3β。异源抗原可以是任何抗原，包括病原体特异性抗原、肿
瘤病毒抗原或宿主自身抗原。
[0171]
在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含以下氨基酸序列：
[0172][0173][0174]
在一些实施方案中，第一cd8 t细胞受体通过rna或dna测序来鉴定。
[0175]
本文中还公开了治疗疾病例如癌症、病原体感染或者免疫疾病或病症的方法，该方法包括将识别mhc-e-肽复合体的经转染的t细胞施用于第一或第二对象。本文中还公开了诱导针对宿主自身抗原或组织特异性抗原的免疫应答的方法，该方法包括将识别mhc-e-肽复合体的经转染的t细胞施用于第一或第二对象。本文中还公开了cd8 t细胞在制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途。本文中还公开了cd8 t细胞在制备用于在对象中诱导针对宿主自身抗原的免疫应答的药物中的用途。
[0176]
本文中还公开了产生识别mhc-ii-肽复合体的cd8 t细胞的方法。该方法涉及将包含表达肿瘤抗原的核酸的重组cmv载体以有效产生识别mhc-ii/肽复合体的第一组cd8 t细胞的量施用于第一对象，其中所述cmv载体不表达活性ul128、ul130、ul146和ul147蛋白、或其直系同源物。在一些实施方案中，该方法还可包括从第一组cd8 t细胞中鉴定第一cd8 tcr，其中第一cd8 tcr识别mhc-ii/肿瘤抗原来源的肽复合体。在一些实施方案中，该方法还可包括从第二对象中分离第二组一种或更多种cd8 t细胞。在一些实施方案中，该方法还可包括用表达载体转染第二组一种或更多种cd8 t细胞，其中表达载体包含编码第二cd8 tcr的核酸序列和与编码第二cd8 tcr的核酸序列可操作地连接的启动子，其中第二cd8 tcr包含第一cd8 tcr的cdr3α和cdr3β，从而产生识别mhc-ii/肿瘤抗原肽复合体的cd8 t细胞。
[0177]
在一些实施方案中，该方法涉及从第一对象中分离第一组cd8 t细胞，其中第一对象已施用了有效产生识别mhc-ii/肽复合体的第一组cd8 t细胞的量的包含表达肿瘤抗原的核酸的重组cmv载体，其中cmv载体不表达活性ul128、ul130、ul146和ul147蛋白、或其直系同源物。在一些实施方案中，该方法还包括从第一组cd8 t细胞中鉴定第一cd8 tcr，其中第一cd8 tcr识别mhc-ii/肿瘤抗原来源的肽复合体。在一些实施方案中，该方法还包括从第二对象中分离第二组一种或更多种cd8 t细胞。在一些实施方案中，该方法还包括用表达载体转染第二组一种或更多种cd8 t细胞，其中表达载体包含编码第二cd8 tcr的核酸序列和与编码第二cd8 tcr的核酸序列可操作地连接的启动子，其中第二cd8 tcr包含第一cd8 tcr的cdr3α和cdr3β，从而产生识别mhc-ii/肿瘤抗原肽复合体的cd8 t细胞。
[0178]
cmv载体包含编码至少一种异源抗原的第一核酸序列，并且不表达：活性ul128蛋白或其直系同源物；活性ul130蛋白或其直系同源物；活性ul146蛋白或其直系同源物；或者活性ul147蛋白或其直系同源物，蛋白质或其直系同源物。抗原可以是任何抗原，包括病原
体特异性抗原、肿瘤病毒抗原、肿瘤相关抗原、组织特异性抗原或宿主自身抗原。在一些实施方案中，宿主自身抗原是来源于t细胞受体或b细胞受体的可变区的抗原。在一些实施方案中，宿主自身抗原可以是由癌细胞异常表达的肿瘤相关抗原(taa)。taa包括但不限于：i)在癌细胞中表达的种系/睾丸抗原，ii)在成体组织中不表达的细胞谱系分化抗原，或iii)在癌细胞中过表达的抗原。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含以下氨基酸序列：
[0179][0180]
在一些实施方案中，该方法还包括从由cmv载体引发的cd8 t细胞中鉴定cd8 t细胞受体，其中cd8 t细胞受体识别mhc-ii/异源抗原来源的肽复合体。在一些实施方案中，cd8 t细胞受体通过rna或dna测序来鉴定。
[0181]
在一些实施方案中，该方法还包括识别特定mhc-ii超表位的cd8 t细胞受体。在一些实施方案中，特定mhc-ii超表位包含来源于pap、wt1、msln、her2、来自毒株16的hpv e6或e7、来自毒株18的hpv e6或e7、和hpv e6/e7融合蛋白中的一种或更多种的肽。
[0182]
还公开了识别mhc-ii-肽复合体的经转染的cd8 t细胞，其通过包括以下步骤的过程来制备：(a)将包含表达肿瘤抗原的核酸的重组cmv载体以有效产生识别mhc-ii/肽复合体的第一组cd8 t细胞的量施用于第一对象，其中所述cmv载体不表达活性ul128、ul130、ul146和ul147蛋白、或其直系同源物；(b)从第一组cd8 t细胞中鉴定第一cd8 tcr，其中第一cd8 tcr识别mhc-ii/肿瘤抗原来源的肽复合体；(c)从第二对象中分离第二组一种或更多种cd8 t细胞；以及(d)用表达载体转染第二组一种或更多种cd8 t细胞，其中表达载体包含编码第二cd8 tcr的核酸序列和与编码第二cd8 tcr的核酸序列可操作地连接的启动子，其中第二cd8 tcr包含第一cd8 tcr的cdr3α和cdr3β，从而产生识别mhc-ii/肿瘤抗原肽复合体的cd8 t细胞。
[0183]
还公开了识别mhc-ii-肽复合体的经转染的cd8 t细胞，其通过包括以下步骤的过程来制备：(a)从第一对象中分离第一组cd8 t细胞，其中所述第一对象已施用了有效产生识别mhc-ii/肽复合体的第一组cd8 t细胞的量的包含表达肿瘤抗原的核酸的重组cmv载体，其中cmv载体不表达活性ul128、ul130、ul146和ul147蛋白、或其直系同源物；(b)从第一组cd8 t细胞中鉴定第一cd8 tcr，其中第一cd8 tcr识别mhc-ii/肿瘤抗原来源的肽复合体；(c)从第二对象中分离第二组一种或更多种cd8 t细胞；以及(d)用表达载体转染第二组一种或更多种cd8 t细胞，其中表达载体包含编码第二cd8 tcr的核酸序列和与编码第二cd8 tcr的核酸序列可操作地连接的启动子，其中第二cd8 tcr包含第一cd8 tcr的cdr3α和cdr3β，从而产生识别mhc-ii/肿瘤抗原肽复合体的cd8 t细胞。
[0184]
在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含以下氨基酸序列：
[0185][0186][0187]
cmv载体包含编码至少一种异源抗原的第一核酸序列，并且不表达：活性ul128蛋白或其直系同源物；活性ul130蛋白或其直系同源物；和活性ul146蛋白或其直系同源物、活性ul147蛋白或其直系同源物。表达载体包含编码第二cd8 t细胞受体的核酸序列和与编码第二cd8 t细胞受体的核酸序列可操作地连接的启动子，其中第二cd8 t细胞受体包含第一cd8 t细胞受体的cdr3α和cdr3β。异源抗原可以是任何抗原，包括病原体特异性抗原、肿瘤病毒抗原、组织特异性抗原或宿主自身抗原。在一些实施方案中，第一cd8 t细胞受体通过rna或dna测序来鉴定。本文中还公开了治疗疾病例如癌症、病原体感染或者免疫疾病或病症的方法，该方法包括将识别mhc-ii肽复合体的经转染的t细胞施用于第一或第二对象。本文中还公开了诱导针对宿主自身抗原或组织特异性抗原的免疫应答的方法，该方法包括将识别mhc-ii-肽复合体的经转染的t细胞施用于第一或第二对象。
[0188]
本文中还公开了产生识别mhc-i-肽复合体的cd8 t细胞的方法。该方法涉及将cmv载体以有效产生识别mhc-i/肽复合体的一组cd8 t细胞的量施用于第一对象(或动物)。cmv载体包含编码至少一种异源抗原的第一核酸序列，并表达：活性ul128蛋白或其直系同源物；活性ul130蛋白或其直系同源物；活性ul146蛋白或其直系同源物；和活性ul147蛋白或其直系同源物。抗原可以是任何抗原，包括病原体特异性抗原、肿瘤病毒抗原、肿瘤相关抗原、组织特异性抗原或宿主自身抗原。在一些实施方案中，宿主自身抗原是来源于t细胞受体或b细胞受体的可变区的抗原。
[0189]
在一些实施方案中，该方法还包括从由cmv载体引发的cd8 t细胞中鉴定cd8 t细胞受体，其中cd8 t细胞受体识别mhc-i/异源抗原来源的肽复合体。在一些实施方案中，cd8 t细胞受体通过rna或dna测序来鉴定。
[0190]
在一些实施方案中，该方法还包括识别特定mhc-i表位的cd8 t细胞受体。在一些实施方案中，特定mhc-i表位包含pap、wt1、msln、her2、来自毒株16的hpv e6或e7、来自毒株18的hpv e6或e7、和hpv e6/e7融合蛋白中的一种或更多种。
[0191]
在一些实施方案中，该方法还可包括将一种或更多种经转染的t细胞施用于第一或第二对象以治疗疾病，例如癌症、病原体感染或者免疫疾病或病症。在一些实施方案中，该方法还可包括将一种或更多种经转染的t细胞施用于第一或第二对象以诱导针对肿瘤相关抗原的免疫应答。
[0192]
本文中公开的cmv载体可用作包含重组cmv病毒或载体和可药用载体或稀释剂的免疫原性组合物、免疫组合物或疫苗组合物。包含重组cmv病毒或载体(或其表达产物)的免疫组合物引发局部或全身免疫应答。应答可以是但不必是保护性的。包含重组cmv病毒或载
体(或其表达产物)的免疫原性组合物同样引发局部或全身免疫应答，该应答可以是但不必是保护性的。疫苗组合物引发局部或全身的保护性应答。因此，术语“免疫组合物”和“免疫原性组合物”包括“疫苗组合物”(因为前两个术语可以是保护性组合物)。
[0193]
本文中公开的重组cmv载体可以是人巨细胞病毒载体、恒河猴巨细胞病毒载体或食蟹猴载体。
[0194]
本文中公开的重组cmv载体可用于在对象中诱导免疫应答的方法中，该方法包括向对象施用包含重组cmv病毒或载体和可药用载体或稀释剂的免疫原性组合物、免疫组合物或疫苗组合物。
[0195]
本文中公开的重组cmv载体可用于包含重组cmv病毒或载体和可药用载体或稀释剂的治疗性组合物中。本文中公开的cmv载体可通过将包含编码肿瘤相关抗原的序列的dna插入到cmv基因组的必需或非必需区域来制备。该方法还可包括从cmv基因组中缺失一个或更多个区域。该方法可包括体内重组。因此，该方法可包括在存在供体dna的情况下在细胞相容培养基中用cmv dna转染细胞，所述供体dna包含侧翼为与cmv基因组的部分同源的dna序列的异源dna，由此将异源dna引入到cmv的基因组中，并且随后任选地回收通过体内重组修饰的cmv。该方法还可包括切割cmv dna以获得经切割的cmv dna，将异源dna连接到经切割的cmv dna以获得杂合cmv-异源dna，用杂合cmv-异源dna转染细胞，以及随后任选地回收通过在存在异源dna的情况下修饰的cmv；由于理解了体内重组，因此该方法还提供了包含非天然存在于cmv中的编码cmv外来多肽的供体dna的质粒，供体dna位于cmv dna的区段内，否则该区段将与cmv基因组的必需或非必需区域共线，使得来自cmv的必需或非必需区域的dna位于供体dna的侧翼；当期望时，可将异源dna插入到cmv中以产生任何取向的重组cmv，从而产生该dna的稳定整合及其表达。
[0196]
重组cmv载体中编码异源抗原的dna还可包含启动子。启动子可来自任何来源(例如疱疹病毒)，其包括内源性巨细胞病毒(cmv)启动子，例如人cmv(hcmv)、恒河猴cmv(rhcmv)、鼠或其他cmv启动子。启动子也可以是非病毒启动子，例如ef1α启动子。启动子可以是经截短的转录活性启动子，其包含用病毒提供的反式激活蛋白反式激活的区域和从中获得经截短的转录活性启动子的全长启动子的最小启动子区域。启动子可由对应于最小启动子的dna序列和上游调节序列的缔合物构成。最小启动子由cap位点加ata框(基本转录水平的最小序列；未调节的转录水平)构成；“上游调节序列”由上游元件和增强子序列构成。此外，术语“经截短的”表示全长启动子不完全存在，即全长启动子的一些部分已被除去。并且，经截短的启动子可来源于疱疹病毒，例如mcmv或hcmv，例如hcmv-ie或mcmv-ie。基于碱基对，全长启动子在尺寸上可降低多至40％并且降低甚至多至90％。启动子也可以是经修饰的非病毒启动子。关于hcmv启动子，参考美国专利no.5,168,062和5,385,839。关于用质粒dna转染细胞以从中表达，参考feigner et al.(1994)，j biol.chem.269，2550-2561。并且，关于直接注射质粒dna作为针对多种感染性疾病的简单且有效的疫苗接种方法，参考science，259：1745-49，1993。因此，在本公开内容的范围内，载体可通过直接注射载体dna来使用。
[0197]
还公开了表达盒，其可插入到包含经截短的转录活性启动子的重组病毒或质粒中。表达盒还可包含功能性的经截短的多腺苷酸化信号；例如经截短的但仍具有功能的sv40多腺苷酸化信号。考虑到天然提供的较大的信号，经截短的多腺苷酸化信号具有功能
确实出人意料。经截短的多腺苷酸化信号解决了重组病毒(例如cmv)的插入尺寸限制问题。表达盒还可包括与其所插入的病毒或系统有关的异源dna；并且该dna可以是如本文中所述的异源dna。
[0198]
关于用于疫苗组合物或免疫组合物的抗原，另见stedman
′
s medical dictionary(第24版，1982，例如，疫苗的定义(用于疫苗制剂中的抗原列表)；可使用这样的抗原或来自那些抗原的目的表位。对于肿瘤相关抗原，本领域技术人员可在无过度实验的情况下从肽或多肽的氨基酸和相应dna序列的知识，以及从特定氨基酸的性质(例如尺寸、电荷等)和密码子字典来选择肿瘤相关抗原及其编码dna。
[0199]
确定抗原的t表位的一种方法涉及表位作图。肿瘤相关抗原的重叠肽通过寡肽合成来产生。随后针对单独肽诱导t细胞活化的能力来对所述单独肽进行测试。这种方法在绘制t细胞表位方面特别有用，因为t细胞识别与mhc分子复合的短线性肽。
[0200]
针对肿瘤相关抗原的免疫应答通常如下产生：仅当蛋白质被切割成较小的肽并且以位于另一个细胞表面上的称为“主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，mhc)”的复合体来呈递时，t细胞才识别蛋白质。mhc复合体有两类：i类和ii类，并且每一类均由许多不同的等位基因构成。不同物种、以及个体对象具有不同类型的mhc复合体等位基因；认为其具有不同的mhc类型。一种类型的mhc i类分子被称为mhc-e(人中的hla-e、rm中的mamu-e、小鼠中的qa-lb)。与其他mhc-i分子不同，mhc-e在哺乳动物物种内和哺乳动物物种之间高度保守。
[0201]
值得注意的是，包含编码肿瘤相关抗原的序列的dna本身可包含用于在cmv载体中驱动表达的启动子，或者dna可限于肿瘤相关抗原的编码dna。该构建体可相对于内源性cmv启动子以这样的取向放置，使得其与启动子可操作地连接并由此被表达。此外，可进行编码肿瘤相关抗原的dna的多拷贝，或者可使用强或早期启动子或者早期和晚期启动子或者其任意组合，以便扩增或提高表达。因此，编码肿瘤相关抗原的dna可相对于cmv内源启动子适当地定位，或者那些启动子可易位以与编码肿瘤相关抗原的dna一起插入到另一个位置中。编码多于一种肿瘤相关抗原的核酸可包装在cmv载体中。
[0202]
还公开了包含所公开的cmv载体的药物组合物和其他组合物。这样的药物组合物和其他组合物可配制成以本领域已知的任何施用程序使用。这样的药物组合物可以是通过肠胃外途径(皮内、肌内、皮下、静脉内或其他)的。施用也可以是通过黏膜途径，例如经口、鼻、生殖器等的。
[0203]
所公开的药物组合物可根据药物领域技术人员公知的标准技术来制备。考虑到这样的因素如特定患者的品种或物种、年龄、性别、重量和状况以及施用途径，这样的组合物可以以医学领域技术人员公知的剂量和技术来施用。组合物可单独施用，或者可与其他cmv载体或者与其他免疫组合物、抗原组合物或疫苗组合物或治疗组合物共施用或依次施用。这样的其他组合物可包含经纯化的天然抗原或表位或者来自由重组cmv或另一载体系统表达的抗原或表位；并在考虑上述因素的情况下进行施用。
[0204]
组合物的一些实例包括用于孔口例如经口、鼻、肛门、生殖器例如阴道等施用的液体制剂，例如混悬剂、糖浆剂或酏剂；以及用于肠胃外、皮下、皮内、肌内或静脉内施用(例如可注射施用)的制剂，例如无菌混悬剂或乳剂。在这样的组合物中，重组体可与合适的载体、稀释剂或赋形剂例如无菌水、生理盐水、葡萄糖等混合。
[0205]
抗原组合物、免疫组合物或疫苗组合物通常可包含佐剂和一定量的cmv载体或表达产物以引发期望的应答。在人的应用中，明矾(磷酸铝或氢氧化铝)是典型的佐剂。用于研究和兽医应用的皂苷及其纯化组分quil a、弗氏完全佐剂(freund
′
s complete adjuvant)和其他佐剂具有限制其在人疫苗中的潜在使用的毒性。也可使用化学限定制剂，例如胞壁酰二肽、单磷酰脂a(monophosphoryllipid a)、磷脂缀合物(例如由goodman-snitkoff et al.，j immunol.147：410-415(1991)描述的那些)、如由miller et al.，j exp.med.176∶1739-1744(1992)所描述的将蛋白质封装在脂蛋白体内、以及将蛋白质封装在脂质囊泡例如novasome脂质囊泡(micro vescular systems，inc.，nashua，n.h.)中。
[0206]
组合物可包装在单一剂型中用于通过肠胃外(例如，肌内、皮内或皮下)施用或孔口施用例如经舌(例如经口)、胃内、黏膜包括口内、肛门内、阴道内等施用来免疫接种。并且再次，有效剂量和施用途径通过组合物的性质、通过表达产物的性质、通过如果直接使用重组cmv时的表达水平、以及通过已知因素例如宿主的品种或物种、年龄、性别、重量、状况和性质，以及ld50和其他已知且不需要过度实验的筛选程序来确定。表达产物的剂量为数微克至数百微克，例如5至500μg。cmv载体可以以任何合适的量施用以实现在这些剂量水平的表达。在一些非限制性实例中：cmv载体可以以至少102pfu的量施用；因此，cmv载体可以以至少这个量施用；或以约102pfu至约107pfu施用。其他合适的载体或稀释剂可以是有或无防腐剂的水或缓冲盐水。cmv载体可冻干以供在施用时重悬，或者可在溶液中。
[0207]
应当理解，本公开内容的蛋白质和编码其的核酸可与本文中所示和所述的确切序列不同。因此，本公开内容考虑了对所示序列的缺失、添加、截短和替换，只要该序列根据本公开内容的方法发挥作用即可。在这方面，替换通常在性质上是保守的，即在氨基酸家族内发生的那些替换。例如，氨基酸一般分为四个家族：(1)酸性
‑‑
天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性
‑‑
赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(3)非极性
‑‑
丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸；以及(4)不带电荷的极性
‑‑
甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被分类为芳香族氨基酸。可合理地预测以下将不会对生物活性产生重大影响：用异亮氨酸或缬氨酸单独替换亮氨酸，或反之亦然；用谷氨酸替换天冬氨酸，或反之亦然；用丝氨酸替换苏氨酸，或反之亦然；或者用结构相关的氨基酸进行氨基酸的类似的保守替换。因此，具有与所描述的蛋白质基本相同的氨基酸序列但具有基本上不影响蛋白质免疫原性的少量氨基酸替换的蛋白质在本公开内容的范围内。
[0208]
本公开内容的核苷酸序列可以是经密码子优化的，例如可将密码子优化用于在人细胞中使用。例如，任何病毒或细菌序列均可如此改变。许多病毒包括hiv和其他慢病毒，使用大量稀有密码子并且通过改变这些密码子以对应于期望对象中常用的密码子，可如andreetal.，j virol.72：1497-1503，1998中所述实现肿瘤相关抗原的增强表达。
[0209]
编码cmv载体和其中包含的糖蛋白的功能和/或抗原性等同变体和衍生物的核苷酸序列被考虑在内。这些功能等同变体、衍生物和片段显示出保留抗原活性的能力。例如，不改变编码的氨基酸序列的dna序列的变化，以及导致氨基酸残基的保守替换、一个或数个氨基酸的缺失或添加以及氨基酸残基被氨基酸类似物替换的dna序列的变化是不显著影响所编码多肽的特性的那些。保守的氨基酸替换是甘氨酸/丙氨酸；缬氨酸/异亮氨酸/亮氨酸；天冬酰胺/谷氨酰胺；天冬氨酸/谷氨酸；丝氨酸/苏氨酸/甲硫氨酸；赖氨酸/精氨酸；和
苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸。在一些实施方案中，变体与目的抗原、表位、免疫原、肽或多肽具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性或同一性。
[0210]
本公开内容的多种重组核苷酸序列和抗体和/或抗原是使用标准重组dna和克隆技术来制备的。这样的技术是本领域技术人员公知的。参见例如，“molecular cloning：a laboratory manual"，第二版(sambrook et al.1989)。
[0211]
本文中所述的cmv载体可包含可防止宿主间传播的突变，从而使病毒无法感染免疫妥协对象或可由于cmv感染而面临并发症的其他对象。本文中所述的cmv载体还可包含导致呈递免疫显性和非免疫显性表位以及非典型mhc限制的突变。然而，本文中所述的cmv载体中的突变不影响该载体再感染先前已感染cmv的对象的能力。这样的cmv突变描述于例如美国专利公开2013-013676s、2010-0142s23、2014-014103s和pct申请公开wo 2014/13s209，所有这些通过引用并入本文。
[0212]
所公开的cmv载体可体内施用，例如在目的是产生免疫原性应答的情况下体内施用，所述免疫原性应答包括cd8 免疫应答，包括以高百分比的mhc-e、mhc-ii或mhc-i(或其同系物或直系同源物)限制性的cd8 t细胞应答为特征的免疫应答。例如，在一些实例中，可期望在实验室动物(例如恒河猴)中使用所公开的cmv载体以用于使用rhcmv对免疫原性组合物和疫苗进行临床前测试。在另一些实例中，期望在人对象中使用所公开的cmv载体，例如在临床试验中以及用于使用hcmv的免疫原性组合物的实际临床应用。
[0213]
对于这样的体内应用，所公开的cmv载体作为还包含可药用载体的免疫原性组合物的组分来施用。在一些实施方案中，本公开内容的免疫原性组合物可用于刺激针对包括肿瘤相关抗原、肿瘤病毒抗原或宿主自身抗原的异源抗原的免疫应答，并且可用作针对肿瘤相关抗原、肿瘤病毒抗原或宿主自身抗原的预防性或治疗性疫苗的一种或更多种组分以用于预防、改善或治疗癌症。本公开内容的核酸和载体特别可用于提供基因疫苗，即用于将编码本公开内容的抗原的核酸递送至对象(例如人)的疫苗，以使得抗原随后在所述对象中表达以引发免疫应答。
[0214]
针对动物(包括人)的免疫接种计划(或方案)是公知的，并且可容易地针对特定对象和免疫原性组合物来确定。因此，免疫原可向对象施用一次或更多次。优选地，在免疫原性组合物的分开施用之间存在设定的时间间隔。虽然这种间隔对于每个对象不同，但通常为10天至数周，[并且通常为2周、4周、6周或8周。对于人，间隔通常为2至6周。在本公开内容的一个特别有利的实施方案中，间隔更长，有利地为约10周、12周、14周、16周、18周、20周、22周、24周、26周、28周、30周、32周、34周、36周、38周、40周、42周、44周、46周、48周、50周、52周、54周、56周、58周、60周、62周、64周、66周、68周或70周。免疫接种方案通常具有1至6次的免疫原性组合物施用，但可少至一次或二次或四次。诱导免疫应答的方法还可包括施用佐剂和免疫原。在一些情况下，每年、每两年或其他长间隔(5至10年)加强免疫接种可补充初始免疫接种方案。本方法还包括多种初免-加强方案。在这些方法中，一次或更多次初免免疫接种之后是一次或更多次加强免疫接种。每次免疫接种的实际免疫原性组合物可相同或不同，并且免疫原性组合物的类型(例如，包含蛋白质或表达载体)、途径和免疫原的配制也可变化。例如，如果表达载体用于初免和加强步骤，则其可以是相同或不同的类型(例如，
dna或细菌或病毒表达载体)。一种有用的初免-加强方案提供两次初免免疫接种，间隔四周，随后在最后一次初免免疫接种之后4和8周进行两次加强免疫接种。对于本领域技术人员来说也应该是显而易见的是，存在多种排列和组合，其涵盖使用本公开内容的dna、细菌和病毒表达载体以提供初免和加强方案。cmv载体可重复使用，同时表达来源于不同病原体的不同抗原。
[0215]
实施例
[0216]
实施例1：cmv疫苗能够克服免疫耐受
[0217]
基于恒河猴巨细胞病毒(rhcmv)毒株68-1的疫苗载体引发cd8 t细胞应答，其在mhc-e和mhc-ii而不是经典的mhc-ia分子的情况下识别siv、tb或疟疾肽(hansen et al.2019.cytomegalovirus vectors expressing plasmodium knowlesi antigens induce immune responses that delay parasitemia upon sporozoite challenge.plos one 14：e0210252；hansen et al.，science，2013；hansen et al.，science，2016)。
[0218]
数种因素使hla-e成为用于癌症免疫治疗的特别有吸引力的靶标，包括：(a)在许多癌症中，已报道了癌细胞上调hla-e(kamiya 2019jclin invest)。由于hla-e是抑制性nkg2a受体的配体，因此这可能是选择逃避nk细胞逃避的癌细胞的结果；(b)正常组织(内皮细胞和一些免疫细胞除外)表达低水平的hla-e；(c)通常选择癌细胞来表达低水平的经典hla分子，这可能作为逃避t细胞控制的手段；以及(d)与高度多态性的经典hla分子不同，hla-e是高度保守的。因此，hla-e限制性tcr可普遍应用于转基因t细胞。
[0219]
基于cmv的载体可以以两种方式用作癌症免疫治疗：直接作为人的癌症疫苗，或间接作为在非人灵长类中引发mhc-e限制性tcr的载剂。然而，这两种方法均需要证明：(a)cmv能够引发mhc-e限制性cd8 t细胞针对癌抗原，并且(b)癌细胞能够呈递癌抗原。由于癌抗原通常是自身抗原，因此其具有免疫耐受性。对于大多数载体系统，破坏免疫耐受具有挑战性，如通过以下事实所例示的：痘载体(例如prostvac)在临床试验中失败，并且可能需要与检查点抑制性抗体组合以引发有效的前列腺抗原特异性免疫应答(https：//www.onclive.com/web-exclusives/prostvac-misses-phase-iii-goal-in-prostate-cancer)。此外，hla-e被认为是单肽vl9(其本身来源于多态性hla分子的信号肽)的高度选择性受体，并且其他肽如何通常加载到hla-e中是未知的。
[0220]
为了评价cmv在癌抗原的情况下引发mhc-e限制性cd8 t细胞应答的能力，产生了表达癌抗原的菌株68.1载体并将其施用于恒河猴(rm)。rhcmv菌株68-1缺乏ul128、ul130、ul146和ul147的rhcmv同源物。载体设计为表达以下插入片段之一：1)恒河猴pap，2)人wt1 ag，3)人msln，4)人her2，和5)hpv 16/18e6 e7。
[0221]
将六只雄性rm用表达癌抗原前列腺酸性磷酸酶(pap，恒河猴)的rhcmv毒株68-1(68-1/pap)进行接种。作为对照，也将rm用siv gag抗原(68-1/sivgag)进行接种。六只rm中的三只另外地用表达癌抗原维尔姆斯瘤抑制蛋白(wt1，人)的rhcmv毒株68-1(68-1/wt1)进行共接种，而其他三只rm另外地用表达癌抗原间皮素(msln，人)的rhcmv毒株68-1(68-1/msln)进行共接种。每只rm在第140天获得加强免疫接种并且所有猴在这个时间点接受所有抗原。在每个指定的时间点在外周血单个核细胞(pbmc)中通过胞内细胞因子染色(ics)使用每种抗原的重叠肽库来测量cd4 和cd8 t细胞应答。受感染的rm能够引发针对每种抗原的高频t细胞应答(图1)。这些结果非常重要，因为其表明基于cmv的疫苗能够克服免疫耐受
并引发针对自身抗原以及病毒癌基因的t细胞应答。重要的是，尽管事实是t细胞有自身反应性，但未观察到负面副作用。
[0222]
接下来，将六只雌性rm用表达癌抗原her2(人)的rhcmv毒株68-1(68-1/her2)进行接种。在每个指定的时间点在pbmc中通过ics使用her2的重叠肽库来测量cd4 和cd8 t细胞应答。如图2所示，受感染的rm能够引发针对her2的高频t细胞应答(图2)。
[0223]
将四只雌性rm用rhcmv毒株68-1(68-1/hpv)进行接种，并且将四只雌性rm用表达hpv16和hpv18的e6和e7蛋白的融合蛋白的rhcmv毒株68-1.2(68-1.2/hpv)进行接种。如由lilja ae和shenk t，proc natl acad sci usa 105，19950-19955(2008)所述，rhcmv菌株68-1.2被“修复”以用于ul128-130。载体被设计为表达一种cd4 和cd8 t细胞应答是在图3中的每个指定的时间点在pbmc中通过ics使用hpv抗原的重叠肽库进行测量的。如图3所示，所有经接种的rm均能够引发针对hpv 16和hpv18e6和e7癌基因的高频t细胞应答。毒株68-1引发mhc-ii和mhc-e限制性的cd8 t细胞，而毒株68-1.2引发mhc-i限制性的cd8 t细胞。
[0224]
实施例2：癌细胞可通过hla-e呈递癌抗原
[0225]
为了进一步确定以上产生的t细胞是否能够识别表达这些抗原的癌细胞，从与表达mhc-e的k562(人慢性髓性白血病)细胞一起孵育的cd8 t细胞中测量t细胞应答。由于k562细胞不表达其他mhc分子，因此任何呈递至t细胞的肽均将由mhc-e介导。
[0226]
将四只雌性rm用表达hpv16和hpv18的e6和e7蛋白的融合蛋白的68-1(68-1/hpv)进行接种。分离cd8 t细胞并将其与表达mhc-e或者mhc-e和相同hpv融合蛋白的k562细胞共孵育。通过针对tnfα和ifnγ的胞内细胞因子染色来测量t细胞应答(图4)。对tnfα和ifnγ二者的产生作出响应的cd8 t细胞显示在右上象限。用hpv融合蛋白转染的表达mhc-e的k562细胞(k562-e)被来自已用68-1/hpv进行免疫接种的4只rm中的两只的cd8 t细胞识别。由mhc-e呈递肽是通过添加作为mhc-e的高亲和力配体的肽vmaprtlll(vl9)(seq id no：1)来进一步证明的。添加vl9抑制了cd8 t细胞应答。这表明rm中引发的tcr可识别人mhc-e呈递肽。
[0227]
接下来，确定cmv载体是否可产生能够识别表达宿主自身抗原(例如恒河猴pap)的癌细胞的t细胞。将三只雄性rm用68-1/pap进行接种。分离cd8 t细胞并将其与表达mhc-e的k562细胞以及表达mhc-e和pap或mhc-e和hpv e6-e7融合蛋白的k562细胞共孵育。通过针对tnfα和ifnγ的胞内细胞因子染色(ics)来测量t细胞应答(图5)。对tnfα和ifnγ二者的产生作出响应的cd8 t细胞显示在右上象限。pap特异性mhc-e限制性cd8 t细胞应答被mhc-e配体肽vmaprtlll(vl9)(seq id no：1)阻断。用pap转染的k562-e，而不是用hpv融合蛋白转染的k562-e细胞，被从用68-1/pap进行免疫接种的rm中分离的cd8 t识别，这表明了特异性识别。添加vl9抑制了pap特异性cd8 t细胞应答，这表明识别是由mhc-e介导的。
[0228]
在第二个实验中，将六只雄性rm用68-1/pap和68-1/wt1进行共接种。分离cd8 t细胞并将其与表达mhc-e的k562细胞以及表达mhc-e和pap(恒河猴)或mhc-e和wt1(人)的k562细胞共孵育。通过针对tnfα和ifnγ的胞内细胞因子染色来测量t细胞应答(图6)。对tnfα和ifnγ二者的产生作出响应的cd8 t细胞显示在右上象限。用pap或wt1转染的k562-e被来自用68-1/pap和68-1/wt1免疫接种的六只rm的cd8 t细胞识别。
[0229]
在这些实验中，表达mhc-e和taa二者的癌细胞被mhc-e限制性cd8 t细胞识别。
[0230]
结果表明，基于cmv的癌症疫苗克服了免疫耐受所面临的数种挑战，即：
[0231]
(i)抗载体免疫不影响cmv载体引发针对插入抗原的t细胞应答的能力(hansen et al.，2010.evasion of cd8 t cells is critical for superinfection by cytomegalovirus.science 328：102-106.)；以及
[0232]
(ii)cmv载体引发针对taa的cd8 t细胞，其频率与引发针对外来抗原的cd8 t细胞的频率类似。因此，基于cmv的疫苗特别擅长破坏免疫耐受。破坏免疫耐受可以以两种方式发生：(a)诱导针对非典型的mhc-i限制性表位的mhc-i限制性cd8 t细胞(例如，68-1.2/pap)，或者(b)诱导针对非常规表位的mhc-e和mhc-ii限制性cd8 t细胞(基于68-1的载体)。这一点通过观察到缺失us11的基于cmv的载体未引发cd8 t细胞得到进一步说明。相比之下，us11缺失导致载体引发识别非自身抗原的典型(即免疫显性)表位的mhc-i限制性cd8 t细胞(hansen science 2010，hansen plosone 2019)。对于us11缺失载体未能引发针对自身抗原的mhc-i限制性cd8 t细胞，最可能的解释是这些t细胞在胸腺中被消除(＝中枢耐受)。中枢耐受可能是其他疫苗和载体系统相对于cmv在引发针对癌抗原的cd8 t细胞方面差的原因，因为它们不能引发针对非典型或亚显性mhc-i限制性表位的cd8 t细胞，并且它们不能引发针对mhc-ii或mhc-e限制性表位的cd8 t细胞。由于mhc-e在癌细胞中通常上调而mhc-i下调，因此靶向mhc-e可能特别有效。目前无其他载体系统可引发针对癌抗原的mhc-e限制性cd8 t细胞。
[0233]
实施例3：mhc-ii和mhc-e超表位的鉴定
[0234]
表达嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)的转基因t细胞(car-t细胞)已彻底改变了许多癌症，特别是白血病的治疗。在大部分情况下，car包含识别癌细胞表面蛋白质(例如b细胞淋巴瘤的cd20)的抗体来源的结合结构域。然而，为了避免对转基因t细胞的排斥，针对每个患者均产生新的car-t细胞，并且因此这种治疗非常昂贵。可用于所有患者的现成car-t细胞正在开发中，但迄今为止尚未有一个批准用于临床使用。
[0235]
由于car-t细胞可消除所有表达给定抗原的细胞(例如，所有表达cd20的b细胞)，因此其可具有使患者免疫抑制或患有免疫疾病并发症的副作用。经改造的tcr-t细胞，即在mhc的情况下对于识别肿瘤特异性肽的t细胞受体(t cell receptor，tcr)来说是转基因的t细胞，提供了可降低这样的副作用的另一种治疗方法。然而，任何给定的tcr将仅识别特定的mhc/肽复合体。由于mhc具有高度多态性，经改造的tcr的使用受限于携带正确mhc等位基因的个体，这是经改造的tcr-t细胞的严重限制。相比之下，mhc-e在人群体中是非多态性的，使得mhc-e限制性tcr是“通用的”(即，其可用于每个人)。事实上，mhc-e在非人灵长类与人之间甚至是保守的，使得rm中引发的tcr识别人mhc-e和hla-e/呈递肽。因此，rm中产生的mhc-e限制性taa特异性tcr可用于产生通用的现成的人tcr t细胞。鉴定这样的t细胞的关键步骤是鉴定mhc-e限制性超表位。在鉴定使用的超表位肽的情况下，随后可鉴定活化的t细胞中的tcr。
[0236]
已表明了us11同源物rh189的缺失引发“典型”mhc-i限制性cd8 t细胞应答，即，由于高亲和力肽与mhc-i结合并且cd8 t细胞表达对肽/mhc-i复合体具有高亲和力的t细胞受体，在常规疫苗的情况下肽是免疫显性的。利用该特性，制备了编码恒河猴pap的三种不同的构建体，并且其中一种不编码活性rh189：68-1.2/pap(预期引发mhc-i限制性cd8 t细胞应答)、68-1/pap(预期引发mhc-ii和mhc-e限制性cd8 t细胞应答)和68-1/papδrh189(预期引发mhc-ii和mhc-e限制性c和典型mhc-i限制性cd8 t细胞应答)。
[0237]
将八只雄性rm用68-1.2/pap、68-1/pap或68-1/papδrh189(us11)进行接种。在指定时间点通过ics使用tnfα和ifnγ的重叠肽库测量pbmc中的cd4 和cd8 t细胞应答(图7)。记忆t细胞中pap特异性t细胞的频率在图7中示出，其显示了经免疫接种的rm引发了高频率t细胞应答。
[0238]
接下来，进行了pap特异性cd8 t细胞的限制性分析(图8)。针对单独肽的cd8 t细胞应答显示为沿pap序列的正方形。被mhc-i特异性抗体w6/32(但不被肽vl9)阻断的肽应答以白色框示出。被mhc-ii特异性肽clip阻断的肽应答用虚线框示出。被mhc-e特异性肽阻断的肽应答用点线框示出。正如预期的，来自68-1.2/pap免疫接种动物的cd8 t细胞仅是mhc-i限制性的，而68-1/pap免疫接种动物则是mhc-ii或mhc-e限制性的。令人感兴趣的是，如针对病毒抗原所观察到的，rh189/us11的缺失未导致另外诱导“典型”mhc-i限制性应答(hansen，science 2013)。然而，该观察结果与pap遭受“中枢”免疫耐受一致，即表达高亲和力tcr的cd8 t细胞被胸腺中的负选择消除。该结果还表明，由68-1.2/pap引发的mhc-i限制性cd8 t细胞是“非典型的”，即cd8 t细胞识别亚显性表位。
[0239]
为了鉴定mhc-e和mhc-ii限制性超表位，针对用68-1rhcmv/pap、68-1rhcmv/wt1(参见实施例1)和68-1rhcmv/msnl(参见实施例1)免疫接种的所有六只动物进行了限制性分析(图9；图10，其示出了在存在阻断剂的情况下测试之后68-1 rhcmv/wt1的结果)。在图9和10中，针对单独肽的cd8 t细胞应答显示为沿taa序列的正方形，并且超表位肽在括号中示出。框的颜色显示超表位是否是mhc-e限制性、mhc-ii限制性，或者限制性是否尚未确定。超表位肽及其序列在表1中列出。
[0240]
表1.超表位肽
[0241]
抗原氨基酸序列限制性seq id nopap#3araaslslgflfllfmhc-ii2pap#9kelkfvtlvfrhgdrmhc-ii3pap#18qltqlgmeqhyelgemhc-ii4pap#24lnesykheqvyirstmhc-e5pap#68nhmkratqmpsykklmhc-e6pap#100mvllfihirrgpcwqmhc-ii7wt1#3vpepasqhtlrsgpgmhc-e8wt1#13saerlqgrrsrgasgmhc-e9wt1#14lqgrrsrgasgsepqmhc-e13wt1#58hedpmgqqgslgeqqmhc-e14msln#5ideslifykkwelea未确定10msln#13pftyeqldvlkhkld未确定11msln#58fmklrtdavlpltva未确定12
[0242]
mhc-e限制性超表位肽可用于鉴定mhc-e限制性tcr，而mhc-ii限制性超表位肽可用于鉴定mhc-ii限制性tcr。