重组ADAMTS13治疗镰状细胞病的应用的制作方法

重组adamts13治疗镰状细胞病的应用
相关申请的交叉引用
1.本技术要求2019年6月7日提交的美国临时申请第62/858,691号和2020年4月2日提交的美国临时申请第63/004,389号的优先权，两者均通过引用整体并入本文。
技术领域
2.本

技术实现要素：
涉及用具有血小板反应蛋白1型基序的解聚素和金属蛋白酶成员13(adamts13)治疗镰状细胞病的方法。更具体地，本发明涉及通过施用adamts13在患有镰状细胞病的受试者中增加adamts13介导的血管性血友病因子(vwf)裂解的方法。本发明还涉及通过在voc发作后施用adamts13来治疗患有镰状细胞病的受试者的血管闭塞危象(voc)的方法。本发明还涉及通过在voc发作之前施用adamts13来预防患有镰状细胞病的受试者的voc的方法。本发明进一步涉及确定小鼠模型中voc治疗疗效的方法。


背景技术：

3.镰状细胞病(scd)是一种全球分布的遗传性红细胞疾病，其由β-珠蛋白链中的点突变(βs，6v)导致产生缺陷形式的血红蛋白，即血红蛋白s(hbs)。对脱氧后hbs聚合动力学的研究表明，它是血红蛋白浓度的高阶指数函数，因此突出了细胞hbs浓度在镰状细胞中的关键作用。病理生理学研究表明，致密、脱水的红细胞在scd的急性和慢性临床表现中起核心作用，其中毛细血管、小血管和大血管中的血管内镰状化导致血管闭塞和血流受损，并导致各种器官和组织的缺血性细胞损伤。
4.已经报道了与急性血管闭塞事件相关的高水平超大vwf多聚体和血管性血友病因子(vwf)水平升高的镰状细胞病患者(krishnan等人，thromb res；122(4)：455-8，2008；kaul等，blood；81(9)：2429-38，1993)。超大vwf多聚体的水平取决于具有血小板反应蛋白1型基序的解聚素和金属蛋白酶成员13(adamts13)的金属蛋白酶的活性，其可在高流体剪切应力条件下裂解超大vwf多聚体，在维持止血活性和血栓形成风险之间的适当平衡方面发挥重要作用。adamts13裂解残基tyr1605和met1606之间的vwf，这对应于前序列裂解后的残基842-843，产生176kda和140kda的同型二聚体以及较小的血小板粘附性vwf多聚体(furlanm等，blood；87(10)：4223-34，1996；tsai等，blood；87(10)：4235-44，1996；crawley等，blood；118(12)：3212
–
21，2011)。正是adamts13介导的vwf裂解主要负责调节vwf多聚体大小和止血活性。循环血液中释放的vwf有助于形成血小板血栓，因为它与胶原蛋白结合并介导内皮下组织(包括受损的血管壁)中的血小板粘附和凝集。vwf释放伴随并部分由血管内皮的活化触发。与健康个体相比，scd患者(临床无症状和急性疼痛危象)的血浆显示adamts13活性非常轻微缺乏或没有缺乏，但vwf(特别是ulvwf多聚体)浓度更高，因此adamts13相对于其底物缺乏(zhou等，curr vasc pharmacol；10(6)：756-61，2012；schnog等，am j hematol；81：492-8，2006)。
5.镰状化还导致红细胞溶血，并因此导致释放过多的细胞外血红蛋白(echb)。scd患者中增加的echb通过与vwf的a2结构域特别是adamts13裂解位点结合来抑制adamts13介导
的vwf蛋白水解(zhou等，anemia.2011；2011：918916)。在scd患者中观察到的细胞外血红蛋白在血浆中的浓度通常为20-330μg/ml，在血管闭塞危象期间浓度》400μg/ml(zhou等，thromb haemost；101(6)：1070-77，2009)。血小板反应蛋白-1(tsp1)在scd患者中也会增加，它与超大vwf多聚体的a2域结合，还通过竞争性抑制adamts13活性来防止adamts13降解vwf。
6.scd是一种先天性、终生疾病。scd患者遗传了两种异常血红蛋白βs基因，父母各一个。当一个人有两个血红蛋白s基因，即血红蛋白ss(hbss)时，这种疾病称为镰状细胞性贫血。这是最常见也是最严重的scd类型。血红蛋白sc疾病和血红蛋白sβ地中海贫血是scd的另外两种常见形式。在所有形式的scd中，两种异常基因中的至少一种会导致人体在其红细胞中产生血红蛋白s或镰状血红蛋白。血红蛋白是红细胞中的一种蛋白质，可将氧气输送到全身。镰状血红蛋白与正常血红蛋白的不同之处在于其在缺氧张力条件下形成聚合物的倾向，聚合物在红细胞内形成硬棒，使其变成新月形或镰刀形。镰状细胞不灵活，这会导致阻塞，减缓或停止血液流动并基本上阻碍微循环。发生这种情况时，氧气无法到达附近的组织。组织缺氧会导致突然的剧烈疼痛发作，称为血管闭塞危象(voc)、疼痛危象或镰状细胞危象，这会导致供血器官缺血性损伤并导致疼痛。疼痛危象是scd的voc最显著的临床特征，是感染患者就诊和住院的主要原因。
7.voc是由镰状细胞(包括镰状细胞网织红细胞、内皮细胞、白细胞)和血浆成分(包括vwf)之间的相互作用引发和维持的。血管闭塞导致多种scd临床并发症，包括疼痛综合征、中风、腿部溃疡、自然流产和肾功能不全。voc的疼痛往往没有得到完全的治疗。目前对voc的治疗包括使用液体、氧气和镇痛剂，而慢性红细胞(rbc)输血和羟基脲可降低voc的发生率。然而，尽管在疼痛管理方面取得了进展，但由于担心成瘾、耐受性和副作用，医生通常不愿意给患者足够剂量的麻醉性镇痛剂。除急性voc外，scd的其他急性和慢性并发症包括肾病、脾梗塞、细菌感染风险增加、急性和慢性贫血、胸部综合征、中风和眼部疾病。
8.scd患者的急性疼痛是由在急性危象期间镰状红细胞阻塞微血管床引起的缺血性组织损伤引起的。例如，voc特有的严重骨痛被认为是由髓内压升高引起的，尤其是在长骨的近关节区域内，继发于镰状红细胞对骨髓血管坏死的急性炎症反应。疼痛也可能由于关节的骨膜或关节周围软组织损害而发生。急性危象的不可预测的复发对慢性疼痛的影响造成了一种独特的疼痛综合征。
9.scd的严重程度因人而异。scd诊断和护理方面的进步延长了scd患者的预期寿命。在美国等高收入国家，scd患者的预期寿命现在约为40-60岁，而40年前仅为14岁。然而，目前，造血干细胞移植(hsct)是scd的唯一治愈方法。不幸的是，大多数患有scd的人要么太老而不能进行移植，要么亲属没有足够匹配的基因作为成功移植的供体。
10.此外，缺乏scd中voc的临床生物标志物。因此，“准备出院(discharge)的时间”和“出院的时间”是主要疗效终点(voc消退时间)的重要组成部分(telenmj等，blood2015；125(17)：2656-2664，其全文以引用方式并入本文)。
11.因此，本领域需要改进的scd治疗，包括治疗scd的血管闭塞事件，其可以减轻症状、预防并发症和改善生命质量、延长寿命，以及有用的voc临床生物标志物。
发明内容
12.在一个方面，本发明提供了一种用于在患有镰状细胞病的受试者中增加具有血小板反应蛋白1型基序的解聚素和金属蛋白酶成员13(adamts13)介导的vwf裂解的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的包含adamts13的组合物。在一些实施方案中，与健康受试者相比，由于细胞外血红蛋白(echb)的血浆水平增加，受试者中adamts13介导的vwf裂解被抑制。在一些实施方案中，受试者的细胞外血红蛋白(echb)的血浆水平为约20-330μg/ml。在一些实施方案中，受试者的细胞外血红蛋白(echb)的血浆水平超过330μg/ml。
13.在一些实施方案中，与没有adamts13治疗的情况相比，施用adamts13导致超大vwf多聚体、vwf活性和vwf活性/抗原比中的至少一种的水平降低。在一些实施方案中，与没有adamts13治疗的情况相比，施用adamts13导致血浆中游离血红蛋白的水平降低。
14.在另一方面，本发明提供了一种治疗患有镰状细胞病的受试者的血管闭塞危象(voc)的方法，该方法包括在voc发作之后，向有需要的受试者施用治疗有效量的包含adamts13的组合物。
15.在另一方面，本发明提供了一种预防患有镰状细胞病的受试者的血管闭塞危象(voc)的方法，该方法包括在voc发作之前，向有需要的受试者施用治疗有效量的包含adamts13的组合物。
16.在一些实施方案中，组合物还包含adamts13变体。在一些实施方案中，adamts13变体包含与野生型adamt13相比具有至少一个单个氨基酸置换的氨基酸序列。在一些实施方案中，野生型adamts13是人adamts13。在一些实施方案中，野生型adamts13包含seq id no:1的氨基酸序列。在一些实施方案中，与野生型adamts13相比，单个氨基酸置换中的至少一个在adamts13催化结构域内。在一些实施方案中，单个氨基酸置换不是seq id no:1所示的i
79
m、v
88
m、h
96
d、r
102
c、s
119
f、i
178
t、r
193
w、t
196
i、s
203
p、l
232
q、h
234
q、d
235
h、a
250
v、s
263
c和/或r
268
p，或adamts13中的等效氨基酸处。在一些实施方案中，单个氨基酸置换在seq id no:1所示的氨基酸q
97
处，或adamts13中的等效氨基酸处。在一些实施方案中，单个氨基酸变化是从q到d、e、k、h、l、n、p或r。在一些实施方案中，单个氨基酸变化是从q到r。在一些实施方案中，adamts13变体包含seq id no:2的氨基酸序列。在一些实施方案中，adamts13变体基本上由seq id no:2组成。在一些实施方案中，adamts13变体由seq id no:2组成。
17.在本文描述的治疗方法的一些实施方案中，adamts13和/或其变体的治疗有效量为每千克体重约20至约6,000国际单位。在一些实施方案中，adamts13和/或其变体的治疗有效量为每千克体重约300至约3,000国际单位。在一些实施方案中，adamts13和/或其变体的治疗有效量为每千克体重约1,000至约3,000国际单位。
18.在本文描述的治疗方法的一些实施方案中，施用治疗有效量的adamts13和/或其变体导致受试者中adamts13和/或其变体的血浆浓度为约1至约80u/ml。
19.在本文描述的治疗方法的一些实施方案中，包含adamts13和/或其变体的组合物每月、每两周、每周、每周两次、每天、每12小时、每八小时、每六小时、每四小时或每两小时以单次弹丸注射(bolus injection)给药。在一些实施方案中，静脉内或皮下施用包含adamts13和/或其变体的组合物。
20.在本文描述的治疗方法的一些实施方案中，adamts13和/或其变体是重组的。在一
些实施方案中，adamts13和/或其变体是血浆来源的。在一些实施方案中，组合物在准备好给药的稳定水溶液中。在一些实施方案中，包含adamts13和/或其变体的组合物的治疗有效量足以在受试者中维持有效水平的adamts13活性。
21.在本文描述的治疗方法的一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是人。
22.在另一方面，本发明提供了一种确定受试者的血管闭塞危象(voc)的治疗疗效的方法，该方法包括：a)在voc后对受试者进行治疗；b)收集受试者的一种或多种行为症状，所述行为症状选自竖毛、冷漠、眼部外观、肤色、自发移动、受刺激移动和呼吸频率；c)根据从步骤b)收集的一种或多种行为症状的严重程度生成分数；d)将来自步骤c)的分数与对照分数进行比较，其中对照分数是由未接受治疗的对照受试者产生的；和e)(i)如果步骤c)的分数表明与对照分数相比严重程度更低，则确定治疗有效；(ii)如果步骤c)的分数表明与对照分数相比严重程度更高或相同，则确定治疗无效。
23.在另一方面，本发明提供了一种评估受试者从血管闭塞危象(voc)中恢复的方法，该方法包括：a)收集受试者在voc后的一种或多种行为症状，所述行为症状选自竖毛、冷漠、眼部外观、肤色、自发移动、受刺激移动和呼吸频率；b)根据从步骤a)收集的一种或多种行为症状的严重程度生成分数；c)将来自步骤b)的分数与对照分数进行比较，其中对照分数是由voc前的受试者或未患有voc的对照受试者产生的；和d)(i)如果步骤b)的分数表明与对照分数相比严重程度更低或相同，则确定受试者已经恢复；(ii)如果步骤b)的分数表明与对照分数相比严重程度更高，则确定受试者没有恢复。
24.在本文描述的诊断方法的一些实施方案中，一种或多种行为症状选自竖毛、冷漠、眼部外观、受刺激移动和呼吸频率。在一些实施方案中，对行为症状进行评分，从而将更高的数字分配给更严重的症状。
25.在本文描述的诊断方法的一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是小鼠。
26.前述概述并非旨在定义本发明的每个方面，并且在其他部分中描述了附加方面，例如以下详细描述。整个文档旨在作为统一的公开内容相关联，并且应当理解，即使在本文档的同一个句子、段落或部分中没有发现这些特征的组合，本文描述的特征的所有组合都被考虑在内。本发明的其他特征和优点将从以下详细描述中变得明显。然而，应当理解，详细说明和具体实施例虽然表明了本发明的具体实施方案，但仅以说明的方式给出，因为从该详细描述中，本领域技术人员将清楚在本发明的精神和范围内的各种变化和修改。
附图说明
27.图1是vwf裂解片段的免疫印迹，显示了对血红蛋白浓度增加的抑制作用。在血红
蛋白浓度不断增加的情况下，以恒定浓度的adamts13(1u/ml、0.5u/ml和0.25u/ml)进行裂解反应。通过多克隆抗vwf抗体辣根过氧化物酶(hrp)偶联物来观察176kda的二聚体裂解产物。
28.图2显示了对血红蛋白浓度增加的抑制作用的图解评价(graphical evaluation)。
29.图3是vwf裂解片段的免疫印迹，显示了radamts13浓度对血红蛋白抑制作用的压倒作用。在血红蛋白浓度增加或不存在血红蛋白的情况下，以恒定浓度的adamts13(0.25u/ml、0.5u/ml、1u/ml和2u/ml)进行裂解反应。通过多克隆抗vwf抗体辣根过氧化物酶(hrp)偶联物来观察176kda的二聚体裂解产物。
30.图4显示了radamts13浓度对血红蛋白抑制作用的压倒作用的图解评价。
31.图5是vwf裂解片段的免疫印迹，显示了在预孵育或未预孵育的情况下对裂解反应的评价。 ：预孵育；c：无血红蛋白对照；wo：未预孵育。在存在0.5mg/ml和1mg/ml血红蛋白的情况下，在预孵育或未预孵育的情况下，将vwf底物与1u/ml、0.5u/ml和0.25u/ml浓度的radamts13孵育后，观察176kda的二聚体vwf片段。
32.图6显示了在用和不用血红蛋白预孵育的情况下，adamts13介导的vwf多聚体裂解的图解评价。wo：未预孵育。
33.图7a-7c显示了在以300u/kg(图7a)、1000u/kg(图7b)和3000u/kg(图7c)shp655给药的tim townes ss小鼠中adamts13活性与时间的关系。
34.图8a-8c显示了在以300u/kg(图8a)、1000u/kg(图8b)和3000u/kg(图8c)shp655给药的tim townes ss小鼠中vwf活性/抗原比与时间的关系。
35.图9a-9c显示了在以300u/kg(图9a)、1000u/kg(图9b)和3000u/kg(图9c)shp655给药的tim townes ss小鼠中血浆血红蛋白浓度与时间的关系。
36.图10a-10b是线性图(图10a)和半对数图(图10b)，显示了shp655的平均血浆浓度对时间的曲线。图中显示的数据是具有标准差的平均值。
37.图11显示了动物在暴露于7.0％o2下五小时和在21％o2下恢复一小时后的存活曲线。
38.图12显示了在暴露于7.0％o2下五小时和在21％o2下恢复一小时后的行为分数的总结。
39.图13a-13f显示了在暴露于7.0％o2下五小时和在21％o2下恢复一小时后评分的单个行为项目，包括竖毛(图13a)、眼部外观(图13b)、呼吸(图13c)、冷漠(图13d)、自发移动(图13e)和受刺激移动(图13f)。
40.图14显示了在暴露于7.0％o2下五小时和在21％o2下恢复一小时后游离血红蛋白的血浆水平。
41.图15a-15b显示了在暴露于7.0％o2下五小时和在21％o2下恢复一小时后的adamts13活性(图15a)和抗原(图15b)水平。
42.图16a-16c显示了在暴露于7.0％o2下五小时和在21％o2下恢复一小时后vwf活性(图16a)、抗原水平(图16b)和针对抗原归一化的活性(图16c)。
43.图17a-17b显示了在暴露于7.0％o2下五小时和在21％o2下恢复一小时后获得的样品的半定量vwf多聚体分析。
44.图18a-18c显示了野生型adamts13(seq id no:1)和adamts13 q97r变体(seq id no:2)之间的序列比对。
具体实施方式
45.本发明在各个方面提供了用于预防、改善和/或治疗scd(特别是scd中的voc)的adamts13和相关方法。在详细解释本发明的任何实施方案之前，应当理解，本发明不限于其在以下描述中阐述或在附图和实施例中说明的构造和部件设置的细节的应用。此处使用的章节标题仅用于组织架构目的，不应被解释为限制所描述的主题。出于所有目的，本技术中引用的所有参考文献通过引用明确并入本文。
46.本发明包括其他实施方案并且以各种方式实践或实施。此外，应当理解，这里使用的措辞和术语是为了描述的目的，不应被视为限制。术语“包括”、“包含”或“具有”及其变体旨在涵盖其后列出的项目及其等同物以及附加项目。
47.通篇使用以下缩写。
48.aa小鼠
ꢀꢀꢀꢀꢀ
血红蛋白a(hba)纯合子的转基因小鼠
49.adamts
ꢀꢀꢀꢀꢀ
具有血小板反应蛋白的解聚素和金属蛋白酶
50.adamts13
ꢀꢀꢀ
具有血小板反应蛋白1型基序的解聚素和金属蛋白酶成员13
51.bal
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
支气管肺泡灌洗
52.dna
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
脱氧核糖核酸
53.et-1
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
内皮素1
54.echb
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
细胞外血红蛋白
55.frets u
ꢀꢀꢀꢀ
frets单位
56.gapdh
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
甘油醛3-磷酸脱氢酶
57.hb
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
血红蛋白
58.hba
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
血红蛋白a
59.hbs
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
镰状血红蛋白
60.ho-1
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
血红素加氧酶1
61.h/r
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
缺氧/复氧
62.icam-1
ꢀꢀꢀꢀꢀ
细胞间粘附分子1
63.iu
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
国际单位
64.kda
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
千道尔顿
65.ldh
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
乳酸脱氢酶
66.nf-kb
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
核因子-κb
67.p-nf-kb
ꢀꢀꢀꢀ
磷-核因子-κb
68.radamts13
ꢀꢀ
重组adamts13
69.rvwf
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
重组血管性血友病因子
70.rbc
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
红细胞
71.rna
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
核糖核酸
72.scd
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
镰状细胞病
73.ss小鼠
ꢀꢀꢀꢀ
hbs纯合子的转基因小鼠
74.txas
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
血栓素合成酶
75.ulvwf
ꢀꢀꢀꢀꢀ
超大血管性血友病因子
76.vcam-1
ꢀꢀꢀꢀ
血管细胞粘附分子-1
77.voc
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
血管闭塞危象
78.vwf
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
血管性血友病因子
79.这里要注意的是，如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非上下文另有明确规定，单数形式“一个”、“一种”和“这种”包括复数形式。关于本发明描述为种类的方面，所有单独的物种都被认为是本发明的独立特征。如果本发明的特征被描述为“包括”特征，则实施方案也可解释为“由”或“基本上由”该特征组成。
80.如本文所用，除非另有说明，否则以下术语具有赋予它们的含义。
81.如本文所用，术语“镰状细胞病(scd)”描述了一组以多种形式存在的遗传性红细胞疾病。scd的某些形式是血红蛋白ss、血红蛋白sc、血红蛋白sβ0地中海型贫血、血红蛋白sβ

地中海型贫血、血红蛋白sd和血红蛋白se。尽管血红蛋白sc疾病和血红蛋白sβ地中海型贫血是scd的两种常见形式，但本发明内容涉及并包括所有形式的scd。
82.如本文所用，术语“血管闭塞危象(voc)”是突然剧烈疼痛的发作，其可在没有警示的情况下发生。voc，也称为疼痛危象或镰状细胞危象，是青少年和成人scd常见的疼痛并发症。voc由镰状细胞、内皮细胞和血浆成分之间的相互作用引发和维持。血管闭塞导致scd的多种临床并发症，包括疼痛综合征、中风、腿部溃疡、自然流产和/或肾功能不全。
[0083]“具有血小板反应蛋白1型基序的解聚素和金属蛋白酶成员13(adamts13)”也称为血管性血友病因子裂解蛋白酶(vwfcp)。如本文所用，术语“adamts13”或“adamts13蛋白”包括adamts13类似物、变体、衍生物(包括化学修饰的衍生物)及其片段。在一些方面，与adamts13相比，其类似物、变体、衍生物和片段具有增加的生物活性。在各个方面，adamts13是重组adamts13(radamts13)或血液来源的adamts13，包括血浆和血清来源的adamts13。在本发明的各种实施方案中，adamts13可以与shp655或bax930或tak755互换使用。
[0084]
在某些实施方案中，本发明包括adamts13的变体。在某些实施方案中，adamts13变体与野生型氨基酸(例如，seq id no:1)相比包含至少一个单个氨基酸置换。在某些实施方案中，单个氨基酸置换在adamts13的催化结构域内(例如，seq id no:1的氨基酸80至286)。在某些实施方案中，单个氨基酸置换是seq id no:1所示的的i
79
m、v
88
m、h
96
d、q
97
r、r
102
c、s
119
f、i
178
t、r
193
w、t
196
i、s
203
p、l
232
q、h
234
q、d
235
h、a
250
v、s
263
c和/或r
268
p中的至少一个，或adamts13中的等效氨基酸。在某些实施方案中，单个氨基酸置换不是seq id no:1所示的i
79
m、v
88
m、h
96
d、r
102
c、s
119
f、i
178
t、r
193
w、t
196
i、s
203
p、l
232
q、h
234
q、d
235
h、a
250
v、s
263
c和/或r
268
p，或adamts13中的等效氨基酸。在某些实施方案中，adamts13变体包含在seq id no:1所示的q
97
处或在adamts13中的等效氨基酸处的单个氨基酸置换。在某些实施方案中，氨基酸变化是从q到d、e、k、h、l、n、p或r。在某些实施方案中，氨基酸变化是从q到r。在某些实施方案中，adamts13变体是adamts13 q
97
r(seq id no:2)。
[0085]
在某些实施方案中，本发明提供了包含至少一种adamts13变体的药物组合物。在某些实施方案中，药物组合物包含至少一种adamts13变体和至少一种野生型adamts13的组合。在某些实施方案中，adamts13变体与野生型adamts13的比率为约4:1至约1:4。在某些实施方案中，adamts13变体与adamts13野生型的比率为约3:1。在某些实施方案
中，adamts13变体与adamts13野生型的比率为约1:1。在某些实施方案中，adamts13变体与adamts13野生型的比率为约3:2。在某些实施方案中，adamts13变体包含在seq id no:1所示的q
97
处或在adamts13的等效氨基酸处的单个氨基酸置换。在某些实施方案中，adamts13变体是adamts13 q
97
r(seq id no:2)。在某些实施方案中，野生型adamts13是人adamts13或其生物活性衍生物或片段，如美国专利申请公开号2011/0229455中所述，其出于所有目的通过引用并入本文。在一个实施方案中，hadamts13的氨基酸序列是genbank登录号np_620594的氨基酸序列。在某些实施方案中，hadamts13是seq id no:1。
[0086]
如本文所用，“类似物”或“变体”是指与天然存在的分子(例如，seq id no:1)相比，在结构上基本相似并且具有相同的生物活性(尽管在某些情况下活性程度不同)的多肽，例如adamts13变体。与衍生类似物或变体的天然存在的多肽相比，类似物或变体的氨基酸序列组成不同，这是基于一个或多个突变，包括(i)在多肽(包括如上所述的片段)的一个或多个末端和/或天然存在的多肽序列的一个或多个内部区域的一个或多个氨基酸残基的缺失，(ii)在多肽的一个或多个末端(通常为“添加”类似物或变体)和/或天然多肽的一个或多个内部区域(通常为“插入”类似物或变体)插入或添加一个或多个氨基酸或(iii)在天然存在的多肽序列中用一个或多个氨基酸替换其他氨基酸。基于被替换的氨基酸和替换它的氨基酸的物理化学或功能相关性，替换是保守的或非保守的。“变体”包括肽序列中一个或多个氨基酸的置换、缺失、插入或修饰，条件是该变体保留天然多肽的生物活性。在一些实施方案中，“变体”包括一个或多个氨基酸被相似或同源的氨基酸或不相似的氨基酸置换。有许多层次(scale)可以将氨基酸列为相似或同源。(贡纳尔
·
冯
·
海因，分子生物学中的序列分析，第123-39页(学术出版社，纽约，1987年)。在某些方面，术语“变体”可与术语“突变体”互换使用。
[0087]“保守修饰的类似物”或“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。对于特定的核酸序列，保守修饰的核酸是指编码相同或基本相同的氨基酸序列的那些核酸，或当核酸不编码氨基酸序列时，指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子gca、gcc、gcg和gcu都编码氨基酸丙氨酸。因此，在每个由密码子编码丙氨酸的地方，密码子可以更改为上述的任何相对应的密码子而不改变所编码的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”，它们是一种保守修饰的类似物或变体。本文编码多肽的每个核酸序列还描述了该核酸的每个可能的沉默变异。本领域技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(除了aug以及tgg，aug通常是甲硫氨酸的唯一密码子，tgg通常是色氨酸的唯一密码子)可以被修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变异都隐含在每个描述的序列中。
[0088]
对于氨基酸序列，本领域技术人员将认识到对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别置换、插入、缺失、添加或截断(其改变、添加或删除编码序列中的单个氨基酸或一小部分氨基酸)是“保守修饰的类似物”，其中的改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸置换。提供功能相似氨基酸的保守置换表是本领域公知的。此类保守修饰的变体是本发明的多态性变体、种间同源物和等位基因的补充并且不排除本发明内容。
[0089]
以下八组各自含有彼此保守置换的氨基酸：1)丙氨酸(a)、甘氨酸(g)；2)天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)；
3)天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)；4)精氨酸(r)、赖氨酸(k)；5)异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、蛋氨酸(m)、缬氨酸(v)；6)苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、色氨酸(w)；7)丝氨酸(s)、苏氨酸(t)；和8)半胱氨酸(c)、甲硫氨酸(m)(参见例如克雷顿，蛋白质(1984))。
[0090]
如本文所用，“等位基因变体”是指占据相同基因座的两种或更多种多态形式基因中的任一种。等位基因变异是通过突变自然产生的，在某些方面，会导致种群内的表型多态性。在某些方面，基因突变是沉默的(编码的多肽没有变化)，或者在其他方面，编码的多肽具有改变的氨基酸序列。“等位基因变体”还指源自遗传等位基因变体的mrna转录物的cdna，以及由它们编码的蛋白质。
[0091]
术语“衍生物”是指通过与治疗剂或诊断剂缀合、标记(例如，使用放射性核素或各种酶)、共价聚合物连接例如聚乙二醇化(用聚乙二醇衍生)、以及通过非天然氨基酸的化学合成插入或置换而被共价修饰的多肽。在一些方面，衍生物被修饰以包含通常不是分子一部分的额外化学部分。在某些方面，这些衍生物被称为化学改性的衍生物。在某个方面，这部分调节分子的溶解度、吸收和/或生物半衰期。或者，在某些其他方面，这部分降低分子的毒性并消除或减弱分子的任何不需要的副作用等。能够介导此类作用的部分公开于雷明顿的药物科学(1980)。将这部分与分子偶联的方法是本领域公知的。例如，在一些方面，adamts13衍生物是具有化学修饰的adamts13分子，该化学修饰赋予蛋白质更长的体内半衰期。在一个实施方案中，多肽通过添加本领域已知的水溶性聚合物进行修饰。在相关的实施方案中，多肽通过糖基化、peg化和/或聚唾液酸化进行修饰。
[0092]
如本文所用，多肽的“片段”是指长度小于全长多肽或蛋白质表达产物的多肽的任何部分。片段通常是全长多肽的缺失类似物，其中一个或多个氨基酸残基已从全长多肽的氨基末端和/或羧基末端去除。因此，“片段”是下述缺失类似物的子集。
[0093]
当术语“重组”或“重组表达系统”用于例如细胞时，表示该细胞已通过引入异源核酸或蛋白质或改变天然核酸或蛋白质而被修饰，或者该细胞源自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达那些未在细胞的天然(非重组)形式中发现的基因，或表达为异常表达、低表达或根本不表达的天然基因。该术语还指已稳定整合重组遗传元件或在基因表达中具有调节作用的元件(例如启动子或增强子)的宿主细胞。在与待表达的内源dna片段或基因相连的调节元件被诱导后，本文定义的重组表达系统将表达细胞内源的多肽或蛋白质。细胞可以是原核的或真核的。
[0094]
术语“重组”在本文中用于指多肽或蛋白质时，是指多肽或蛋白质源自重组(例如，微生物或哺乳动物)表达系统。“微生物”是指在细菌或真菌(例如酵母)表达系统中制备的重组多肽或蛋白质。术语“重组变体”是指使用重组dna技术通过氨基酸插入、缺失和置换产生的与天然存在的多肽不同的任何多肽。通过将特定多肽的序列与同源肽的序列进行比较，并最大限度地减少在高同源性区域中氨基酸序列变化的数量，可以找到确定哪些氨基酸残基可以被替换、添加或删除而不破坏目标活性的指导。
[0095]
术语“药剂”或“化合物”描述了具有影响本发明中的生物参数的能力的任何分子，例如蛋白质或药物。
[0096]
如本文所用，“对照”可以指活性对照(active control)、阳性对照、阴性对照或溶剂对照(vehicle control)。如本领域技术人员将理解的，对照用于建立实验结果的相关性，并提供对被测试条件的比较。在某些方面，对照是未接受活性预防或治疗组合物的受试者。在某些方面，对照是未经历scd和/或voc的受试者，例如但不限于健康对照或没有任何症状的受试者。
[0097]
当提及scd的症状和/或scd中的voc时，术语“降低严重性”是指症状已延迟发作、严重性降低、频率降低或对受试者造成较少损害。通常，将症状的严重程度与对照，例如未接受活性预防或治疗组合物的受试者进行比较，或与给予治疗剂之前症状的严重程度进行比较。在那种情况下，与症状的对照水平相比，如果症状减轻约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％(即，基本消除)，则可以说组合物降低了scd症状和/或scd中voc的严重程度。在某些方面，与症状的对照水平相比，如果症状减轻约10％至约100％、约20％至约90％、约30％至约80％、约40％至约70％，或约50％至约60％，可以说组合物降低了scd症状和/或scd中voc的严重程度。在某些方面，与症状的对照水平相比，如果症状减轻约10％至约30％、约20％至约40％、约30％至约50％、约40％至约60％、约50％至约70％、约60％至约80％、约70％至约90％，或约80％至约100％，可以说组合物降低了scd症状和/或scd中voc的严重程度。在一些方面，通过本发明的方法的治疗降低了scd中voc的疼痛和/或其他症状的严重性。
[0098]
当提及scd和/或scd中voc的生物标志物(例如但不限于超大vwf多聚体，vwf活性和vwf活性/抗原比、echb vcam-1、icam-1、p-nf-kb/nf-kb比、et-1、txas、ho-1、hct、hb、mcv、hdw、网织红细胞数量和中性粒细胞数量)时，术语“降低表达”、“降低水平”和“降低活化”是指与对照相比，生物标志物的表达、水平和/或活化已经降低。在那种情况下，与对照相比，如果生物标志物降低约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％(即，基本上消除)，可以说组合物降低了scd和/或scd中voc的生物标志物的表达、水平和/或活化。在某些方面，与对照相比，如果表达、水平和/或活化降低约10％至约100％、约20％至约90％、约30％至约80％、约40％至约70％或约50％至约60％，可以说组合物降低了scd和/或scd中voc的表达、水平和/或活化。在某些方面，与对照相比，如果生物标志物降低约10％至约30％、约20％至约40％、约30％至约50％、约40％至约60％、约50％至约70％、约60％至约80％、约70％至约90％或约80％至约100％，可以说组合物降低了scd和/或scd中voc的生物标志物的表达、水平和/或活化。
[0099]
当提及scd和/或scd中voc的生物标志物时，术语“增加表达”、“增加水平”和“增加活化”是指与对照相比，生物标志物的表达、水平和/或活化已经增加。在那种情况下，与对照相比，如果生物标志物增加约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％(即，基本上消除)，可以说组合物增加了scd和/或scd中voc的生物标志物的表达、水平和/或活化。在某些方面，与对照相比，如果表达、水平和/或活化增加约10％至约100％、约20％至约90％、约30％至约80％、约40％至约70％或约50％至约60％，可以说组合物增加了scd和/或scd中voc的表达、水平和/或活化。在某些方面，与对照相比，如果生物标志物增加约10％至约30％、约20％至约40％、约30％至约50％、约40％至约60％、约50％至约70％、约60％至约80％、约70％至约90％或约80％至约100％，可以说组合物增加了scd和/或scd中voc的生物标志物的表达、水平和/或活化。
[0100]
如本文所述，术语“有效量”和“治疗有效量”指多肽(例如adamts13多肽)的量，或用于支撑adamts13多肽的一种或多种生物活性的可观察水平的组合物的量。例如，在本发明的一些方面，有效量将是治疗或预防scd中的voc症状所需的量。
[0101]“受试者”被赋予非植物、非原生生物的常规含义。在大多数方面，对象是动物。在特定方面，动物是哺乳动物。在更具体的方面，哺乳动物是人。在其他方面，哺乳动物是宠物或伴侣动物、驯养的农场动物或动物园动物。在某些方面，哺乳动物是小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猪或非人灵长类动物。在特定方面，动物是小鼠。在其他方面，哺乳动物是猫、狗、马或牛。在其他各种方面，哺乳动物是鹿、小鼠、花栗鼠、松鼠、负鼠或浣熊。
[0102]
还具体理解为，本文所述的任何数值包括从较低值到较高值的所有值，即，所列举的最低值和最高值之间的所有可能的数值组合都被认为是在本技术中明确说明的。例如，如果浓度范围规定为约1％至50％，意在在本说明书中明确列举诸如2％至40％、10％至30％或1％至3％等的值。上面列出的值只是具体用途的示例。
[0103]
在各个方面，范围在本文中表示为从“大约”或“约”一个特定值和/或到“大约”或“约”另一个特定值。当值表示为近似值时，通过使用先行词“约”，将理解为在该范围内包括一些变化量。这样的范围可以在一个数量级内，优选地在给定值或范围的50％以内，更优选地在20％以内，进一步优选地在10％以内，甚至进一步优选地在5％以内。术语“大约”或“约”所包含的允许的变化取决于所研究的特定体系，并且本领域普通技术人员可以容易地理解。镰状细胞病和镰状细胞病中的血管闭塞
[0104]
在一些方面，本发明内容包括adamts13和包含adamts13的组合物，用于治疗、改善和/或预防scd，尤其是scd中的voc。scd是一种世界性遗传性红细胞疾病，由β-珠蛋白基因的点突变导致的病理性hbs合成以及缺氧条件下hbs异常聚合引起。scd的两个主要临床表现是慢性溶血性贫血和急性voc，是scd患者住院的主要原因。最近的研究强调了镰状血管病变在镰状细胞相关急性事件和慢性器官并发症的产生中的核心作用(sparkenbaugh等，br.j.haematol.162:3-14，2013；de法国schi等，semin.thromb.hemost.226-36，2011；和hebbel等，cardiovasc.hematol.disord.drug targets，9:271-92，2009；dutra等，proc natl acad sci美国；111(39)：e4110-e4118；每个都通过引用整体并入本文)。这些并发症的病理生理学的根据是引发voc的毛细血管和小血管的血管内镰状化、血流受损、血管炎症和/或血栓形成伴缺血性细胞损伤。
[0105]
scd最常见的临床表现是voc。当镰状红细胞阻塞微循环时会发生voc，导致供血器官缺血性损伤并导致疼痛。疼痛危象构成了scd最显著的临床特征，并且是感染scd受试者或患者急诊和/或住院的主要原因。
[0106]
大约一半的scd受试者或患有纯合子hbs疾病的患者会经历voc。危象发生的频率非常多变。一些scd受试者或患者每年有多达6次或更多次的发作，而其他人可能仅在很长的时间间隔内发作或根本没有发作。每个受试者或患者通常具有一致的危象频率模式。
[0107]
本发明包括用于减少voc的至少一种症状的方法，症状包括但不限于与voc相关的局部缺血和疼痛(例如，指趾炎、阴茎异常勃起、腹部、胸部和关节)、黄疸、骨梗塞、呼吸异常(例如，气急和呼吸浅短)、缺氧、酸中毒、低血压和/或心动过速。在某些方面，voc可定义为包括一种或多种这些症状的病症。疼痛危象突然开始。危象可能会持续数小时到数天，并会
像开始时一样突然结束。疼痛可影响身体的任何部位，常涉及腹部、附肢、胸部、背部、骨骼、关节和软组织，并可表现为指趾炎(儿童双侧疼痛和手和/或脚肿胀)、急性关节坏死或缺血性坏死，或急腹症。伴随脾脏中的反复发作，梗塞和自体脾切除术容易导致危及生命的感染是常见的。随着时间的推移，肝脏也可能发生梗塞并发展为衰竭。乳头状坏死是voc的常见肾脏表现，导致等渗尿(即无法浓缩尿液)。
[0108]
四肢存在严重的深痛，涉及长骨。腹痛可能很严重，类似于急腹症；它可能由其他部位的牵涉痛或腹腔内实体器官或软组织梗塞引起。反应性肠梗阻会导致肠胀气和疼痛。面部也可能受到影响。疼痛可能伴有发烧、不适、呼吸困难、勃起疼痛、黄疸和白细胞增多。骨痛通常是由骨髓梗塞引起的。有一些模式是可以预测的，因为疼痛往往涉及骨髓活动最多的骨骼，而且骨髓活动会随着年龄的增长而变化。在生命的前18个月内，跖骨和掌骨可能受累，表现为指趾炎或手足综合征。尽管上述模式描述了常见的表现，但受试者身体的任何具有血液供应和感觉神经的区域都可能受到voc的影响。
[0109]
通常，无法确定导致voc的诱因。然而，由于脱氧hbs变成半固体，voc最可能的生理触发因素是低氧血症。这可能是由于急性胸部综合征或伴随呼吸系统并发症。脱水也会引起疼痛，因为酸中毒会导致氧解离曲线的移动(玻尔效应)，导致血红蛋白更容易去饱和。血液浓缩也是一种常见机制。voc的另一个常见触发因素是体温的变化，无论是由于发烧引起的升高还是由于环境温度变化引起的降低。由于外周血管收缩，体温降低可能导致危象。
[0110]
在某些实施方案中，voc可定义为与对照相比外周嗜中性粒细胞增加。在某些实施方案中，voc可定义为与对照相比肺血管渗漏增加(例如，支气管肺泡灌洗(bal)中的白细胞数量和/或蛋白质含量(bal蛋白质(mg/ml)增加)。
[0111]
在某些实施方案中，与对照相比，器官中血管活化水平的增加(例如，通过增加的vcam-1和/或icam-1的表达、水平和/或活性来测量)是voc的标志物。在某些实施方案中，与对照相比，器官中炎症性血管病变水平的增加(例如，通过增加的vcam-1和/或icam-1的表达、水平和/或活性来测量)是voc的标志物。在某些实施方案中，与对照相比，组织中增加的血管活化和炎性血管病变水平是voc的标志物。在某些实施方案中，器官是肺和/或肾。在某些实施方案中，器官是肾。
[0112]
在某些实施方案中，voc可以定义为与对照相比，nf-kb、vcam-1和icam-1中的至少一种的表达、水平和/或活化增加(其中nf-kb的活化通过p-nf-kb或p-nf-kb/nf-kb的比率来衡量)。在某些实施方案中，voc可定义为与对照相比，内皮素-1(et-1)、血栓素合成酶(txas)和血红素-加氧酶-1(ho-1)中的至少一种的表达或水平增加。在某些实施方案中，这些增加在肺组织中观察到。在某些实施方案中，这些增加在肾组织中观察到。在某些实施方案中，肾组织中txas、et-1和vcam-1的表达和/或水平增加以及nf-kb的活化是voc的标志物。
[0113]
在某些实施方案中，voc可以由血液学参数定义。在某些实施方案中，voc可以定义为与对照相比，hct、hb、mcv和mch中的至少一种水平的降低。在某些实施方案中，voc可定义为与对照相比，hct、hb、mcv和mch中的至少两种水平的降低。在某些实施方案中，voc可以定义为与对照相比，hct、hb、mcv和mch中的至少三种水平的降低。在某些实施方案中，voc可定义为与对照相比，chcm、hdw、嗜中性粒细胞数和ldh中的至少一种水平的增加。在某些实施方案中，voc可以定义为与对照相比，chcm、hdw、中性粒细胞数和ldh中的至少两种水平的增
加。在某些实施方案中，voc可以定义为与对照相比，chcm、hdw、中性粒细胞数和ldh中的至少三种水平的增加。在某些实施方案中，voc可以定义为与对照相比，hct水平的降低。在某些实施方案中，voc可以定义为与对照相比，hb水平的降低。在某些实施方案中，voc可以定义为与对照相比，mcv的降低。在某些实施方案中，voc可以定义为与对照相比，mch的降低。在某些实施方案中，voc可以定义为与对照相比，chcm的增加。在某些实施方案中，voc可以定义为与对照相比，hdw的增加。在某些实施方案中，voc可以定义为与对照相比，嗜中性粒细胞数的增加。在某些实施方案中，voc可以定义为与对照相比，ldh的增加。在某些实施方案中，voc可以定义为与对照相比，hct、hb、mcv和mch中的至少一种水平的降低，和/或与对照相比，chcm、hdw、中性粒细胞数和ldh中的至少一种水平的增加。在某些实施方案中，voc可定义为与对照相比，hct、hb、mcv和mch水平降低，和/或与对照相比，chcm、hdw、中性粒细胞数和ldh水平增加。scd模型和测试预防或治疗有效性的方法
[0114]
在一些实施方案中，本发明内容包括研究重组adamts13(即bax930/shp655/tak755)在scd小鼠模型(tim townes小鼠)的急性scd相关事件期间的作用，急性scd相关事件通过将scd小鼠暴露于缺氧来模拟。研究是在常氧和缺氧条件下进行的，其中研究了预防或治疗剂量在小鼠模型中的功效(包括测量总生存期)和用bax930/shp655/tak755治疗在血液指标上的生物学效应。在将镰状细胞病小鼠暴露于缺氧后，研究了肺和肾损伤以及血管炎症。
[0115]
公开了人源化的tim townes ss小鼠是合适的scd小鼠模型。它是一种转基因小鼠模型，敲除鼠血红蛋白基因和敲入人血红蛋白s基因(hbs，称为scd小鼠或ss小鼠)(ryan等，science；278(5339)：873-6，1997；nguyen等，blood，124(21)：4916，2014)。用高剂量(2940u/kg)的adamts13对tim townes ss小鼠进行单次静脉注射治疗显著降低了血管闭塞事件的严重程度，与对照动物相比，这些小鼠在缺氧条件下能够存活(参见国际公开文本wo/2018/027169的实施例7，其全部内容通过引用并入本文)。
[0116]
在一些实施方案中，使用scd的转基因小鼠模型(kalish等，haematologica100:870-80，2015)。在一些方面，健康对照(hba
tm1(hba)tow
hbb
tm3(hbg1,hbb)tow
)和scd(hba
tm1(hba)tow
hbb
tm2(hbg1,hbb*)tow
)小鼠暴露于缺氧/复氧(h/r)应激(stress)下(kalish等人，见下文)。这种h/r应激已被证明可以在生物学上重现在人类scd患者的急性voc中观察到的急性voc和器官损伤。在一些方面，健康(aa)和scd(ss)小鼠经历缺氧(例如，约5.5或7％氧气)持续一些时间段(例如，约5小时)，随后复氧(例如，约21％的氧气，室内空气条件)一些时间段(例如，1小时)。
[0117]
在各个方面，scd模型和对照组经受常氧或缺氧条件。在常氧实验中，健康对照(aa)和scd(ss)小鼠接受固定体积(例如10ml/kg)的radamts13(例如3,000iu/kg)或缓冲液(溶剂(vehicle))的单次静脉内给药，并处于常氧(例如，约21％的氧气，室内空气条件)条件下。在用adamts13或溶剂处理并暴露于常氧或缺氧后，对动物进行不同时间段的研究。收集血液并测量全血细胞计数(cbc)。cbc是一种血液测试，用于评估整体健康状况并检测各种疾病，其中包括贫血症。测量各种其他反应终点，包括但不限于血液学、凝血参数、炎症生物标志物、血管病变和组织病理学。
[0118]
在示例性方面，进行缺氧实验，其中健康对照(aa)和scd(ss)小鼠接受固定体积
(例如，10ml/kg)的adamts13(例如，300iu/kg、1,000iu/kg或3,000iu/kg)或溶剂的单次静脉内施用。在某些实施方案中，施用于人类受试者的剂量是施用于啮齿动物(例如，小鼠)受试者的约10％。在某些实施方案中，施用于人类受试者的剂量是施用于啮齿动物(例如，小鼠)受试者的约9％。在某些实施方案中，施用于人类受试者的剂量是施用于啮齿动物(例如，小鼠)受试者的约8％。在某些实施方案中，施用于人类受试者的剂量是施用于啮齿动物(例如，小鼠)受试者的约7％。在某些实施方案中，施用于人类受试者的剂量小于施用于啮齿动物(例如小鼠)受试者的剂量的约10％，例如约7％至约10％。
[0119]
注射后(例如，注射后约1-3小时)，将小鼠暴露于缺氧(例如，约7％的氧气)一段时间(例如，约5小时)，然后复氧一段时间(例如，大约1小时)以模拟scd相关的voc事件。在某些方面，评估与常氧研究详述的相同参数。
[0120]
在另外的示例性方面，进行缺氧实验，其中健康对照(aa)和scd(ss)小鼠暴露于缺氧(例如，约8％或更高浓度的氧)一段时间(例如，约10小时)，然后复氧一段时间(例如，约3小时)以模拟scd相关的voc事件。然后，在此后的不同时间点，包括但不限于，在实验诱导的血管闭塞事件(vaso-inclusive event)之后即刻或大约1、3、6、12、24、36、48或72小时，小鼠接受固定体积(例如，10ml/kg)的adamts13(例如，300iu/kg、1,000iu/kg或3,000iu/kg)或溶剂的单次静脉内给药，或以12或24间隔多次注射。在某些方面，评估与常氧研究详述的相同参数。
[0121]
在各个方面，在体外或体内模型中和/或在voc条件下检验任何靶组织用adamts13治疗的有效性。在一些方面，器官组织包括但不限于肺、肝脏、胰腺、皮肤、视网膜、前列腺、卵巢、淋巴结、肾上腺、肾脏、心脏、胆囊或胃肠道。在一些方面，器官组织包括但不限于肺、肝、脾和/或肾。
[0122]
例如，在一些方面，收集靶组织以检验adamts13在常氧或缺氧条件下的作用。组织在福尔马林中冷冻和/或固定。冷冻组织用于使用针对核因子-κb(nf-kb)、内皮素-1(et-1)、血红素加氧酶1(ho-1)、细胞间粘附分子-1(icam-1)、血栓素合成酶(txas)和血管细胞粘附分子-1(vcam-1)的特异性抗体进行免疫印迹分析。固定器官用于常规病理学(h&e染色)。
[0123]
可以测量血管收缩、血小板聚集、炎症、氧化应激、抗氧化反应和/或组织损伤的标志物以确定治疗的有效性。在一些方面，测量核因子κb的正常(nf-kb)和活化(p-nf-kb)两种形式。nf-kb是一种转录因子，与协调炎症和抗氧化反应相关。评估活化形式和正常形式之间的比率。在一些方面，对et-1进行测量。et-1是一种有效的血管收缩剂，由血管内皮细胞产生。et-1在多种病理生理过程中发挥作用，包括心血管肥大、肺动脉高压和慢性肾功能衰竭。在一些方面，对ho-1进行测量。ho-1是血红素分解代谢中的诱导型限速酶，可减轻血管闭塞危象和溶血危象的严重程度，充当血管保护性抗氧化剂。在一些方面，对icam-1进行测量。icam-1以低浓度持续存在于白细胞和内皮细胞的细胞膜中。尽管icam-1似乎不参与镰状细胞与血管内皮的粘附，但icam-1可能会通过促进白细胞粘附而加剧voc。在一些方面，对txas进行测量。txas是一种内质网膜蛋白，其催化前列腺素h2转化为血栓素a2。txas是一种有效的血管收缩剂和血小板聚集诱导剂。因此，txas是血管收缩和血小板聚集的有效诱导剂。txas在多种病理生理过程中发挥作用，包括止血、心血管疾病和中风。在一些方面，对vcam-1进行测量。vcam-1介导淋巴细胞和其他血细胞与血管内皮的粘附，因此可能导
致血管闭塞事件。在一些方面，在器官组织中测量炎性细胞浸润。
[0124]
在示例性方面，使用针对nf-kb、et-1、ho-1、icam-1、txas和vcam-1的特异性抗体进行免疫印迹分析，以测量这些酶在本发明的模型或受试者的细胞和组织中的表达，以确定治疗的有效性。在示例性方面，nf-kb、et-1、ho-1、icam-1、txas和/或vcam-1的表达是在来自用溶剂或adamts13治疗的aa和scd小鼠的器官组织中测量。在某些实施方案中，器官包括但不限于肺、肝、胰腺、皮肤、视网膜、前列腺、卵巢、淋巴结、肾上腺、肾、心脏、胆囊或胃肠道。在某些实施方案中，器官是肺、肝、脾和/或肾。
[0125]
在某些实施方案中，与对照相比，adamts13的施用导致器官中血管活化和/或炎性血管病变水平降低。在某些实施方案中，器官是肺。在某些实施方案中，器官是肾。
[0126]
在某些实施方案中，与对照相比，adamts13的施用导致vcam-1、icam-1、nf-kb(其中通过p-nf-kb或p-nf-kb/nf-kb的比率测量nf-kb活化的降低)、et-1、txas和ho-1中至少一种的表达、水平和/或活化降低。在某些实施方案中，与对照相比，adamts13的施用导致vcam-1、icam-1、nf-kb、et-1、txas和ho-1中至少两种的表达、水平和/或活化降低。在某些实施方案中，与对照相比，adamts13的施用导致vcam-1、icam-1、nf-kb、et-1、txas和ho-1中至少三种的表达、水平和/或活化降低。在某些实施方案中，与对照相比，adamts13的施用导致vcam-1、icam-1、nf-kb、et-1、txas和ho-1中至少四种的表达、水平和/或活化降低。在某些实施方案中，与对照相比，adamts13的施用导致vcam-1、icam-1、nf-kb、et-1、txas和ho-1中至少五种的表达、水平和/或活化降低。在某些实施方案中，与对照相比，adamts13的施用导致vcam-1、icam-1、nf-kb、et-1、txas和ho-1的表达、水平和/或活化降低。在某些实施方案中，与对照相比，adamts13的施用导致vcam-1的表达、水平和/或活化降低。在某些实施方案中，与对照相比，adamts13的施用导致icam-1的表达、水平和/或活化降低。在某些实施方案中，与对照相比，adamts13的施用导致vcam-1和icam-1的表达、水平和/或活化降低。在某些实施方案中，与对照相比，adamts13的施用导致et-1的表达和/或水平降低。在某些实施方案中，与对照相比，adamts13的施用导致txas的表达和/或水平降低。在某些实施方案中，与对照相比，adamts13的施用导致ho-1的表达和/或水平降低。在某些实施方案中，与对照相比，adamts13的施用导致p-nf-kb/nf-kb的比率降低。在某些实施方案中，与对照相比，adamts13的施用导致p-nf-kb/nf-kb比率、et-1表达和/或水平、txas表达和/或水平、ho-1表达和/或水平中的至少一项降低。在某些实施方案中，与对照相比，adamts13的施用导致p-nf-kb/nf-kb比率、et-1表达和/或水平、txas表达和/或水平，以及ho-1表达和/或水平降低。在某些实施方案中，器官是肺。在某些实施方案中，器官是肾。
[0127]
在进一步的示例性方面，这些标志物的测量在动物模型经受如本文所述的缺氧和复氧(h/r)条件之后进行。在进一步的示例性方面，这些标志物的测量在受试者经历voc之后进行。
[0128]
在一些实施方案中，测量血流量作为治疗有效性的指标。在一些实施方案中，血流可通过但不限于超声、pet、fmri、nmr、激光多普勒、电磁血流计或可穿戴设备来测量。
[0129]
在一些实施方案中，血栓形成的减少或预防是治疗有效性的量度。在一些实施方案中，血栓形成的存在通过但不限于组织病理学检查、超声、d-二聚体测验、静脉造影、mri或ct/cat扫描来测量。在一些方面，血栓形成是在器官组织中确定的。
[0130]
在一些实施方案中，肺血管渗漏(即，肺渗漏和损伤)的减少或预防是治疗有效性
的量度。在一些实施方案中，支气管肺泡灌洗(bal)测量值或参数(总蛋白和白细胞含量)被衡量为肺血管渗漏的标志物(以确定肺损伤的程度和治疗(例如，用adamts13治疗)的有效性)。肺漏可导致bal中蛋白质和/或白细胞含量增加。收集bal流体，通过离心回收细胞内容物，并通过微细胞计数法进行计数，如先前报道的(kalish等，haematologica 100：870-80，2015，通过引用以其全文并入本文并用于所有目的)。在一些实施方案中，外周嗜中性粒细胞增加的减少或预防是治疗有效性的量度。嗜中性粒细胞的百分比通过细胞离心法测定，上清液用于测定总蛋白质含量(kalish等，同上)。
[0131]
在一些实施方案中，测量肺功能的改善作为治疗有效性的指标。肺功能可通过但不限于峰流测试、肺活量测定和可逆性测试、肺容量测试、气体转移测试、呼吸肌测试、一氧化碳呼出测试(exhaled carbon monoside test)或一氧化氮呼出测试来测量。
[0132]
在一些实施方案中，测量血液学参数以确定治疗(例如，用adamts13治疗)的有效性。测定以下血液学参数：乳酸脱氢酶(ldh)作为细胞损伤的常规标志物；血比容(hct)和平均红细胞体积(mcv)作为红细胞活力的衡量标准；血红蛋白(hb)、平均红细胞血红蛋白(mch)和细胞血红蛋白浓度(chcm)作为氧结合能力的指标；红细胞分布的异质性(hdw)作为是否存在致密红细胞的指标；网状红血球计数作为贫血状态的指标；嗜中性粒细胞计数作为全身炎症状态的指标。
[0133]
在某些实施方案中，与对照相比，adamts13的施用改善了血液中hct、hb、mcv和mch中至少一种的水平的降低。在某些实施方案中，与对照相比，adamts13的施用改善了血液中hct、hb、mcv和mch中至少两种水平的降低。在某些实施方案中，与对照相比，adamts13的施用改善了血液中hct、hb、mcv和mch中至少三种水平的降低。在某些实施方案中，与对照相比，adamts13的施用改善了血液中hct、hb、mcv和mch水平的降低。在某些实施方案中，与对照相比，adamts13的施用改善了chcm、hdw、ldh和嗜中性粒细胞数量中至少一种的增加。在某些实施方案中，与对照相比，adamts13的施用改善了chcm、hdw、ldh和嗜中性粒细胞数量中至少两种的增加。在某些实施方案中，与对照相比，adamts13的施用改善了chcm、hdw、ldh和嗜中性粒细胞数量中至少三种的增加。在某些实施方案中，与对照相比，adamts13的施用改善了chcm、hdw、ldh和嗜中性粒细胞数量的增加。在某些实施方案中，与对照相比，adamts13改善了hct、hb、mcv和mch水平的降低并改善了chcm、hdw、ldh和嗜中性粒细胞水平的增加。
[0134]
在某些实施方案中，与对照相比，adamts13的施用导致血液中hct、hb、mcv和mch中至少一种的水平增加。在某些实施方案中，与对照相比，adamts13的施用导致血液中hct、hb、mcv和mch中至少两种的水平增加。在某些实施方案中，与对照相比，adamts13的施用导致血液中hct、hb、mcv和mch中至少三种的水平增加。在某些实施方案中，与对照相比，adamts13的施用导致血液中hct、hb、mcv和mch的水平增加。在某些实施方案中，与对照相比，adamts13的施用导致chcm、hdw、ldh和嗜中性粒细胞数量中至少一种的降低。在某些实施方案中，与对照相比，adamts13的施用导致chcm、hdw、ldh和嗜中性粒细胞数量中至少两种的降低。在某些实施方案中，与对照相比，adamts13的施用导致chcm、hdw、ldh和嗜中性粒细胞数量中至少三种的降低。在某些实施方案中，与对照相比，adamts13的施用导致chcm、hdw、ldh和嗜中性粒细胞数量的降低。在某些实施方案中，与对照相比，adamts13导致hct、hb、mcv和mch水平的增加以及chcm、hdw、ldh和嗜中性粒细胞水平的降低。
[0135]
在一些实施方案中，使用了测量vwf和超大vwf多聚体水平的方法。在scd患者中，已观察到vwf和超大vwf多聚体水平升高，并且与急性血管闭塞事件有关。循环vwf(circulating vwf)多聚体水平的增加取决于adamts13的活性，adamts13在高流体剪切应力条件下裂解超大vwf，在维持止血活性和血栓形成风险的适当平衡方面发挥重要作用。更具体地说，adamts13在氨基酸残基tyr
1605
和met
1606
之间裂解vwf，对应于前序列(preprosequence)裂解后的氨基酸残基842-843。正是这种adamts13介导的裂解主要负责vwf多聚体大小，其与主要止血活性相关。测量vwf和超大vwf多聚体的方法，包括使用针对vwf的特异性抗体的各种类型的免疫印迹分析，用于测量vwf的表达或水平。此外，测量vwf的其他已知方法包括在本发明的各个方面中。
[0136]
在某些实施方案中，adamts13的施用导致超大vwf多聚体、vwf活性和vwf活性/抗原比中的至少一种的水平降低。vwf活性/抗原比是血浆中vwf活性与vwf抗原的比值。vwf活性可以通过本领域已知的各种方法测量，例如但不限于用于测量vwf的胶原结合活性的vwf瑞斯托菌素辅因子活性测定和酶免疫测定。vwf抗原水平可以使用免疫吸附测定法进行测量，包括市售的elisa测试(例如vwf:ag)。在某些实施方案中，adamts13的施用不改变血浆中vwf抗原的水平。
[0137]
在某些实施方案中，adamts13的施用导致adamts13介导的vwf裂解增加。由于血浆中细胞外血红蛋白(echb)水平升高，adamts13介导的vwf裂解scd患者可被抑制。scd患者的细胞外血红蛋白在血浆中的浓度可能为20-330μg/ml，而在voc期间则》400μg/ml。在一些实施方案中，adamts13的施用导致scd患者中adamts13介导的vwf裂解增加至少约20％。在一些实施方案中，adamts13的施用导致scd患者中adamts13介导的vwf裂解增加至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％。在一些实施方案中，adamts13的施用导致scd患者中adamts13介导的vwf裂解增加约20％至70％。在一些实施方案中，adamts13的施用导致scd患者中adamts13介导的vwf裂解增加约80％至100％。
[0138]
在某些实施方案中，adamts13的施用导致血浆中游离血红蛋白水平的降低。游离血红蛋白可以使用市售的elisa测定法进行测量。
[0139]
在一些方面，有效性通过与对照或基线测量值相比器官损伤的减少来测量。在一些实施方案中，器官损伤通过放射成像测量，例如但不限于ct/cat扫描、超声、x射线、mri和核医学。在一些实施方案中，器官损伤通过各种生物标志物的变化来测量，所述生物标志物包括但不限于血尿素氮(bun)、肌酐、bun/肌酐比、肌钙蛋白、神经元特异性烯醇化酶(nse)。在一些实施方案中，组织变化通过组织病理学检查来测量。
[0140]
本领域的普通技术人员能够选择与待测量的器官(如上定义)和/或体液相关的本文公开的任何生物标志物的适当测量。体液包括但不限于血液(包括血浆和血清)、淋巴液、脑脊液、哺乳产品(例如牛奶)、羊水、尿液、唾液、汗液、眼泪、月经、粪便，包括它们的一部分。
[0141]
在一些方面，有效性是通过评估受试者的生活质量来测量的(例如，使用treadwell等人(treadwell等，clin.j.pain 30(10)：902-915(2016))报告的成人镰状细胞生活质量测量信息系统(ascq-me))。ascq-me围绕七个主题：情绪影响(与情绪困扰相关的五个问题调查(例如，绝望、孤独、抑郁和担心)；疼痛发作频率和严重程度(发作次数、自上
次发作以来的时间；最后一次发作时疼痛的严重程度，等级为1-10)；发作持续多久的时间，发作对你生活有多大的影响)；疼痛影响(询问频率和严重程度以及它如何影响活动)；镰状细胞病病史清单；睡眠影响(入睡容易程度，无法入睡的频率)；社会功能影响(对他人的依赖，健康如何影响活动)；和僵硬影响(僵硬的关节导致的失眠、白天活动、清醒时的活动)。
[0142]
在各个方面，预防和/或治疗的有效性通过测量疼痛严重程度(例如，通过疼痛评定量表测量)、疼痛缓解、对药物的感知需求、治疗满意度、voc发生的频率、voc发作的持续时间、住院时长和/或持续时间、与住院相关的费用和/或需要止痛药的持续时间(例如，静脉注射阿片类药物)。
[0143]
在某些方面，使用麦吉尔疼痛问卷(melzack等，pain，1975年9月；1(3):277-99)测量疼痛严重程度，其中受试者选择一个或多个最能描述其痛苦的词。在某些方面，使用视觉模拟评价表(vas)测量疼痛严重程度。vas是一条10厘米的非阴影线，一端固定为“无痛”，另一端为“可能的最严重的疼痛”。指导患者在线上标记两个锚点之间的疼痛程度。vas分数的计算方法是测量“无痛”锚点与患者标记之间的距离(以厘米为单位)，该标记表示其疼痛程度，导致疼痛严重程度分数范围为0毫米到10厘米。在某些方面，使用数字评定量表(nrs)测量疼痛严重程度。nrs是一个11分制的量表，以“无痛”和“可能的最严重的疼痛”为锚点(anchored)。指示患者以0到10的等级报告他们当前的疼痛程度，其中0表示没有疼痛，10表示可能最严重的疼痛。
[0144]
在某些方面，疼痛缓解可以测量为患者的疼痛自上次评估以来可能如何变化(即当前评估减去先前评估)的整体评估，上次评估用于锚定在nrs和vas量表上可见的变化。患者在回答以下问题时报告疼痛减轻：“与您上次标记疼痛时相比，请告诉我们您的疼痛发生了多少变化。”患者可能会回答他们的疼痛“糟多了”、“糟一点”、“相同”、“好一点”或“好多了”。
[0145]
在某些方面，对药物的需求可以由患者或医疗保健工作者报告。
[0146]
在某些方面，治疗满意度可以是患者报告的。报告的等级可以从“完全没有”、“有点满意(高兴)”、“非常满意(高兴)”或“不知道”。
[0147]
在某些方面，小鼠模型中voc的预防和/或治疗的有效性使用通过行为观察的读数来确定。例如，可以筛选一种或多种行为症状。在一些实施方案中，一种或多种行为症状选自竖毛、冷漠、眼部外观、肤色、自发移动、受刺激移动和呼吸频率。在一些实施方案中，一种或多种行为症状选自竖毛、冷漠、眼部外观、受刺激移动和呼吸频率。其他行为症状可能包括在mittal等，blood cells mol dis.57:58-66，2016中描述的那些，其全部内容以引用方式并入本文。可以基于行为症状的严重性生成行为分数。作为非限制性示例，行为分数可以根据shirpa指南(rogers等，mamm genome.8(10):711-3，1997，其全部内容以引用方式并入本文中)中描述的分级量表生成。在示例性实施方案中，对行为症状进行评分，从而将更高的数字分配给更严重的症状。可以将行为分数与对照分数进行比较以评估预防和/或治疗的有效性。在一些实施方案中，对照分数是从未接受预防和/或治疗的对照受试者产生的。如果行为分数表明与对照分数相比严重程度更低，则可以确定预防和/或治疗有效；或者如果行为分数表明与对照分数相比严重程度更高或者相同，则可以确定预防和/或治疗无效。
[0148]
在某些方面，受试者从血管闭塞危象(voc)中的恢复可以使用通过行为观察的读出来确定。例如，可以从voc后的受试者收集选自竖毛、冷漠、眼部外观、肤色、自发移动、受
刺激移动和呼吸频率的一种或多种行为症状。可基于从受试者收集的一种或多种行为症状的严重性产生分数。可以将该分数与对照分数进行比较。对照分数可以由预定的标准、或健康的年龄和性别匹配的受试者、或若干这样的受试者的平均值产生。对照分数可以由voc前的受试者或由没有voc的对照受试者产生。如果与对照分数相比，受试者的分数表明更轻或相同的严重程度，则可以确定受试者已从voc中恢复；或者，如果与对照分数相比，受试者的分数表明更重的严重程度，则可以确定受试者尚未恢复。adamts13
[0149]
在一些方面，本发明内容包括adamts13(也称为“a13”)和包含adamts13的组合物用于scd的治疗和预防。在特定方面，本发明内容包括adamts13和包含adamts13的组合物用于治疗和预防scd中的voc。adamts13蛋白酶是大约180kda至200kda的糖基化蛋白质，主要由肝脏产生。adamts13是一种血浆金属蛋白酶，可裂解vwf多聚体并下调其在血小板聚集中的活性。迄今为止，adamts13与凝血障碍有关，例如遗传性血栓性血小板减少性紫癜(ttp)、获得性ttp、脑梗塞、心肌梗塞、缺血/再灌注损伤、深静脉血栓形成和弥散性血管内凝血(dic)，例如败血症相关的dic。
[0150]
本领域已知的所有形式的adamts13都预期用于本发明的方法和用途。成熟的adamts13的计算分子量约为145kda，而纯化的血浆来源的adamts13的表观分子量约为180kda至200kda，这可能是由于翻译后修饰由tsp1重复序列中10个潜在n-糖基化位点、几个o-糖基化位点和一个c-甘露糖基化位点的存在共有序列组成。
[0151]
如本文所用，“adamts13”是指adamts(具有血小板反应蛋白1型基序的解聚素和金属蛋白酶)家族的金属蛋白酶，其在残基tyr
1605
和met
1606
之间的a2结构域中裂解vwf。在本发明的上下文中，“adamts13”、“a13”或“adamts13蛋白”包括任何adamts13蛋白，例如，来自哺乳动物的adamts13，哺乳动物例如灵长类、人(np620594)、猴、兔、猪、牛(xp610784)、啮齿动物、小鼠(np001001322)、大鼠(xp342396)、仓鼠、沙鼠、犬、猫、青蛙(np001083331)、鸡(xp415435)及其具有生物活性的衍生物。如本文所用，“adamts13”、“a13”或“adamts13蛋白”是指重组、天然或血浆来源的adamts13蛋白。还包括具有活性的突变和变体adamts13蛋白，以及adamts13蛋白的功能片段和融合蛋白。在一些方面，adamts13蛋白进一步包含促进纯化、检测或两者的标签。在一些方面，本发明内容的adamts13蛋白用额外的治疗部分或适合体外或体内成像的部分进一步修饰。
[0152]
adamts13蛋白包括具有adamts13活性，特别是裂解vwf的残基tyr-842和met-843之间的肽键的能力的任何蛋白或多肽。人adamts13蛋白包括但不限于包含genbank登录号np620594(nm139025.3)的氨基酸序列的多肽或其加工的多肽，例如其中信号肽(氨基酸1至29)和/或前肽(氨基酸30-74)已被去除的多肽。在某些方面，adamts13蛋白是指包含与np 620596(adamts13异构体2，前蛋白原)的氨基酸序列或p_620594(adamts13异构体2，成熟多肽)的氨基酸第75至1371位高度相似的氨基酸序列的多肽。在又一个实施方案中，adamts13蛋白包括包含与np620595(adamts13异构体3，前蛋白原)的氨基酸序列或np_620595(adamts13异构体1，成熟多肽)的氨基酸第75至1340位高度相似的氨基酸序列的多肽。在某些方面，adamts13蛋白包括具有vwf裂解活性的天然变体和具有vwf裂解活性的人工构建体。在某些方面，adamts13包括保留一些基础活性的任何天然变体、替代序列、异构体或突变蛋白。人adamts13的许多天然变体是本领域已知的，并且包含在本发明的制剂中，其中一
些包括选自以下的突变：r7w、v88m、h96d、r102c、r193w、t196i、h234q、a250v、r268p、w390c、r398h、q448e、q456h、p457l、p475s、c508y、r528g、p618a、r625h、1673f、r692c、a732v、e740k、a900v、s903l、c908y、c951g、g982r、c1024g、a1033t、r1095w、r1095w、r1123c、c1213y、t12261、g1239v和r1336w。此外，adamts13蛋白质包括已发生突变的天然和重组蛋白质，例如，通过非必需氨基酸的一个或多个保守突变。优选地，adamts13的酶活性所必需的氨基酸不会发生突变。这些包括例如已知或推测对金属结合必不可少的残基，例如残基83、173、224、228、234、281和284，以及在酶的活性位点中发现的残基，例如残基225。类似地，在本发明的上下文中，adamts13蛋白质包括替代的异构体，例如，缺少全长人蛋白质的氨基酸275至305和/或1135至1190的异构体。
[0153]
在某些实施方案中，本发明包括adamts13的变体。在某些实施方案中，adamts13变体与野生型氨基酸(例如，seq id no:1)相比包含至少一个单个氨基酸置换。在某些实施方案中，单个氨基酸置换在adamts13的催化结构域内(例如，seq id no:1的氨基酸80至286)。在某些实施方案中，单个氨基酸置换是seq id no:1所示的i
79
m、v
88
m、h
96
d、q
97
r、r
102
c、s
119
f、i
178
t、r
193
w、t
196
i、s
203
p、l
232
q、h
234
q、d
235
h、a
250
v、s
263
c和/或r
268
p中的至少一个，或adamts13中的等效氨基酸。在某些实施方案中，单个氨基酸置换不是seq id no:1所示的i
79
m、v
88
m、h
96
d、r
102
c、s
119
f、i
178
t、r
193
w、t
196
i、s
203
p、l
232
q、h
234
q、d
235
h、a
250
v、s
263
c和/或r
268
p，或adamts13中的等效氨基酸。在某些实施方案中，adamts13变体包含在seq id no:1所示的q
97
处或在adamts13中的等效氨基酸处的单个氨基酸置换。在某些实施方案中，氨基酸变化是从q到d、e、k、h、l、n、p或r。在某些实施方案中，氨基酸变化是从q到r。在某些实施方案中，adamts13变体是adamts13q
97
r(seq id no:2)。
[0154]
在一些方面，adamts13蛋白被进一步修饰，例如通过翻译后修饰(例如，在选自人类残基142、146、552、579、614、667、707、828、1235、1354或任何其他天然或基因工程修饰位点的一个或多个氨基酸处的糖基化)或通过离体化学或酶促修饰，包括但不限于糖基化、水溶性聚合物修饰(例如聚乙二醇化、唾液酸化、hesylation等)、标记等。
[0155]
在一些方面，adamts13蛋白是人adamts13或其生物活性衍生物或片段，如美国专利申请公开号2011/0229455和/或美国专利申请公开号2014/0271611中所述，出于所有目的，它们中的每一个都通过引用整体并入本文。
[0156]
在某些方面，重组adamts13可以是bax930/shp655/tak755。bax930/shp655/tak755是完全糖基化的重组人adamts13蛋白(参见例如，wo2002042441，其通过引用整体并入本文)。在某些方面，adamts13蛋白包括具有adamts13活性的任何蛋白质或多肽，特别是与bax930/shp655/tak755具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同源性的具有裂解vwf的tyr-842和met-843残基之间肽键的能力的蛋白质或多肽。
[0157]
可通过在哺乳动物细胞培养物中表达来制备具有蛋白水解活性的重组adamts13，如plaimauer等(2002，blood.15；100(10):3626-32)和us2005/0266528中所述，出于所有目的，其公开内容通过引用整体并入本文。plaimauer b，scheiflinger f(semin hematol.2004年1月；41(1):24-33和us2011/0086413中公开了在细胞培养物中表达重组adamts13的方法，出于所有目的，其公开内容通过引用整体并入本文)。关于在细胞培养物中产生重组adamts13的方法，参见wo2012/006594，出于所有目的，其通过引用整体并入本
文。
[0158]
从样品中纯化adamts13蛋白的方法在美国专利号8,945,895中有所描述，出于所有目的，其通过引用并入本文。在一些方面，此类方法包括：通过在允许adamts13蛋白出现在来自羟基磷灰石的洗脱液或上清液中的条件下，将样品与羟基磷灰石进行色谱接触，来富集adamts13蛋白。该方法可以进一步包括用结合adamts13蛋白的混合模式阳离子交换/疏水相互作用树脂的串联色谱。额外的可选步骤包括超滤/渗滤、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱和病毒灭活。在一些方面，此类方法包括灭活蛋白质样品中的病毒污染物，其中蛋白质固定在支持物上。在一些方面，本文还提供了根据美国专利号8,945,895中描述的方法制备的adamts13组合物。adamts13组合物和施用
[0159]
在本发明的一个方面，将adamts13施用于有需要的受试者。在一些方面，为了向受试者施用本文所述的adamts13，将adamts13配制在包含一种或多种药学上可接受的载体的组合物中。
[0160]
与本文所述的组合物结合使用时，术语“药学上可接受的”是指此类组合物的分子实体和其他成分在生理上是可耐受的，并且当施用于哺乳动物(例如人类)时通常不会产生不良反应。优选地，术语“药学上可接受的”是指经联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典或其他普遍认可的药典中列出的用于哺乳动物，尤其是用于人类。“药学上可接受的载体”包括任何和所有临床上有用的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。在一些方面，组合物与水或普通有机溶剂形成溶剂化物。此类溶剂合物也包括在内。
[0161]
在一些方面，本发明提供了如美国专利号8,623,352和/或美国专利申请公开号2014/0271611中所述的血浆来源的adamts13和重组adamts13(radamts13)蛋白的稳定制剂，出于所有目的，两者均以引用方式并入本文。在一些实施方案中，本文提供的制剂在长期储存时保留显著的adamts13活性。在一些实施方案中，本发明的制剂减少或延迟adamts13蛋白的二聚化、寡聚化和/或聚集。
[0162]
在一些方面，本发明提供了adamts13的制剂，其包含治疗有效量或剂量的adamts13蛋白、亚生理至生理浓度的药学上可接受的盐、稳定浓度的一种或多种糖和/或糖醇、非离子表面活性剂、为制剂提供中性ph的缓冲剂、以及可选的钙盐和/或锌盐。通常，本文提供的稳定的adamts13制剂适用于药物给药。在一些方面，adamts13蛋白是人adamts13或其生物活性衍生物或片段，如美国专利申请公开号2011/0229455和/或美国专利申请公开号2014/0271611中所述，出于所有目的，其各自通过引用整体并入本文。
[0163]
在一些方面，adamts13制剂是液体或冻干制剂。在其他实施方案中，如美国专利申请公开号2011/0229455和/或美国专利申请公开号2014/0271611中所述，冻干制剂由液体制剂冻干，出于所有目的，其各自通过引用整体并入本文。在本文提供的制剂的某些实施方案中，adamts13蛋白是人adamts13或重组人adamts13，或其具有生物活性的衍生物或片段，如美国专利申请公开号2011/0229455和/或美国专利申请公开号2014/0271611中所述，出于所有目的，其各自通过引用整体并入本文。
[0164]
在各个方面，本发明的组合物通过口服、局部、经皮、肠胃外、通过吸入喷雾、阴道、直肠或通过颅内注射给药。本文使用的术语肠胃外包括皮下注射、静脉内、肌肉内、脑池内
注射或输液技术。在一些实施方案中，给药是皮下的。也考虑通过静脉内、皮内、肌肉内、乳房内、腹膜内、鞘内、球后、肺内注射和/或手术植入在特定部位的给药。在一些实施方案中，给药是静脉内的。通常，组合物基本上不含热原以及可能对接受者有害的其他杂质。
[0165]
组合物或药物组合物的制剂将根据选择的给药途径而变化(例如，溶液或乳液)。在生理学可接受的媒介物或载体中制备包含待施用的组合物的合适的组合物。对于溶液或乳液，合适的载体包括例如水溶液或醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。在一些方面，肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或非挥发性油。在某些方面，静脉内载体包括各种添加剂、防腐剂或流体、营养物或电解质补充剂。
[0166]
在各个方面，可用于本发明的化合物和方法的组合物或药物组合物含有adamts13作为活性成分，包含药学上可接受的载体或添加剂，取决于给药途径。此类载体或添加剂的实例包括水、药学上可接受的有机溶剂、胶原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯树胶、酪蛋白、明胶、琼脂、双甘油、甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(hsa)、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、药学上可接受的表面活性剂等。视剂型而定，所使用的添加剂选自但不限于上述或它们的组合。
[0167]
在各个方面，各种水性载体，例如水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸或水性悬浮液包含与适合于制备水性悬浮液的赋形剂混合的活性化合物。此类赋形剂为悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶；在一些情况下，分散剂或润湿剂是天然存在的磷脂，例如卵磷脂，或环氧烷与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，例如十七乙基-烯氧基十六醇，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸的偏酯和己糖醇的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如聚山梨醇酐单油酸酯。在一些方面，水性悬浮液包含一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或正丙酯。
[0168]
在一些方面，adamts13或adamts13组合物在使用前被冻干用来储存以及在合适的载体中重构。使用本领域已知的任何适合的冻干和重构技术。本领域技术人员理解，冻干和重构会导致不同程度的蛋白质活性损失，会经常调整使用水平以进行补偿。
[0169]
适用于通过加入水制备水悬浮液的可分散粉剂和颗粒剂提供与分散剂或润湿剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性化合物。合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂的例子是上面已经提到的那些。
[0170]
在一些实施方案中，本文提供的adamts13制剂可进一步包含如美国专利申请公开号2011/0229455和/或美国专利申请公开号2014/0271611中所述的一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体和/或稀释剂，出于所有目的，其各自通过引用整体并入本文。
[0171]
在一些实施方案中，本文提供的adamts13制剂将具有如美国专利申请公开号2011/0229455和/或美国专利申请公开号2014/0271611中所述的范围内的张力(tonicity)，出于所有目的，其各自通过引用整体并入本文。
[0172]
在一些方面，本发明提供了adamts13的制剂，其包含美国专利申请公开号2011/0229455的第iii部分(“adamts13组合物和制剂”)中描述的示例性制剂。出于所有目的，美
国专利申请公开号2011/0229455和/或美国专利申请公开号2014/0271611中描述的adamts13生产方法及其组合物通过引用整体并入本文。此外，制备肠胃外给药的制剂和组合物的实际方法是本领域技术人员已知的或显而易见的，并且更详细地描述于例如remington's pharmaceutical science，第15版，mack publishing company，easton，pa，1980。
[0173]
在各个方面，药物组合物呈无菌可注射水性、油质悬浮液、分散体或无菌粉末的形式，用于临时制备无菌可注射溶液或分散体。在一些方面，可根据已知技术，使用上述那些合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制悬浮液。在某些方面，无菌可注射制剂是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为在1,3-丁二醇中的溶液。在一些实施方案中，载体是含有以下物质的溶剂或分散介质，例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、合适的以上混合物、植物油、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的非挥发油通常用作溶剂或悬浮介质。在各个方面，为此目的使用任何温和的非挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸如油酸可用于制备注射剂。
[0174]
在所有情况下，使用的形式必须是无菌的并且必须是流动的，流动性必须达到易于注射的程度。例如，通过使用涂层如卵磷脂、在分散的情况下通过维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂，来保持适当的流动性。它在制造和储存条件下必须是稳定的，并且必须防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，可以防止微生物的作用。在许多情况下，需要包括等渗剂，例如糖或氯化钠。在某些方面，可注射组合物的延长吸收是通过在组合物中使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现的。
[0175]
在某些方面，用于给药的组合物与摄取或吸收促进剂一起配制以增加它们的效果。此类增强剂包括，例如，水杨酸盐、甘胆酸盐/亚油酸盐、甘胆酸盐、抑肽酶、杆菌肽、sds、癸酸盐等。参见，例如，fix(j.pharm.sci.，85:1282-1285，1996)和oliyai等(ann.rev.pharmacol.toxicol.，32:521-544，1993)，出于所有目的，各自都通过引用整体并入本文。
[0176]
此外，本发明的组合物和方法中使用的组合物的亲水性和疏水性的性质能得到很好的平衡，从而增强了它们在体外和尤其是体内使用的效用，而缺乏这种平衡的其他组合物的实用性大大降低。具体而言，本发明内容中的组合物在水性介质中具有适当的溶解度，其允许在体内吸收和生物利用，同时还具有在脂质中的溶解度，其允许化合物穿过细胞膜到达预设的作用位点。
[0177]
在特定方面，adamts13在药学上可接受的(即无菌和无毒的)液体、半固体或固体稀释剂中提供，该稀释剂用作药物载体、赋形剂或介质。使用本领域已知的任何稀释剂。示例性稀释剂包括但不限于聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯、硬脂酸镁、羟基苯甲酸甲酯和丙酯、滑石、藻酸盐、淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、甘露醇、阿拉伯树胶、磷酸钙、矿物油、可可脂和可可油。
[0178]
组合物以便于递送的形式包装。组合物被封装在胶囊、囊片、小袋、扁囊剂、明胶、纸或其他容器中。当与组合物至受体生物体的递送相容时，特别是当组合物以单位剂量形式递送时，这些递送形式是优选的。剂量单位被包装在例如小瓶、片剂、胶囊、栓剂或扁囊剂中。
[0179]
本发明包括用于治疗、改善和/或预防受试者的scd中的voc的方法，包括施用有效量的adamts13或如本文所述的adamts13组合物。通过如本文上文详细描述的任何常规方法将组合物引入待治疗的受试者。在某些方面，组合物以单剂量给药或在一段时间内多剂量给药(如下文更详细描述)。
[0180]
在一些实施方案中，在voc发作后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、60、72、84、96、108或120小时内，将包含adamts13的组合物施用给受试者。在一些实施方案中，在voc发作后约1-2小时、约1-5小时、约1-10小时、约1-12小时、约1-24小时、约1-36小时、约1-48小时、约1-60小时、约1-72小时、约1-84小时、约1-96小时、约1-108小时或约1-120小时内，将包含adamts13的组合物施用给受试者。在一些实施方案中，在voc发作后约2-5小时、约5-10小时、约10-20小时、约20-40小时、约30-60小时、约40-80小时、约50-100小时或约60-120小时内，将包含adamts13的组合物施用给受试者。在一些实施方案中，组合物在voc的1周内施用。在一些实施方案中，组合物在voc之后每天施用。在一些实施方案中，组合物在voc之后每周施用。在一些实施方案中，组合物每天施用。在一些实施方案中，组合物每隔一天施用。在一些实施方案中，组合物每三天施用一次。在一些实施方案中，组合物每周施用两次。在一些实施方案中，施用组合物直到临床表现(例如，症状和/或生物标志物)消退。在一些实施方案中，组合物被施用直到临床表现消退后一天。在一些实施方案中，组合物在临床表现消退后施用至少两天。在一些实施方案中，组合物在临床表现消退后施用至少三天。在一些实施方案中，组合物在临床表现消退后施用至少一周。
[0181]
在一些方面，向患有镰状细胞病的受试者施用包含adamts13的组合物以防止voc的发作。在这种预防性治疗中，adamts13以单次弹丸注射或多剂量给药，以维持有效防止voc发生的adamts13的循环水平。在这些方面，包含adamts13的组合物每月、每两周、每周、每周两次、每隔一天或每天施用。在特定方面，注射是皮下给药。在其他方面，注射是静脉内施用的。
[0182]
在一些实施方案中，在voc发作之前向受试者施用包含adamts13的组合物以防止voc。在本发明的这些方面，以足以在受试者或受试者的血液中维持有效水平的adamts13活性的治疗有效量或剂量施用组合物。adamts13组合物的剂量/治疗方法
[0183]
在各个方面，待施用的adamts13或adamts13组合物的有效剂量根据改变药物作用的多种因素而变化，例如，受试者的年龄、状况、体重、性别和饮食、任何感染的严重程度、给药时间、给药方式和其他临床因素，包括scd的voc的严重程度。
[0184]
在一些方面，本发明的制剂或组合物通过初始弹丸注射给药，然后在一段时间过去后加强递送。在某些方面，本发明的制剂通过初始弹丸注射随后连续输注以维持adamts13的治疗循环水平。在特定方面，本发明内容的adamts13或adamts13组合物在延长的时间段内施用。在一些方面，adamts13或adamts13组合物以快速治疗方案递送以缓解voc的急性症状。在一些方面，adamts13或adamts13组合物在延长和变化的治疗方案中递送以防止voc的发生。作为另一个例子，本发明的组合物或制剂作为一次性剂量给药。本领域普通技术人员根据良好的医疗实践和个体受试者的临床状况容易地优化有效剂量和给药方案。给药频率取决于药剂的药代动力学参数、给药途径和受试者的状况。
[0185]
药物制剂由本领域技术人员根据给药途径和所需剂量确定。例如，参见remington's pharmaceutical sciences，第18版(1990，mack publishing co.，easton，pa 18042)第1435-1712页，出于所有目的，将其公开内容以引用方式并入本文。在一些情况下，此类制剂影响所施用组合物的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除率。根据给药途径，在特定方面，根据体重、体表面积或器官大小计算合适的剂量。在一些方面，通过使用已建立的用于测定血液水平剂量的测定法结合适当的剂量反应数据来确定适当的剂量。在某些方面，测量个体的抗体效价以确定最佳剂量和给药方案。最终的给药方案将由主治医生或医师决定，考虑改变药物组合物作用的各种因素，例如，组合物的比活性、受试者的反应性、受试者的年龄、状况、体重、性别和饮食、任何感染或恶性状况的严重程度、给药时间和其他临床因素，包括疼痛或voc的严重程度。
[0186]
在某些方面，adamts13或adamts13组合物包含足以在受试者中引起反应的任何剂量的adamts13。在一些实施方案中，adamts13的剂量足以治疗voc。在一些实施方案中，adamts13的剂量足以防止voc。治疗上使用的adamts13或adamts13组合物的有效量将取决于例如治疗背景和目标。本领域技术人员将理解，用于治疗或预防的适当剂量水平将因此部分地取决于递送的分子、使用adamts13或adamts13组合物的适应症、给药途径和大小(体重、体表或器官大小)和患者的状况(年龄和一般健康状况)。因此，在某些情况下，临床医生会调整剂量并修改给药途径以获得最佳治疗效果。
[0187]
除非另有具体说明，否则剂量以国际单位提供。如下文所述，国际单位(iu)的使用是衡量adamts13活性的新标准。直到最近，frets单位(或frets-vwf73测试单位)还是衡量adamts13活性的标准。20frets单位(frets u)约等于21.78iu。换言之，20iu的adamts13相当于约18.22frets u的adamts13。
[0188]
在各个方面，典型的剂量范围从每公斤体重约10个国际单位至每公斤体重约10,000个国际单位。在一些方面，取决于上述因素，adamts13的剂量或治疗有效量高达每公斤体重约10,000个国际单位或更多。在其他方面，剂量范围可为每公斤体重约20至约6,000个国际单位。在一些方面，adamts13的剂量或治疗有效量为每公斤体重约40至约4,000个国际单位。在一些方面，剂量或治疗有效量为每公斤体重约100至约3,000个国际单位。
[0189]
在特定方面，剂量或治疗有效量为每公斤体重约10至约500个国际单位。在一些方面，剂量或治疗有效量为每公斤体重约50至约450个国际单位。在一些方面，治疗有效量为每公斤体重约40至约100个国际单位。在一些方面，治疗有效量为每公斤体重约40至约150个国际单位。在一些方面，剂量或治疗有效量为每公斤体重约100至约500个国际单位。在一些方面，剂量或治疗有效量为每公斤体重约100至约400个国际单位。在一些方面，剂量或治疗有效量为每公斤体重约100至约300个国际单位。在一些方面，剂量或治疗有效量为每公斤体重约300至约500个国际单位。在一些方面，剂量或治疗有效量为每公斤体重约200至约300个国际单位。在一些方面，剂量或治疗有效量为每公斤体重约100、约150、约200、约250、约300、约350、约400、约450或约500个国际单位。
[0190]
在进一步的方面，剂量或治疗有效量为每公斤体重约50至约1,000个国际单位。在一些方面，剂量或治疗有效量为每公斤体重约100至约900个国际单位。在一些方面，剂量或治疗有效量为每公斤体重约200至约800个国际单位。在一些方面，剂量或治疗有效量为每公斤体重约300至约700个国际单位。在一些方面，剂量或治疗有效量为每公斤体重约400至
约600个国际单位。在一些方面，剂量或治疗有效量为每公斤体重约500个国际单位。
[0191]
在一些方面，剂量或治疗有效量为每公斤体重约10个国际单位，每公斤体重约20个国际单位，每公斤体重约30个国际单位，每公斤体重约40个国际单位，每公斤体重约个50国际单位，每公斤体重约60个国际单位，每公斤体重约70个国际单位，每公斤体重约80个国际单位，每公斤体重约90个国际单位，每公斤体重约100个国际单位，每公斤体重约120个国际单位，每公斤体重约140个国际单位，每公斤体重约150个国际单位，每公斤体重约160个国际单位，每公斤体重约180个国际单位，约每公斤体重约200个国际单位，每公斤约220个国际单位公斤体重，每公斤体重约240个国际单位，每公斤体重约250个国际单位，每公斤体重约260个国际单位，每公斤体重约280个国际单位，每公斤体重约300个国际单位，每公斤体重约350个国际单位，每公斤体重约400个国际单位，每公斤体重约450个国际单位，每公斤体重约500个国际单位，每公斤体重约550个国际单位，每公斤体重约600个国际单位体重，每公斤体重约650个国际单位，每公斤体重约700个国际单位，每公斤体重约750个国际单位，每公斤体重约800个国际单位，每公斤体重约850个国际单位，每公斤体重约900个国际单位，每公斤体重约950个国际单位，每公斤体重约1000个国际单位，每公斤体重约1100个国际单位，每公斤体重约1100个国际单位，每公斤体重约1200个国际单位，每公斤体重约1300个国际单位，每公斤体重约1400个国际单位，每公斤体重约1500个国际单位，每公斤体重约1600个国际单位，每公斤体重约1800个国际单位，每公斤体重约2000个国际单位，每公斤体重约2500个国际单位，每公斤体重约3000个国际单位，每公斤体重约3500个国际单位，每公斤体重约4000个国际单位，每公斤体重约4500个国际单位，每公斤体重约5000个国际单位，每公斤体重约5,500个国际单位，每公斤体重约6000个国际单位，每公斤体重约6500个国际单位，每公斤体重约7000个国际单位，每公斤体重约7500个国际单位，每公斤体重约8000个国际单位，每公斤体重约8500个国际单位，每公斤体重约9000个国际单位，每公斤体重约9500个国际单位，每公斤体重约10000个国际单位。
[0192]
如本文所用，“一个adamts13活性单位”或“一个活性单位”定义为1ml混合的正常人血浆中的活性量，与所使用的检测方法无关。然而，如上所述，测量或定量adamts13的新标准是国际单位(iu)。20frets测试单位或20frets单位(frets u)相当于约21.78iu。换言之，adamts13的20iu相当于adamts13的约18.22frets u。因此，新标准的改变导致frets u到iu的转换大约有8.9％的变化。
[0193]
在一些方面，荧光共振能量转移(fret)测定用于测量adamts13活性。fret需要两个相互作用的伙伴蛋白质，其中一个用供体荧光团标记，另一个用受体荧光团标记。adamts13的fret测定涉及跨adamts13裂解位点的vwf的a2结构域中的化学修饰片段。这很容易被正常血浆裂解，但不能被adamts13缺陷血浆裂解。这种裂解会被edta阻断，因此必须将用于该测定的样品收集到含有柠檬酸盐作为抗凝剂而非edta的试管中。adamts13 frets-vwf73活性的一个单位是裂解相同量的frets-vwf73底物所需的活性量(kokame等，br j.haematol.，2005年4月；129(1):93-100，以整体引用的方式并入本文)，如被1ml混合的正常人血浆裂解。
[0194]
在一些方面，使用额外的活性测定测量adamts13的活性。例如，可以使用sds琼脂糖凝胶电泳进行直接adamts13活性测定以检测全长vwf分子或vwf片段的裂解，并且可以使用胶原结合测定法检测adamts13活性的间接检测。直接测定，包括本文所述的fret测定，涉
及检测全长vwf分子或包含adamts13裂解位点的vwf片段的产物的裂解。通过sds琼脂糖凝胶电泳和蛋白质印迹，纯化的vwf与血浆一起孵育24小时。adamts13对vwf进行裂解，导致多聚体尺寸减小。这种减少通过琼脂糖凝胶电泳观察，然后用过氧化物酶偶联的抗vwf抗体进行蛋白质印迹。测试样品中adamts13活性的浓度可以通过参考一系列稀释的正常血浆样品来确定。也可以进行sds-page和蛋白质印迹，这涉及在sds page和蛋白质印迹后对二聚体vwf片段进行可视化。该测定在技术上比sds琼脂糖凝胶电泳更容易，并且是一种非常灵敏的测量adamts13活性水平的方法。
[0195]
在一些方面，间接测定涉及检测全长vwf分子或包含vwf的a2结构域中的adamts13裂解位点的vwf片段中任一产物的裂解。此类测定包括胶原结合测定，其中正常血浆或纯化的vwf与测试血浆样品在bacl2和1.5m尿素的存在下孵育，使vwf变性。vwf被adamts13裂解，残留的vwf通过其与iii型胶原蛋白的结合来测量。结合的vwf使用具有偶联的抗vwf抗体的elisa测定来进行定量。另一种间接测定是瑞斯托霉素诱导的聚集测定。这类似于上面的胶原结合测定，但残留的vwf是通过使用血小板聚集计通过瑞斯托霉素诱导的血小板聚集来测量的。另一种间接测定是功能性elisa。在该测定中，使用针对vwf上标签的抗体将重组vwf片段固定在elisa板上。vwf片段编码a2结构域和adamts13的裂解位点tyr1605-met1606并被s-转移酶[gst]-组氨酸[gst-vwf73-his]标记。将血浆添加到固定的gst-vwf73-his片段中，固定片段的裂解发生在adamts13裂解位点。残留的、裂解的vwf片段是通过使用仅识别裂解的vwf片段而不识别完整片段的二抗来测量的。因此，adamts13活性与残留底物浓度成反比。
[0196]
adamts13活性可以通过adamts13功能测定来评估(参见例如peyvandi等，j thromb haemost；8:631-40，2010)。示例性功能测定可以在中等变性条件下(例如，在尿素或盐酸胍的存在下)使用全长vwf来展开vwf底物并使其对adamts13裂解敏感，或利用短肽基底物(例如vwf73底物)(kokame等，blood；103(2)：607-12，2004；kokame等，br j haematol；129(1)：93-100，2005年；各自以整体引用的方式并入本文)。此类小肽底物源自vwf的a2结构域，包含adamts13识别和裂解所需的最小vwf氨基酸区域作为底物(kokame等，br j haematol；129(1):93-100，2005，以整体引用的方式并入本文)。
[0197]
在某些实施方案中，使用基于流动的测定(参见例如，han等，transfusion；51(7):1580-91，2011，以整体引用的方式并入本文)来评估adamts13活性。该测定模拟了实现adamts13结合和adamts13介导的裂解所需要的全长vwf底物构象变化所需的体内生理流动条件(shim等，blood；111(2):651-7，2008，以整体引用的方式并入本文)。
[0198]
在某些实施方案中，adamts13以约0.05mg/ml和约10mg/ml之间的治疗有效浓度在最终制剂中提供或施用。在其他实施方案中，adamts13以介于约0.1mg/ml和约10mg/ml之间的浓度存在。在其他实施例中，adamts13以介于约0.1mg/ml和约5mg/ml之间的浓度存在。在另一个实施方案中，adamts13以介于约0.1mg/ml和约2mg/ml之间的浓度存在。在其他实施方案中，adamts13可以约0.01mg/ml、或约0.02mg/ml、0.03mg/ml、0.04mg/ml、0.05mg/ml、0.06mg/ml、0.07mg/ml、0.08mg/ml、0.09mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1.0mg/ml、1.1mg/ml、1.2mg/ml、1.3mg/ml、1.4mg/ml、1.5mg/ml、1.6mg/ml、1.7mg/ml、1.8mg/ml、1.9mg/ml、2.0mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml、5.0mg/ml、5.5mg/ml、6.0mg/ml、
6.5mg/ml、7.0mg/ml、7.5mg/ml、8.0mg/ml、8.5mg/ml、9.0mg/ml、9.5mg/ml、10.0mg/ml或更高的浓度存在。
[0199]
在一些实施方案中，相对纯的adamts13制剂的浓度可以通过光谱法(即，在a280测量的总蛋白)或其他批量测定(例如，布拉德福德测定、银染、冻干粉称重等)来确定。在其他实施方案中，adamts13的浓度可以通过adamts13 elisa测定法(例如，mg/ml抗原)确定。
[0200]
在一些方面，本发明的制剂中adamts13的浓度表示为酶活性水平。例如，在一些实施方案中，adamts13制剂包含约10个单位的frets-vwf73活性和约10,000个单位的frets-vwf73活性之间的或其他合适的adamts13酶促单位(iu)。在其他实施方案中，该制剂可包含约20个单位的frets-vwf73(u
fv73
)活性至约8,000个单位的frets-vwf73活性，或约30u
fv73
至约6,000u
fv73
，或约40u
fv73
至约4,000u
fv73
，或约50u
fv73
至约3,000u
fv73
，或约75u
fv73
至约2,500u
fv73
，或约100u
fv73
至约2,000u
fv73
，或约200u
fv73
至约1,500u
fv73
，或介于约其他范围之间。
[0201]
在一些实施方案中，adamts13以约10u
fv73
/kg体重至10,000u
fv73
/kg体重的剂量提供或施用。在一个实施方案中，adamts13以约20u
fv73
/kg体重至约8,000u
fv73
/kg体重的剂量施用。在一个实施方案中，adamts13以约30u
fv73
/kg体重至约6,000u
fv73
/kg体重的剂量施用。在一个实施方案中，adamts13以约40u
fv73
/kg体重至约4,000u
fv73
/kg体重的剂量施用。在一个实施方案中，adamts13以约100u
fv73
/kg体重至约3,000u
fv73
/kg体重的剂量施用。在一个实施方案中，adamts13以约200u
fv73
/kg体重至约2,000u
fv73
/kg体重的剂量施用。在其他实施方案中、adamts13以约10u
fv73
/kg体重、约20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500、3,600、3,700、3,800、3,900、4,000、4,500、5,000、5,500、6,000、6,500、7,000、7,500、8,000、8,500、9,000、9,500或10,000u
fv73
/kg体重，或它们的中间剂量或剂量范围施用。
[0202]
在一些方面，本文提供的adamts13制剂包含约20至约10,000个u
fv73
。在一些实施方案中，制剂含有约10个单位的frets-vwf73活性，或约20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500、3,600、3,700、3,800、3,900、4,000、4,100、4,200、4,300、4,400、4,500、4,600、4,700、4,800、4,900、5,000、5,100、5,200、5,300、5,400、5,500、5,600、5,700、5,800、5,900、6,000、6,100、6,200、6,300、6,400、6,500、6,600、6,700、6,800、6,900、7,000、7,100、7,200、7,300、7,400、7,500、7,600、7,700、7,800、7,900、8,000、8,100、8,200、8,300、8,400、8,500、8,600、8,700、8,800、8,900、9,000、9,100、9,200、9,300、9,400、9,500、9,600、9,700、9,800、9,900、10,000或更高单位的frets-vwf73活性。
[0203]
在一些方面，adamts13的浓度可以表示为每单位体积的酶活性，例如每毫升adamts13酶单位(iu/ml)。例如，在一些实施方案中，adamts13制剂包含约10iu/ml至约10,000iu/ml。在一些其他实施方案中，该制剂包含约20iu/ml至约10,000iu/ml，或约20iu/ml至约8,000iu/ml，或约30iu/ml至约6,000iu/ml，或约40iu/ml至约4,000iu/ml，或约50iu/ml至约3,000iu/ml，或约75iu/ml至约2,500iu/ml，或约100iu/ml至约2,000iu/ml，或约
200iu/ml至约1,500iu/ml，或在其中约其他范围之间。在一些实施方案中，本文提供的adamts13制剂包含约150iu/ml至约600iu/ml。在另一个实施方案中，本文提供的adamts13制剂包含约100iu/ml至约1,000iu/ml。在一些实施方案中，本文提供的adamts13制剂包含约100iu/ml至约800iu/ml。在一些实施方案中，本文提供的adamts13制剂包含约100iu/ml至约600iu/ml。在一些实施方案中，本文提供的adamts13制剂包含约100iu/ml至约500iu/ml。在一些实施方案中，本文提供的adamts13制剂包含约100iu/ml至约400iu/ml。在一些实施方案中，本文提供的adamts13制剂包含约100iu/ml至约300iu/ml。在一些实施方案中，本文提供的adamts13制剂包含约100iu/ml至约200iu/ml。在一些实施方案中，本文提供的adamts13制剂包含约300iu/ml至约500iu/ml。在一些实施方案中，本文提供的adamts13制剂包含约100iu/ml。在一些实施方案中，本文提供的adamts13制剂包含约300iu/ml。在各种实施方案中，制剂包含约10iu/ml，或约20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500、3,600、3,700、3,800、3,900、4,000、4,100、4,200、4,300、4,400、4,500、4,600、4,700、4,800、4,900、5,000、5,100、5,200、5,300、5,400、5,500、5,600、5,700、5,800、5,900、6,000、6,100、6,200、6,300、6,400、6,500、6,600、6,700、6,800、6,900、7,000、7,100、7,200、7,300、7,400、7,500、7,600、7,700、7,800、7,900、8,000、8,100、8,200、8,300、8,400、8,500、8,600、8,700、8,800、8,900、9,000、9,100、9,200、9,300、9,400、9,500、9,600、9,700、9,800、9,900、10,000以上iu/ml。
[0204]
在一些实施方案中，施用adamts13或包含adamts13的组合物导致期望的血浆adamts13浓度。血浆adamts13浓度可在给药后一段时间(例如，5分钟、1小时、3小时或24小时)后测定。在一些实施方案中，施用adamts13或包含adamts13的组合物导致受试者的血浆adamts13浓度为约0.5至约100u/ml。例如，在一些实施方案中，施用adamts13或包含adamts13的组合物导致受试者的血浆adamts13浓度为约1至约80u/ml。在一些实施方案中，施用adamts13或包含adamts13的组合物导致受试者的血浆adamts13浓度为约5至约50u/ml。在一些实施方案中，施用adamts13或包含adamts13的组合物导致受试者的血浆adamts13浓度为约12至约50u/ml。在一些实施方案中，施用adamts13或包含adamts13的组合物导致受试者的血浆adamts13浓度为约5至约20u/ml。
[0205]
在一些实施方案中，施用adamts13或包含adamts13的组合物导致受试者的血浆adamts13浓度为约1u/ml、约2u/ml、约3u/ml、约4u/ml、约5u/ml、约6u/ml、约7u/ml、约8u/ml、约9u/ml、约10u/ml、约11u/ml、约12u/ml、约13u/ml、约14u/ml、约15u/ml、约16u/ml、约17u/ml、约18u/ml、约19u/ml、约20u/ml、约21u/ml、约22u/ml、约22u/ml、约23u/ml、约24u/ml、约25u/ml、约26u/ml、约27u/ml、约28u/ml、约29u/ml、约30u/ml、约32u/ml、约34u/ml、约36u/ml、约38u/ml、约40u/ml、约42u/ml、约44u/ml、约46u/ml、约48u/ml、约50u/ml、约52u/ml、约54u/ml、约56u/ml、约58u/ml、约60u/ml、约70u/ml，约80u/ml，或超过80u/ml。
[0206]
在一些实施方案中，本文提供的adamts13制剂还可包含一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体和/或稀释剂，如美国专利申请公开号2011/0229455和/或美国专利申请公开号2014/0271611中所述，出于所有目的，各自都通过引用整体并入本文。此外，在一个实施方案中，本文提供的adamts13制剂将具有在如美国专利申请公开号2011/0229455和/或
美国专利申请公开号2014/0271611中所述的范围内的张力，出于所有目的，各自都通过引用整体并入本文。
[0207]
给药频率将取决于所用制剂中adamts13分子的药代动力学参数。通常，临床医生将施用组合物直至达到实现所需效果的剂量。因此，在各个方面，组合物以单一剂量施用，或以两个以上剂量(可能含有或可能不含有相同量的所需分子)随时间施用，或者经由植入装置或导管以连续输注施用。在一些方面，包含adamts13的组合物以单次弹丸注射，每月、每两周、每周、每周两次、每隔一天、每天、每12小时、每八小时、每六小时、每四小时、或每两小时施用。在本发明的预防性或预防性治疗方面，adamts13以多剂量给药以维持有效防止voc发作的adamts13的循环水平。在这些方面，包含adamts13的组合物每月、每两周、每周、每周两次、每隔一天或每天施用。在特定方面，通过皮下注射施用(例如，wo2014151968，出于所有目的，通过引用整体并入本文)。在其他方面，通过静脉注射施用。适当的给药剂量和给药时机的进一步改进由本领域普通技术人员常规进行并且在他们常规调整任务的范围内。适当的剂量通常通过使用常规获得的适当剂量反应数据来确定。包含adamts13的试剂盒
[0208]
作为另一方面，本发明内容包括试剂盒，其包含一种以上用于向受试者施用adamts13或adamts13组合物的药物制剂，所述药物制剂以促进它们用于向受试者施用的方式包装。
[0209]
在一个具体实施方案中，本发明包括用于生产单剂量给药单元的试剂盒。在另一个实施方案中，本发明包括用于提供多剂量给药单元的试剂盒。在各个方面，所述试剂盒各自包含具有干燥蛋白质的第一容器和具有水性制剂的第二容器。还包括在本发明范围内的是包含单室和多室预填充注射器(例如，液体注射器和冻干品注射器(lyosyringe))的试剂盒。
[0210]
在另一个实施方案中，此类试剂盒包括本文所述的药物制剂(例如，包含治疗性蛋白质例如adamts13的组合物)，其包装在容器例如密封瓶或器皿中，标签贴在容器上或包含在包装中，标签描述了化合物或组合物在实施该方法时的用途。在一个实施方案中，药物制剂被包装在容器中，使得容器中的顶部空间的量(例如，液体制剂和容器顶部之间的空气量)非常小。优选地，顶部空间的量可以忽略不计(即，几乎没有)。
[0211]
在一些方面，药物制剂或组合物包含稳定剂。术语“稳定剂”是指保护组合物免受不利条件影响的物质或赋形剂，例如在加热或冷冻过程中发生的不利条件，和/或指延长组合物或药物组合物的稳定性或在稳定状态下的保质期的物质或赋形剂。稳定剂的实例包括但不限于糖类，例如蔗糖、乳糖和甘露糖；糖醇，如甘露醇；氨基酸，如甘氨酸或谷氨酸；和蛋白质，如人血清白蛋白或明胶。
[0212]
在一些方面，药物制剂或组合物包含抗微生物防腐剂。术语“抗微生物防腐剂”是指加入组合物中能抑制微生物生长的任何物质，微生物可能会在重复刺穿多剂量小瓶(如果使用这类容器)时被引入。抗微生物防腐剂的实例包括但不限于诸如硫柳汞、2-苯氧基乙醇、苄索氯铵和苯酚之类的物质。
[0213]
在一个方面，所述试剂盒包含具有治疗性蛋白质或蛋白质组合物的第一容器和具有用于所述组合物的生理学上可接受的重构溶液的第二容器。一方面，药物制剂以单位剂型包装。可选地，试剂盒还包含根据特定给药途径而适合于施用药物制剂的装置。在一些方
面，试剂盒包含描述药物制剂用途的标签。
[0214]
整个文件旨在作为一个整体公开进行关联，并且应当理解，本文描述的特征的所有组合均被考虑，即使在本文档的同一个句子、段落或小节中没有同时发现这些特征的组合。本发明还包括例如本发明的所有实施方案，其范围以任何方式比上面具体提到的变型更窄。
[0215]
在本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，就如同每个单独的出版物或专利申请在与本发明内容不矛盾的范围内被明确和单独地表明通过引用整体并入本文。
[0216]
应当理解，本文描述的示例和实施方案仅用于说明目的，并且本领域技术人员将据其提出各种修改或改变，也被包括在本技术的精神和范围内以及所附权利要求的范围内。实施例
[0217]
本发明的其他方面和细节将从以下实施例中显而易见，这些实施例旨在说明而非限制。实施例1在血红蛋白存在下重组adamts13的蛋白水解活性
[0218]
本研究的目的是评估(i)血红蛋白对adamts13介导的vwf多聚体裂解的抑制作用；(ii)过量的重组adamts13(radamts13[也称为shp655或bax930或tak755])是否可以阻止或压倒(override)抑制作用；(iii)阻止或压倒这种抑制作用所需的人radamts13(shp655)浓度。本研究旨在证明在镰状细胞病(scd)患者中补充radamts13的体外可行性，镰状细胞病(scd)患者中升高的细胞外血红蛋白会削弱vwf多聚体裂解。
[0219]
adamts13活性被scd中常见的游离血红蛋白(hb)的高血浆浓度抑制。结果表明，细胞外血红蛋白(echb)与血管性血友病因子(vwf)a2结构域结合并显著阻止其被adamts13裂解。为了模拟细胞外血红蛋白在非变性测定流动条件下对adamts13介导的vwf多聚体裂解的所述抑制作用，使用了一种使用全长vwf作为底物的基于涡流(vortex)的方法。在恒定涡流下孵育由全长重组vwf(rvwf)、血红蛋白、冻干福尔马林固定的血小板和重组adamts13(radamts13)组成的反应混合物后，在vwf特异性免疫印迹中分析adamts13介导的vwf蛋白水解裂解产物。此外，还研究了过量的radamts13是否可以压倒血红蛋白的阻断作用，从而实现超大vwf(ulvwf)多聚体降解。1.基于涡流的测定实验
[0220]
建立基于涡流的测定实验以使用全长vwf底物来测定流体剪切应力下的adamts13活性(han等，transfusion；51(7):1580-91，2011；shim等，blood；111(2):651-7，2008；各自通过引用整体并入本文)。在该测定实验中，首先根据han等人描述(han等，transfusion；51(7):1580-91，2011)，将rvwf与福尔马林固定的洗涤血小板和adamts13测试样品在恒定涡流下一起孵育。然后通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分离生成的vwf裂解片段，通过vwf特异性免疫印迹分析检测并通过光密度测定法进行定量。
[0221]
按照标准方案进行基于涡流的测定实验。简而言之，将反应混合物(在涡流测定缓冲液中含有rvwf、血小板、血红蛋白和radamts13，总体积为60μl)转移到0.2ml薄壁反应管中，并在室温(rt)下在mixmate涡流器上以2500rpm的转速恒定涡旋孵育60分钟。然后，通过
添加乙二胺四乙酸(edta)至终浓度为10mm，停止所有反应混合物。
[0222]
在非还原条件下，在nupage 3-8％tris-醋酸凝胶上分离vwf裂解片段(176kda和140kda的二聚体片段)，并使用与hrp偶联的多克隆兔抗vwf抗体通过免疫印迹观察，以及通过二聚体176kda裂解片段的光密度分析评估。
[0223]
将具有血红蛋白的所有反应混合物与以相同方式处理的不含血红蛋白的反应混合物进行比较。
[0224]
1.1血小板的制备
[0225]
将福尔马林固定的冻干血小板(helena，目录号#5371)溶解在3ml血小板溶解缓冲液(20mm tris，100mm nacl缓冲液，ph7.4)中，在室温下孵育10分钟，并以10000rpm离心5分钟。将血小板沉淀重新悬浮在涡流测定缓冲液(50mm hepes、150mm nacl、0.1μm zncl2、5mm cacl2、0.3％bsa，ph7.4)中，并使用sysmex poch 100i血液分析系统(sysmex；日本神户)测定血小板浓度。根据制造商的说明，将溶解在涡流测定缓冲液中的血小板在4℃下最多保存24小时。反应混合物中使用的血小板终浓度为300
×
103个细胞/μl。
[0226]
1.2 rvwf的重构
[0227]
将一小瓶rvwf(批号：hn4ar00)冻干物溶解在500μl蒸馏去离子水中，得到浓度为91iu/ml(vwf:抗原活性)。然后将rvwf在涡流测定缓冲液中预稀释至18iu/ml的浓度，并在反应混合物中进一步稀释到1:6。每个反应混合物中使用的最终rvwf浓度为3iu/ml，相当于大约30μg/ml。
[0228]
1.3血红蛋白溶液的制备
[0229]
将血红蛋白粉末(sigma，目录号#h7397；由人红细胞制备)溶解在涡流测定缓冲液中至浓度为100mg/ml、10mg/ml和1mg/ml；并将预期体积加入反应混合物中以达到最终浓度0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、5mg/ml和10mg/ml。
[0230]
1.4 radamts13的制备
[0231]
将radamts13(批号：hr5bk00)内部参比制剂(277.5u/ml)在涡流测定缓冲液中稀释至radamts13最终浓度为0.25u/ml、0.5u/ml、1u/ml和2u/ml。
[0232]
1.5样品制备
[0233]
每组实验包含以下样品：(i)测试样品，由具有radamts13和血红蛋白的vwf裂解孵育混合物组成；(ii)对照样品，由具有radamts13和不含血红蛋白的vwf裂解孵育混合物组成；(iii)阴性对照样品，其中预期没有adamts13介导的vwf裂解(导致未裂解的vwf)。阴性对照样品由包含血红蛋白的孵育混合物组成，在radamts13存在或不存在的情况下，添加10mm edta以螯合二价阳离子以及阻断adamts13介导的vwf裂解。
[0234]
1.6反应混合物
[0235]
准备了两种不同的实验设置。反应混合物在0.2ml薄壁反应管(订单号732-0548，vwr；维也纳，奥地利)中孵育。
[0236]
(i)在加入纯化的radamts13之前，将血小板、rvwf和血红蛋白预孵育30分钟
[0237]
对于预孵育设置，将纯化的重组人vwf(3iu/ml)和含有重构的冻干福尔马林固定的血小板(300x103个细胞/μl)的测定缓冲液的混合物与不同浓度的血浆纯化人血红蛋白预孵育，总体积为45μl。不含血红蛋白的各个对照样品以相同的方式制备，但使用适当体积的涡流测定缓冲液。测试样品和对照样品的预孵育在mixmate涡流仪(订单号732-6009，
eppendorf；德国汉堡)上以2500rpm的恒定涡流在室温下进行30分钟。对以下实验进行了预孵育：抑制性血红蛋白(参见本实施例的4.1节)和预孵育与直接孵育(参见本实施例的4.3节)。
[0238]
(ii)同时直接孵育血小板、rvwf、血红蛋白和纯化的radamts13
[0239]
为了研究当血红蛋白已经与vwf结合(并且需要由adamts13从vwf置换)或当反应组分同时混合且血红蛋白与adamts13竞争性结合vwf时，vwf裂解的程度是否有区别，准备了直接孵育设置。对于直接孵育设置，纯化的重组人vwf(3iu/ml)和含有重构的冻干福尔马林固定的血小板(300
×
103个细胞/μl)的测定缓冲液与不同浓度的血浆纯化人血红蛋白混合，总体积为45μl。不含血红蛋白的各个对照样品以相同的方式制备，但使用合适体积的涡流测定缓冲液。在添加radamts13之前没有进行进一步的孵育。对以下实验进行直接孵育：压倒血红蛋白(见本实施例的4.2节)和预孵育与直接孵育(见本实施例的4.3节)。
[0240]
在预孵育或直接孵育之后，将15μl不同浓度的纯化radamts13添加到反应混合物中，总体积为60μl。作为未裂解vwf的阴性对照，添加了不含radamts13的测定缓冲液。最终的反应混合物在室温下在mixmate涡流器上以2500rpm转速的恒定涡流孵育60分钟。然后通过添加edta至终浓度为10mm，来终止所有反应混合物。vwf裂解片段(176kda和140kda的二聚体片段)在非还原条件下在nupage 3-8％tris-醋酸凝胶上分离。
[0241]
测定反应混合物设置的概述在表1中描述。表1.所有实验的测试样品和对照样品的测定反应混合物设置的概述表1.所有实验的测试样品和对照样品的测定反应混合物设置的概述rt：室温；vab：涡流测定缓冲液a这些血红蛋白和radamts13浓度并未用于所有实验。用于每个实验所用的具体浓度在本实施例的第4节中有详细说明。b对压倒血红蛋白实验(见本实施例的4.2节)和预孵育与直接孵育实验(见本实施例的4.3节)进行直接孵育。反应混合物的直接孵育描述了当rvwf、血小板、血红蛋白和
radamts13同时孵育时的情况。2.sds-page和免疫印迹分析
[0242]
2.1 sds-page/免疫印迹的阳性对照的制备
[0243]
作为adamts13介导的vwf裂解产物的阳性对照，在中等变性尿素测定条件下(如本实施例的第1部分所述)由radamts13裂解的rvwf被施加到每个凝胶上，用于在免疫印迹分析后可视化适当的不同vwf裂解片段。
[0244]
2.2样品制备、sds-page和免疫印迹检测
[0245]
样品在nupage 4x十二烷基硫酸锂(lds)样品缓冲液(40％甘油、4％lds、4％ficoll-400、0.8m三乙醇胺氯化物[ph7.6]、0.025％酚红、0.025％考马斯亮蓝g250、2mm edta，订单号np0007，invitrogen；维也纳，奥地利)中稀释，以约12ng vwf的浓度上样到nupage 3-8％tris-醋酸凝胶(订单号ea03755box，invitrogen；维也纳，奥地利)每个泳道，并在变性、非还原条件下分离。
[0246]
每个凝胶含有预染色的蛋白marker、在尿素裂解条件下产生的阳性对照、至少一种不含血红蛋白的参考对照样品、具有血红蛋白的radamts13测试样品和阴性对照样品(不含radamts13的参考样品或与10mm[终浓度]edta孵育的参考样品)。
[0247]
在凝胶电泳(150伏运行约4小时)后，将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上(iblotr凝胶转移堆叠硝酸纤维素；订单号ib3010-01，invitrogen；维也纳，奥地利)。作为印迹转移的有效性标准，预染色的蛋白标准品必须在硝酸纤维素膜上清晰可见。
[0248]
将膜用封闭溶液封闭一小时，然后在室温下与tbst和含有hrp偶联的兔抗人vwf多克隆抗体(产品编号：p0226；dakocytomation，glostrup，丹麦)的0.3％奶粉一起孵育过夜，以1:2000稀释。封闭溶液包含tris缓冲盐水(tbs：20mm tris(ph～7.4)，0.9％nacl；订单号t5912-1l，sigma；维也纳，奥地利)和0.05％吐温20(tbst；订单号8.22184.0500，默克；维也纳，奥地利)和3％奶粉(订单号170-6404，bio-radlaboratories，hercules，ca，美国)。多克隆抗体使176kda和140kda二聚体vwf片段(程度稍低)可视化(tan等，thromb res；121(4)：519-26，2008)。
[0249]
在抗体孵育后，在tbst中洗涤印迹，并用超灵敏增强化学发光底物(super signal west femto最大灵敏度底物；订单号34095，thermoscientific，奥地利)检测特异性vwf蛋白条带，以检测结合的抗vwf hrp偶联抗体的过氧化物酶活性。使用chemidoc imager相机系统(biorad，hercules，ca，美国)捕获信号，该系统产生化学发光染色膜的数字图像。
[0250]
如果在尿素裂解条件下产生的阳性印迹对照样品的vwf裂解片段(即176kda的二聚体)在vwf特异性免疫印迹后可检测到，则认为印迹是有效的。
[0251]
通过光密度测定法进一步分析记录的图像以评估特定裂解条带中蛋白质染色的相对量(接下来在本实施例的第3部分描述)。3.数据分析
[0252]
3.1图像分析
[0253]
在chemidoc imager相机系统的评估程序中打开记录的图像，并鉴定和标记待分析的vwf裂解产物(即176kda片段的二聚体)。然后通过评估程序计算每条泳道标记区域的颜色强度，表示为体积强度。这些最终强度值被导出到microsoft office excel 2007以供进一步分析。
[0254]
3.2对照样品评估
[0255]
对于每个含有血红蛋白的测试样品，将不含血红蛋白相应的对照样品上样到凝胶上至少一次。在样品一式两份上样的情况下，计算来自两个重复强度值的平均参考强度值。
[0256]
对照样品的强度值设置为100％，用于随后与测试样品的比较评价。对于每个测试样品，然后确定与对照强度值的偏差。
[0257]
3.3数据分析方法
[0258]
结果表示为％比率并根据以下公式计算：比率[％]＝(平均)强度值
测试样品
/(平均)强度值
对照样品
*100对每种凝胶分别进行此计算。4.结果
[0259]
4.1血红蛋白对adamts13介导的vwf多聚体裂解的抑制作用
[0260]
评估血红蛋白对adamts13介导的vwf多聚体裂解的抑制作用，在血红蛋白浓度增加的情况下(0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、5mg/ml和10mg/ml)，对每个adamts13浓度进行评估，即1u/ml、0.5u/ml和0.25u/ml。hb浓度涵盖在scd患者中观察到的血浆hb范围(20至330μg/ml，在血管闭塞危象期间》400μg/ml)。adamts13的正常人血浆浓度约为1u/ml。
[0261]
图1显示了在存在浓度增加的血红蛋白(0.5mg/ml、1mg/ml、5mg/ml和10mg/ml)的情况下用0.25u/ml、0.5u/ml或1u/ml浓度的radamts13孵育vwf底物后产生的二聚体176kda vwf裂解片段的代表性实例与不含血红蛋白的反应(0mg/ml)相比。第一次目视检查清楚地显示，与没有添加血红蛋白的对照反应相比，176kda vwf裂解片段的信号随着添加到各种radamts13滴度的裂解反应中的血红蛋白浓度增加而下降。在没有血红蛋白的情况下，0.25u/ml、0.5u/ml和1u/ml radamts13的对照反应显示176kda二聚体vwf裂解片段的剂量依赖性增加。
[0262]
为了证实该目视检查，进行了176kda片段的光密度评估，并评估了含有血红蛋白的测试样品相对于不含血红蛋白的相应对照的信号密度。表2和图2显示了不同radamts13浓度(0.25u/ml、0.5u/ml和1u/ml)的光密度和图像评估，每种浓度与4种不同浓度的血红蛋白(0.5mg/ml、1mg/ml、5mg/ml和10mg/ml)孵育。如第3.2节所述，未添加血红蛋白的对照样品设置为100％，并与血红蛋白浓度增加的相应radamts13浓度的样品进行比较。根据第3.3节中描述的公式，结果表示为百分比。表2.二聚体176kdavwf裂解片段的光密度评估：血红蛋白浓度增加的抑制作用评价a基于frets-vwf73活性结果的radamts13浓度b比率[％]＝含血红蛋白样品的(平均)强度值/不含血红蛋白的对照样品的(平均)强度值*100
[0263]
对于1u/mlradamts13，逐步增加的血红蛋白浓度(0.5mg/ml、1mg/ml、5mg/ml和10mg/ml)显示比率介于59％和11％之间。类似地，0.5u/ml radamts13显示比率介于69％和20％之间，而对于0.25u/ml radamts13，显示比率介于65％和21％之间。表2和图2中描述的结果证实了增加血红蛋白浓度对adamts13介导的vwf裂解的抑制作用。
[0264]
4.2 radamts13浓度对血红蛋白对adamts13介导的vwf多聚体裂解的抑制作用的压倒作用
[0265]
对先前描述的先导实验结果的目视检查表明，在恒定的血红蛋白浓度下，增加radamts13的浓度可以克服血红蛋白对vwf裂解的干扰作用。
[0266]
为了更详细地表明适当浓度的radamts13能够压倒血红蛋白对vwf多聚体裂解的抑制作用，选择以下radamts13浓度：0.25u/ml、0.5u/ml、1u/ml和2u/ml，并选择以下血红蛋白浓度：0.1mg/ml、0.5mg/ml和1mg/ml。
[0267]
图3显示了在具有恒定血红蛋白(0.1mg/ml、0.5mg/ml和1mg/ml)但不同radamts13浓度(0.25u/ml、0.5u/ml、1u/ml和2u/ml)的样品的vwf特异性免疫印迹中产生的二聚体176kda vwf裂解片段，与在同一免疫印迹上分离的未添加血红蛋白的相应对照进行比较。表3和图4中描述了图3中所示免疫印迹的相应光密度和图像评估。不含血红蛋白的对照样品设置为100％，与含有血红蛋白的各个样品互相关联。结果表示为二聚体176kda vwf裂解产物的百分比。表3.二聚体176kdavwf裂解片段的光密度评估：评估压倒血红蛋白抑制作用的潜在radamts13浓度a基于frets-vwf73活性结果的radamts13浓度b比率[％]＝含血红蛋白样品的(平均)强度值/不含血红蛋白的对照样品的(平均)强度值*100
[0268]
在0.1mg/ml的最低血红蛋白浓度下，radamts13浓度增加的重构adamts13介导的vwf裂解。1u/ml radamts13的重构程度接近于不含血红蛋白的对照样品中vwf裂解的程度。在裂解反应中存在0.5mg/ml血红蛋白的情况下，与相应缺乏血红蛋白的对照相比，逐步增加radamts13浓度逐渐使vwf裂解比例从24％增加到69％。同样，在1mg/ml血红蛋白浓度下观察到radamts13的剂量依赖性压倒作用，尽管在2u/ml的最高radamts13浓度下，与没有血红蛋白的裂解条件相比，仅产生了约19％的vwf裂解片段。这些结果表明，在1mg/ml血红蛋
白时，需要大于2u/ml的radamts13浓度来克服血红蛋白干扰。
[0269]
总之，结果表明radamts13具有克服血红蛋白对vwf裂解的抑制作用的剂量依赖性效果。
[0270]
4.3在加入radamts13之前预孵育血红蛋白和rvwf的效果
[0271]
在将radamts13添加到反应混合物之前，还进行了有或没有血红蛋白和rvwf的预孵育(30分钟，在2500rpm的恒定涡流下)的实验。目的是调查当血红蛋白有时间预占vwf结合位点时vwf的可及性是否受到影响，这些结合位点假定会干扰adamts13结合及其裂解。
[0272]
图5显示了三种radamts13浓度(0.25u/ml、0.5u/ml和1u/ml)的裂解反应，在有或没有0.5mg/ml和1mg/ml血红蛋白与rvwf的预孵育的情况下进行。二聚体176kda裂解产物通过多克隆抗vwf抗体hrp偶联物可视化。表4和图6中描述了相应的光密度和图像评估。表4.二聚体176kdavwf裂解片段的光密度评估：评估预孵育或未预孵育的裂解反应a基于frets-vwf73活性结果的radamts13浓度b比率[％]＝含血红蛋白样品的(平均)强度值/不含血红蛋白的对照样品的(平均)强度值*100
[0273]
在进行或不进行血红蛋白与rvwf的预孵育的情况下，显示了血红蛋白对radamts13介导的vwf裂解的剂量依赖性抑制。可以通过增加radamts13浓度来克服血红蛋白的干扰作用。
[0274]
在有或没有预孵育血红蛋白和rvwf的反应混合物中产生的二聚体vwf裂解片段的光密度评估显示如下：(i)在血红蛋白和rvwf预孵育时间后补充的radamts13能够裂解vwf，因此表明预先占据rvwf的血红蛋白被radamts13竞争性置换，并且(ii)rvwf裂解的程度在有或没有预孵育的反应混合物中是不同的。
[0275]
在预孵育的情况下，rvwf被裂解的程度比未预孵育更高：在0.25u/ml至1u/ml的radamts13浓度下，在0.5mg/ml血红蛋白时二聚体176kda裂解产物的比例在59％至87％之间，在1mg/ml血红蛋白时为44％至68％。相比之下，当radamts13和血红蛋白与rvwf同时孵育时，产生的rvwf裂解片段更少：在0.25u/ml至1u/ml的radamts13浓度下，二聚体176kda裂解产物的比例在0.5mg/ml血红蛋白时为23％至43％，在1mg/ml血红蛋白时为14％至38％。
[0276]
这些结果证实了公开的增加血红蛋白浓度对adamts13介导的裂解的抑制作用。血红蛋白浓度在患者的急性镰状细胞相关事件期间观察到的细胞外血红蛋白(echb)范围内(通常为20-330μg/ml，在血管闭塞危象期间》400μg/ml)。此外，已证明适当浓度的radamts13在体外可以压倒血红蛋白的抑制作用。实施例2在tim townes小鼠中使用adamts13进行的药代动力学/药效学研究
[0277]
本研究的目的是评价在正常氧气条件下，在tim townes ss小鼠中单次静脉内(iv)弹丸注射给药后radamts13(在本实施例中称为shp655)的药代动力学特征和功效。
[0278]
本研究选择静脉内(iv)给药途径，因为该途径已被识别为人类暴露途径。
[0279]
研究shp655pk/pd的剂量依赖性需要剂量水平。在先前的研究中已经向该小鼠品系施用了最高剂量(参见国际申请公开号wo/2018/027169的实施例7，其通过引用整体并入本文)。1.动物程序和实验设计
[0280]
总共78只雄性tim townes ss小鼠被分配到四个研究组，如表5所示。动物获自jackson实验室(us)或charles river实验室(苏兹菲尔德,德国)，交货时的年龄范围为4-8周。到达动物护理机构后，所有动物均由合格的兽医人员进行全身体检，以确保其健康状况正常。从交货日起，动物被隔离至少5天。将动物圈养在隔离的通风笼(ivc-gm500)中，并保持在20-24℃的目标温度、40-70％的目标相对湿度和1:1的明暗比(12小时光：12小时黑暗；人工照明)。动物被关在单独的笼子里，每两周更换一次笼子。每小时允许换气》60次。动物接受ssniff r/m-haltung饮食(ssniffgmbh，索斯特，德国)和随意饮水。提供床上用品、筑巢材料和干草(abedd lab和vet service gmbh，维也纳，奥地利)。在研究开始前监测体重，并记录护理人员的日常临床观察和临床体征。对于安乐死，应用人道终点并分离组织病理学样品，速冻并固定在4％磷酸盐缓冲甲醛中以供进一步分析。如果可能或因为需要，对计划外死亡的动物进行尸体剖检。使用过量的戊巴比妥或在颈椎脱位的深度麻醉下对动物实施安乐死。
[0281]
动物接受个体编号并根据表5中所示的标记方案用无法消除的墨水标记。表5.研究组、动物编号和o2浓度组测试品剂量(iu/kg)每组动物数动物编号a缓冲液ana61-6bshp655300247-30cshp65510002431-54dshp65530002455-78na：不适用ashp655缓冲液包含2mm氯化钙、20mm l-组氨酸、3％甘露醇、1％蔗糖、0.05％聚山梨醇酯80，ph 6.9-7.12.测试品和对照品的准备
[0282]
a至d组的测试品和对照品在注射当天新鲜制备。使冻干的shp655(冷冻保存)达到室温。测试品在制剂缓冲液(氯化钙(2mm)、l-组氨酸(20mm)、甘露醇(3％w/w)、蔗糖(1％w/w)和聚山梨醇酯80(0.05％w/w)w)，ph 6.9-7.1)中含有radamts13。对照品含有shp655的制
剂缓冲液。shp655在5ml无菌注射用水(批号vn549058，baxalta innovations gmbh)中重构。重构后，shp655在室温下保持至少一分钟，然后轻轻旋转以确保完全溶解。对于注射，重构的shp655用shp655的制剂缓冲液稀释(表6)。shp655的缓冲液(溶剂)作为对照注射。完成后，通过缓慢倒转轻轻混合制剂。将最终稀释液装在装有湿冰的盒子中，装在带有标记的管(研究编号/组/剂量)中，管内装有用于处理对应组的合适体积。最终稀释液保存在冰上并在3小时内应用于动物。表6.测试品的制剂(例如，对于30克重量的小鼠)对于30克重量的小鼠)na：不适用ashp655储备液(stock)浓度为364iu/ml。3.shp655的施用
[0283]
测试品和对照品一次通过侧尾静脉注射到有意识、受约束的动物中，并且是基于注射前一天记录的个体动物的最新体重。给药体积为10ml/kg。给药前和给药后的制剂样品(100μl等分试样)在深度冷冻(《-60℃)下储存。
[0284]
给药当天被指定为第0天。给药后，如本实施例的第1部分中所述，监测动物并记录结果。4.血液采样
[0285]
在给药后0.083(5分钟)、3、14和24小时，而仅在溶剂给药后14小时，对血液进行采样(n＝6每个时间点)。
[0286]
4.1眼眶穿刺
[0287]
仅从给药后14小时处死的小鼠收集眼眶血液(0.3ml edta血液)。
[0288]
在采血之前即刻，使用uno-univentor 400麻醉单元，用异氟醚(批号6065016，intervet，奥地利)麻醉动物。然后通过抓住颈部皮肤皱襞来约束动物，并将玻璃毛细管小心地插入靠近眼角正中的神经丛中。毛细血管在眼睛后面轻轻旋转，直到血液开始流过毛细血管。然后将玻璃毛细管从眼睛中拉出，将血滴收集在清楚标记的edta管(批号160805，greiner bio-one)中。达到所需体积后，放松颈部抓持并通过将无菌棉垫轻轻按压在眼睛上来止血。将管盖上，缓慢倒转轻轻混合样品。
[0289]
4.2心脏穿刺
[0290]
收集终末心脏穿刺血(0.5-0.7ml血液)用于分析adamts13活性(所有时间点：0.083、3、14和24小时)和本实施例第7节中列出的一些参数。
[0291]
为此目的，将动物麻醉(约100-150mg酮他索[盐酸氯胺酮；批号6680115，ogris pharma gmbh] 10-20mg[盐酸甲苯噻嗪；批号kpoagna，德国拜耳]，用氯化钠[批号19hl27wb，fresenius，奥地利]稀释，体积为10ml/kg)，并用配备25g针头的2ml注射器收集血液，无需打开胸部或穿刺肝脏。缓慢且小心地抽取血液以防止循环/心脏衰竭。然后将针从注射器中取出，将样品转移到单独标记的肝素锂管(批号7071511，sarstedt)中。将管盖上，然后通过缓慢倒转轻轻混合样品。肝素锂血用于血浆制备。
[0292]
4.3肝素血浆的制备
[0293]
尽快离心所有肝素化血样。肝素血样在室温下以2200g离心10分钟。用塑料移液管将上清血浆转移到第二个干净且清楚标记的eppendorf管中。当将上清液转移到第二个eppendorf管中时，要小心避免与血浆一起取出“血沉棕黄层”中的任何细胞。进行第二次离心(血浆上清液)(2200g，室温下5分钟)。用塑料移液管(无沉淀细胞)再次小心地将血浆移入清晰标记的eppendorf管中。在所有时间点，分析了血浆的adamts13活性和本实施例第7部分中的一些参数。5.adamts13活性分析
[0294]
所有肝素血浆样品的adamts13活性用frets-vwf73测定法分析。简而言之，frets-vwf73是adamts13的荧光猝灭底物。它是一种由人vwf(d1596
–
r1668)的a2结构域的73个氨基酸组成的肽，包括adamts13的裂解位点(y1605
–
m1606)。未裂解的frets-vwf73的荧光信号通过荧光团和淬灭剂之间的荧光共振能量转移被淬灭剂淬灭。adamts13对frets-vwf73底物的裂解会产生由荧光团和猝灭剂之间的空间距离引起的荧光信号。荧光团在340nm处被激发并在450nm处发光。血浆样品在样品稀释缓冲液中稀释至预估的adamts13活性为80m u/ml至5m u/ml。稀释的标准品(具有确定的1u/ml adamts13活性的正常人血浆)、对照品和血浆样品(均以每孔100μl添加)在96孔微孔板中与每孔100μl的frets-vwf73底物混合，以开始frets-vwf73和adamts13的裂解反应。在一小时期间内，每5分钟用荧光分光光度计测量该过程。在这段时间内信号的增加对应于样品中的adamts13活性。6.器官的分离
[0295]
从所有组中分离出选定的器官(例如，肺、肾、脾和肝)(仅在14小时时间点)。对于所有组，一部分固定在适当的溶液中(例如，4％磷酸盐缓冲甲醛)，另一部分在液氮中冷冻。
[0296]
将固定在4％磷酸盐缓冲甲醛(批号16b160010，vwr chemicals prolabo)中的组织(肺、肾和肝)送去进行组织病理学分析。将液氮中(在2ml eppendorf管中)的新鲜冷冻组织(肺、肾和肝)送至nmi tt(德国罗伊特林根)进行探索性分析。7.其他参数
[0297]
分析了以下参数：vwf活性水平、vwf抗原水平、vwf多聚体、vwf裂解片段和游离血红蛋白水平。
[0298]
7.1 vwf活性测定
[0299]
根据zymutest vwf:cba(hyphen biomed，155，rued’eragny，f95000 neuville-sur-oise，法国)的产品说明书进行vwf:cba。
[0300]
在第一步中，将稀释的校准物、对照物和样品引入到纤维状胶原蛋白(马，1型和3型)包被的微孔中。当vwf存在时，vwf通过其胶原结合活性被捕获到固相上。洗涤步骤后，加入免疫偶联物，其为与辣根过氧化物酶(hrp)偶联的多克隆抗体，并使其与固定化vwf的游
离表位结合。在洗涤步骤之后，在过氧化氢(h2o2)存在下，应用过氧化物酶底物3,3',5,5'
–
四甲基联苯胺(tmb)，并显出蓝色。当用硫酸停止反应时，得到黄色。显色量与测试样品中人vwf:cba的浓度成正比。
[0301]
7.2 vwf抗原测定
[0302]
根据asserachrom vwf:ag(diagnostica stago，asni
è
res sur seine，法国)的产品说明书进行测定。
[0303]
简而言之，vwf被预先包被在塑料微孔板孔上的兔多克隆抗人vwf:ag抗体捕获。接下来，与过氧化物酶偶联的兔抗人vwf抗体与结合的vwf的游离抗原决定簇结合。结合的酶过氧化物酶通过其对tmb底物的作用来显示。用0.5n硫酸停止反应后，颜色的强度与样品中最初存在的vwf浓度成正比。
[0304]
7.3 vwf多聚体测定
[0305]
通过水平sds琼脂糖凝胶电泳分析vwf的多聚体结构。低分辨率(1％琼脂糖)条件用于分析vwf多聚体的大小分布。样品根据其vwf:ag含量进行稀释，并与tris-edta-sds缓冲液一起孵育。然后在非还原条件下在琼脂糖凝胶上分离多聚体。通过使用bio-rad(里士满，加利福尼亚州，美国)的化学发光检测试剂盒(clarity western ecl)，使用多克隆兔抗人vwf抗体随后用hrp偶联的山羊抗兔igg进行免疫检测，来可视化vwf多聚体。vwf多聚体用ccd相机可视化，并记录了肉眼可计数的vwf多聚体的数量。
[0306]
7.4游离血红蛋白测定
[0307]
通过由abcam(ab157707)提供的商业夹心酶联免疫吸附测定(elisa)分析血浆样品中的游离人血红蛋白。人血红蛋白体外测定范围为3.13ng/ml～200ng/ml，灵敏度为0.845ng/ml，精密度低于10％。
[0308]
在该测定中，血浆样品中存在的血红蛋白与已吸附到聚苯乙烯微量滴定孔表面的抗血红蛋白抗体反应。通过洗涤去除未结合的蛋白质后，加入与hrp结合的抗血红蛋白抗体。这些酶标抗体与之前结合的血红蛋白形成复合物。在另一个洗涤步骤之后，通过添加显色底物3,3',5,5'-tmb检测与免疫吸附剂结合的酶。结合酶的数量直接随测试样品中血红蛋白的浓度变化；因此，450nm处的吸光度是测试样品中血红蛋白浓度的量度。测试样品中的血红蛋白量可以从由标准品构建的标准曲线内推，并针对样品稀释度进行校正。8.统计分析
[0309]
使用graphpad prism version 7.03进行统计分析。
[0310]
用phoenix winnonlin 6.3版(pharsight)进行药代动力学分析。使用稀疏抽样设计评估药代动力学数据，即连续抽样设计，其中在研究的时间点之一，每只动物仅采集一个样品。
[0311]
使用非房室方法计算shp655活性浓度的药代动力学参数。
[0312]
从在b、c和d组中测量的每个血浆浓度中减去shp655的平均基线浓度值(在a组中测量的)(见表10)。
[0313]
在所有时间点给出最大平均浓度的浓度用作输注后最大浓度(c
最大
)的估计值，并通过算术平均值总结。观察到达到c
最大
浓度的最短时间定义为t
最大
。还计算了浓度-时间曲线从0到具有可量化的浓度的最后一个采样时间点下的面积、浓度-时间曲线下的总面积、终末半衰期、平均停留时间、总清除率(total clearance)、稳态分布体积、增量恢复
(incremental recovery)(计算为c
最大
/剂量)。以u/kg为单位的实际剂量用于计算。9.结果
[0314]
9.1剂量溶液分析
[0315]
剂量溶液分析的结果报告在表7中。表7.剂量溶液分析表7.剂量溶液分析
[0316]
9.2年龄、身体和器官重量
[0317]
平均体重和年龄范围报告于表8中。表8.动物的平均体重和年龄
[0318]
在给药后14小时处死的动物的身体和器官重量报告在表9中。表9.身体和器官重量
sd：标准差；从14小时的时间点开始，每组n＝6只动物
[0319]
9.3临床症状和死亡率
[0320]
动物b9在给药前死亡并且没有被替换。
[0321]
给药后，除动物c36外，所有小鼠均未观察到临床症状，动物c36在以1000iu/kg给药后(5分钟采样前)即刻死亡。
[0322]
在这种小鼠品系中，由于它们的疾病，自发死亡并不罕见(ryan等，science；278(5339)：873-6，1997)。在内部观察到随着年龄增长而自发死亡，伴随着疾病状态的增加(小鼠在1-2个月大时被供给，并在内部生长直到实验年龄，即4-5个月)。
[0323]
9.4 adamts13活性
[0324]
adamts13活性报告在表10中并且也显示在图10a-10b中。表10.adamts13活性a基线背景(0.469u/ml)来自a组动物的平均浓度。从每只动物的浓度中减去它，得到每只动物没有背景结果的浓度。b动物b10的数据不考虑用于药代动力学分析，因为该动物很可能存在给药错误。
[0325]
9.5药代动力学
[0326]
图10a和10b中报告了shp655的血浆浓度-时间的曲线。shp655的药代动力学参数报告于表11。表11.shp655的药代动力学参数汇总auc0-inf：血浆浓度-时间曲线下的总面积；auc0-t：浓度-时间曲线从0到最后采样时间点(24小时)下的面积；cl：总清除率；c
最大
：输注后的最大浓度；ir：增量恢复；mrt：平均停留时间；t
1/2
：终末半衰期；vss：稳态分布体积air计算为c
最大
/实际剂量。300iu/kg的实际剂量为325iu/kg，1000iu/kg的实际剂量为1160iu/kg，3000iu/kg的实际剂量为3103iu/kg。
[0327]
auc暴露呈线性剂量依赖性。清除率低，半衰期长。稳态分布体积较低，但高于血浆容积，表明shp655除血浆外还分布到其他组织。由于研究设计有限(外推auc的百分比为32-42％)，必须谨慎考虑pk参数。
[0328]
9.6 vwf活性/抗原和血浆血红蛋白浓度
[0329]
使用zymutest vwf:cba活性测定和asserachrom vwf:ag elisa测定vwf活性和抗原水平。vwf活性/抗原比显示在图8a-8c中。
[0330]
根据制造商的说明使用商业elisa分析血浆样品中的游离血红蛋白。血浆血红蛋白浓度示于图9a-9c。
[0331]
9.7组织病理学
[0332]
分析了来自在14小时处死的动物的肝、肾和肺。
[0333]
肝脏切片的特征在于存在轻度至中度严重程度的凝固性坏死的局灶性至多灶性融合区域，其倾向于靠近门静脉三联征。在某些区域，混合性炎症(浆细胞、淋巴细胞、单核细胞、偶尔的中性粒细胞和嗜酸性粒细胞)与坏死有关，而在其他区域，这种炎症在远离坏死区域的邻近实质中被隔离。有时会出现凝固性坏死区域而没有相关的炎症。在坏死和炎症区域或附近存在金棕色色素(解释为胆汁或含铁血黄素)。在其他区域，这种金棕色色素存在于单个肝细胞中(即胆汁淤滞)。肝脏切片还包含充满红细胞的血管(最可能是门静脉)，以至于难以区分单个红细胞(也更符合止血而非淤血)。在一些小鼠中也有血管弥漫性受累，而在其他小鼠中只有3到4条血管受累，这些血管往往位于门脉三联征区域，但在所有小鼠中都保留了中央静脉。在不同的不同组中，这些发现的严重程度没有差异。
[0334]
在几只小鼠的肝脏中也观察到弥漫性肝细胞巨细胞/核巨细胞肥大(一种在转基因小鼠中常见的非特异性特征)。
[0335]
来自所有组的几只小鼠的肾脏在皮质-髓质交界处显示血管淤血。这种淤血在接受0或300iu/kg shp655的小鼠中观察到的严重程度为轻度至中度，而在接受1000或3000iu/kg shp655的小鼠中严重程度为最小至轻度，接受3000iu/kg shp655的小鼠基本上表现出完全最小的严重性(包括一只没有淤血的老鼠)。这表明在本研究中较高剂量的shp655有一些治疗效果。
[0336]
所有剩余的肾和肺的发现是实验室小鼠中常见的典型背景发现。
[0337]
与溶剂组相比，shp655处理的tim townes ss小鼠在adamts13给药后14小时在中等剂量和高剂量显示出vwf活性/抗原比的显著降低(p《0.05)。这些结果与提出的shp655在scd中的作用机制一致，表明超大vwf多聚体的浓度降低。
[0338]
与溶剂组相比，shp655处理的tim townes ss小鼠在adamts13施用后24小时在中等剂量和高剂量显示出游离血红蛋白浓度的显著降低(p《0.05)。
[0339]
连同adamts13活性数据，这些结果表明，对shp655的药效学反应存在延迟。shp655的最大作用不是在adamts13的最大血浆浓度处(给药后5分钟)，而是在14小时(对于vwf活性/抗原比而言)和24小时(对于游离血红蛋白浓度而言)。实施例3adamts13在镰状细胞病动物模型中的功效研究
[0340]
该探索性功效研究的目的是研究在缺氧条件下在tim townes小鼠中静脉内施用shp655后重组adamts13(在本实施例中称为shp655)的剂量依赖性功效。
[0341]
在tim townes小鼠中在7.0％氧气下研究了shp655功效。
[0342]
与实施例2类似，本研究选择了静脉内给药途径，因为该途径已被识别为人类暴露途径。300、1000和3000iu/kg shp655的剂量水平是基于先前的研究(参见国际公开号wo/2018/027169的实施例7，其通过引用整体并入本文)选择的，为了揭示shp655的剂量依赖性效应。1.动物程序和研究设计
[0343]
总共24只雄性tim townes ss小鼠(hbb
tm2(hbg1,hbb*)tow
纯合子，hba
tml(hba)tow
纯合子)购自jackson实验室(us)，并通过两次不同的运输获得，其中所有动物都进入体重和年龄相当的预定生命阶段。交货时的年龄范围为4-8周。到达动物护理机构后，所有动物均由合格的兽医人员进行全身体检，以确保其健康状况正常。从交货日起，动物被隔离至少5天。将动物圈养在隔离的通风笼(ivc-gm500)中，并保持在20-24℃的目标温度、40-70％的目标相对湿度和1:1的明暗比(12小时光：12小时黑暗；人工照明)。每笼饲养1-3只动物，每周更换笼子。每小时允许换气》60次。动物接受ssniff r/m-haltung饮食(ssniffgmbh，索斯特，德国)和随意饮水。提供床上用品、筑巢材料和干草(abedd lab and vet service gmbh，维也纳，奥地利)。从交货当天开始每周监测动物体重一次，并记录护理人员的每日临床观察和临床体征。对于安乐死，应用人道终点并分离组织病理学样品，速冻并固定在4％磷酸盐缓冲甲醛(批号18f090001，vwr international)中以供进一步分析。如果可能或需要，对计划外死亡的动物进行尸体剖检。使用过量的氯胺酮/甲苯噻嗪(ogris pharma gmbh)或通过颈椎脱位在深度麻醉下对动物实施安乐死。
[0344]
根据表12中所示的标记方案，动物接受个体编号并用无法消除的墨水进行标记。表12.研究组、动物id和o2浓度2.测试品和对照品的准备
[0345]
测试品和对照品是在注射当天新鲜制备的。使储存在 2至 8℃的冻干shp655达到室温。测试品在制剂缓冲液(氯化钙(2mm)、l-组氨酸(20mm)、甘露醇(3％w/w)、蔗糖(1％w/w)和聚山梨醇酯80(0.05％w/w)，ph6.9-7.1)中含有radamts13。shp655在5ml无菌水(swfi，批号vn549058，baxalta innovations gmbh)中重构。重构后，将测试制品在室温下保持至少一分钟，然后轻轻旋转以确保完全溶解。为了注射，用shp655的制剂缓冲液稀释重构的测试品。shp655的缓冲液(溶剂)作为对照注射。完成后，通过缓慢倒转轻轻混合制剂。最终稀释液装在装有湿冰的盒子中，装在合理标记的管(研究编号/组/剂量)中，管内装有用于处理对应组的合适体积。最终稀释液保存在冰上并在3小时内应用于动物。3.给药
[0346]
基于注射前一天最新记录的个体动物的体重，通过侧尾静脉将测试品和对照品一次注射到有意识、受约束的动物中。在开始给药之前和完成给药之后，将制剂(100μl)冷冻
储存(《-60℃)。
[0347]
给药当天被指定为第0天。给药后，如本实施例的第1部分中所述，监测动物并记录发现。4.缺氧研究
[0348]
使用biospherix hypoxia腔室系统(oxycycler model a84xov，美国)并根据制造商的方案进行缺氧研究。由于缺氧室的容量有限，并且为了在缺氧挑战期间对tim townes ss小鼠进行良好的行为评估，每天调查的小鼠总数限制为12只。因此，在最多三个连续工作日的时间范围内执行不同的缺氧实验。持续监测和记录关注“移动性”和“呼吸频率”参数的个体动物的损伤。将达到规定的人道终点的动物从缺氧室中取出并实施安乐死。尽管腔室的打开和关闭很快完成，但无法阻止氧气浓度的瞬时增加。
[0349]
给药后约1小时，将tim townes ss小鼠置于缺氧室中并在7.0％缺氧条件下保持5小时，然后在21％氧气下保持1小时。
[0350]
在腔室中达到21％o2后，停止软件程序“腔室o2配置文件”并打开腔室的门。在1小时的恢复阶段，一名熟练的操作员决定个体动物是否恢复或因达到人道终点之一而必须安乐死。存活的动物用于终末心脏穿刺。5.行为观察
[0351]
在暴露于7.0％缺氧后的恢复阶段完成后，由行为药理学家和兽医进行全面的行为观察。按照shirpa指南(rogers等人，mamm genome.8(10):711-3，1997)对每只小鼠的行为症状进行单独筛选，以监测irwin(irwin等，psychopharmacologia.13(3)：222-57，1968)先前描述的疾病症状。特别地，选择了用于在恢复阶段检查动物的行为项目(包括：一般外观、姿势、自发和诱发活性)，从中可以估计恢复状态。对这些项目进行定量评分，以便将更高的数字分配给更严重的症状(表13)。表13.行为分数量表
6.血液采样
[0352]
6.1心脏穿刺
[0353]
在观察期结束时或达到人道终点后，进行终末心脏穿刺。
[0354]
为此目的，将动物麻醉(约100-150mg氯胺酮[批号6680117，ogris pharma gmbh] 10-20mg甲苯噻嗪[批号7630217，ogris pharma gmbh]，用nacl(批号f0718,medipharm)稀释/kg腹腔注射)，并在不打开胸部或刺穿肝脏的情况下用装有25g针头的注射器(2ml)收集血液。缓慢且小心地抽取血液以防止循环/心脏衰竭。然后将针头从注射器中取出，然后将样品转移到明确标记的edta管(250μl；批号a18033ec，greiner ag)中，并转移到单独标记的肝素锂管(批号8073011，sarstedt ag&co.kg)中(剩余血体积)。将管盖上，然后通过缓慢倒转轻轻混合样品。肝素锂血用于血浆制备(见本实施例的第6.2节)。
[0355]
6.2肝素血浆的制备
[0356]
尽快离心所有肝素化血样。肝素血样在室温下以2200g离心10分钟。用塑料移液管将上清血浆转移到第二个干净且清楚标记的eppendorf管中。小心避免被“血沉棕黄层”层中的任何细胞污染，并将样品转移到第二个标记的eppendorf管中。进行第二次离心(血浆上清液)(2200g，室温下5分钟)。用塑料移液管(无沉淀细胞)再次小心地将血浆移入清晰标记的eppendorf管中。对所得血浆进行以下部分报告的分析。7.血浆样品分析
[0357]
收集的小鼠样品用于分析shp655(adamts13)活性和抗原；vwf活性和抗原以及游离血红蛋白的水平。
[0358]
7.1 adamts13活性测定(frets-vwf73测定)
[0359]
frets-vwf73测定是一种测量人adamts13活性的荧光测定。
[0360]
frets-vwf73是一种合成的荧光肽，由来自覆盖adamts13裂解位点的vwf a2结构域的73个氨基酸组成，用作测量adamts13活性的最小肽基底物。该肽用两个荧光残基(供体和受体＝淬灭剂)修饰。未裂解肽底物的激发(λex＝340nm)导致供体和邻近淬灭剂之间的荧光共振能量转移(fret)，并且无法发射荧光。adamts13裂解肽底物后，由于供体和淬灭剂
的空间分离，不会发生淬灭，并且可以发射荧光(λem＝450nm)并进行量化。
[0361]
简而言之，将样品稀释(总体积为100μl)，转移至微量滴定板，并通过添加底物(100μl frts-vwf73；2μm终浓度)开始反应。在荧光分光光度计中，在30℃下，λex＝340nm和λem＝450nm，每两分钟测量一次荧光演变，持续60分钟。荧光强度的增加与样品中的adamts13活性浓度成正比。样品针对稀释的混合正常人血浆的参考标准品(工作范围为0.08至0.005u/ml)进行测量。来自george king bio-medical的人血浆(混合)用作参考制剂，其中adamts13浓度估计为1u/ml。所得的frets-vwf73活性数据以u/ml表示。
[0362]
7.2 adamts13抗原测定
[0363]
adamts13 ag elisa测定采用定量夹心酶免疫测定技术，使用内部(即baxalta，orth，奥地利)开发的抗adamts13抗体。简而言之，用多克隆豚鼠抗人adamts13 igg包被微量滴定板，然后用含有人血清白蛋白的封闭溶液封闭非特异性结合位点。然后以每孔100μl的总体积孵育测试样品、重组标准品和质量对照样品。几个洗涤步骤后，通过添加多克隆兔抗人adamts13抗体，然后添加hrp偶联的驴抗兔igg并添加ultra tmb底物，来检测特异性结合。通过添加1.9m h2so4终止显色反应，并在分光光度计上在450nm和620nm(背景校正)处读取od。450nm处od的增加与样品中的adamts13抗原浓度成正比。针对纯化的radamts13的对照制剂测量样品，该对照制剂被连续稀释并用作参考标准品。通过多项式回归(二阶)拟合参考标准曲线，然后计算测试样品的adamts13抗原浓度。adamts13抗原以μg/ml表示。
[0364]
7.3 vwf活性测定
[0365]
根据zymutest vwf:cba(hyphen biomed，155，rued’eragny，f95000neuville-sur-oise，法国)的产品说明书进行vwf:cba，如实施例2的第7.1节所述。
[0366]
7.4 vwf抗原测定
[0367]
根据asserachrom vwf:ag(diagnostica stago，asni
è
res sur seine，法国)的产品说明书进行测定，如实施例2的第7.2节所述。
[0368]
7.5 vwf多聚体测定
[0369]
如实施例2的第7.3节所述，通过水平sds琼脂糖凝胶电泳分析vwf的多聚体结构。
[0370]
7.6游离血红蛋白测定
[0371]
如实施例2的第7.4节所述，通过由abcam(ab157707)提供的商业夹心elisa分析血浆样品中的游离人血红蛋白。8.统计方法
[0372]
使用graphpad prism version7.03进行统计分析。使用单向方差分析(anova)分析数据，其中p值小于0.05的差异被认为是显著的。9.结果
[0373]
9.1动物的体重和年龄
[0374]
用于指定研究的纯合tim townes ss小鼠获自jackson实验室。基于在交货当天(第0周)开始的体重监测，动物显示出相似的平均体重增加，并且在探索性存活研究中包括平均年龄为18至19周的动物(见表14)。表14：探索性生存研究中动物的平均体重和年龄
[0375]
在实验执行过程中，三只动物(e37、f44和h52)的结果揭示了不寻常的表型发现(例如异常的血液学特征)。动物的死后基因分型显示杂合单倍型。因此，受影响的动物被排除在进一步的分析之外。
[0376]
9.2在7.0％氧气下的实验
[0377]
在7.0％缺氧条件下研究了shp655的体内功效。为此，每组六只tim townes ss小鼠在开始暴露于7.0％的o2浓度前一小时接受300、1000或3000u/kg shp655，然后在21％o2下进行一小时恢复阶段(研究组e-h)。在缺氧阶段，由熟练的专业人员持续监测和记录关注“移动性”和“呼吸频率”参数的个体动物的损伤。对达到规定的人道终点的动物实施安乐死。此外，在7.0％o2缺氧条件之后，根据基于shirpa指南的分级量表对在恢复阶段过程中发生的tim townes小鼠的行为症状进行评分。
[0378]
通过终末心脏穿刺获得的血样用于分析游离血红蛋白、adamts13和vwf水平。
[0379]
9.2.1临床症状和死亡率
[0380]
在5小时7.0％缺氧阶段，所有tim townes ss小鼠均显示出经独立治疗的评估的“移动性”和“呼吸频率”参数的严重损害。由于实现人道化，一只用300iu/kg shp655治疗的动物必须被安乐死(图11)。所有其他动物在6小时的观察期中存活下来。此外，所有研究的tim townes ss小鼠都显示在一小时恢复期内评估的“移动性”和“呼吸频率”参数有所改善，所有用3000iu/kg shp655治疗的动物都完全恢复。
[0381]
9.2.2恢复阶段的行为评估
[0382]
在恢复阶段之后，在暴露于7.0％氧气5小时之后，对tim townes ss小鼠进行更全面的行为评估。为此目的，根据基于shirpa指南的分级量表对动物进行评估和评分，其中较高的数字分配给更严重的症状。考虑到疼痛是镰刀危象期间患者哀叹的最常见症状之一，选择竖毛、冷漠、呼吸频率和眼部外观作为动物疼痛/疾病状态的独立衡量指标(ballas等，blood.120(18):3647-56，2012)。小鼠的自发移动被研究作为恢复的替代标志物，假设在缺氧状态下数小时后小鼠会感觉需要四处走动以寻找食物/水。同样，受刺激移动被评估为自发的“逃跑”反应。
[0383]
总之，行为分数指南的使用允许定量测量shp655对动物从缺氧中恢复的影响(图12)。特别是，shp655似乎对动物的恢复显示出剂量依赖性的影响(300u/kg p＝0.051；1000u/kg p《0.05；3000u/kg p《0.01)。
[0384]
图13a-13f总结了单个行为项目的结果，其中一些参数看起来比其他参数更能指示恢复。在测试动物中评分的所有参数中，竖毛(p《0.0001)和受刺激移动(p《0.001)是从缺氧中恢复的最佳单一预测因子(图13a和13f)。此外，用中等剂量(p《0.05)和高剂量(p《0.01)的shp655治疗的小鼠的呼吸也显著改善(图13c)。此外，虽然没有测量到统计学上的显著差异，但与溶剂处理的小鼠相比，shp655处理的tim townes ss小鼠的冷漠和脸部扭曲(眼部外观)有所减少。在这项研究中，作为单一终点观察的自发移动没有显示任何显著差异。
[0385]
9.2.3血浆中的游离血红蛋白
[0386]
根据制造商的说明使用商业elisa分析血浆样品中的游离血红蛋白。
[0387]
在7.0％缺氧挑战后，shp655处理的tim townes ss小鼠和溶剂组之间的游离血红蛋白水平的测定没有显示显著差异(图14)。然而，游离血红蛋白的平均水平以剂量依赖性方式略微下降。
[0388]
9.2.4 adamts13活性和抗原
[0389]
adamts13活性和抗原水平使用特异性frets活性测定和adamts13 elisa进行测定。
[0390]
用shp655处理tim townes ss小鼠导致adamts13的抗原和活性血浆水平的剂量依赖性增加(图15a-15b)。研究的中等剂量和高剂量导致平均活性水平在注射后6小时仍与溶剂组显著不同(1000u/kg p《0.05；3000u/kg p《0.001)。
[0391]
9.2.5 vwf活性和抗原
[0392]
vwf活性和抗原水平使用zymutest vwf:cba活性测定和asserachrom vwf:ag elisa进行测定。
[0393]
图16a-16c显示了vwf活性和抗原血浆水平以及这两个值的计算比率。与溶剂组相比，shp655处理的tim townes ss小鼠在中等剂量和高剂量下显示vwf活性/抗原比显著降低(p《0.05)，而未观察到vwf总抗原浓度的差异。这些结果与提出的shp655在scd中的作用机制一致，表明超大vwf多聚体的浓度降低。
[0394]
9.2.6 vwf多聚体分析
[0395]
还通过水平1％sds琼脂糖凝胶电泳分析了vwf多聚体的大小分布。样品根据其vwf:ag含量进行稀释。
[0396]
来自研究组e至h的个体tim townes ss小鼠的血浆样品的半定量vwf多聚体分析的凝胶显示在图17a-17b中。凝胶分析似乎与相应的vwf活性/抗原值一致。10.讨论与结论
[0397]
在暴露于7.0％o2的过程中，所有tim townes ss小鼠都表现出“移动性”和“呼吸频率”的严重损害。一只用300iu/kg shp655治疗的动物在5小时的7.0％缺氧阶段必须安乐死。
[0398]
在7.0％缺氧挑战后的恢复阶段期间，所有tim townes ss小鼠显示评估的“移动性”和“呼吸频率”参数的改善，其中用3000iu/kg shp655治疗的动物完全恢复。随后根据基于shirpa指南的分级量表进行的更全面的行为分数显示，用1000iu/kg(p《0.05)和3000iu/kg(p《0.01)shp655治疗的动物的恢复显著提高。
[0399]
在暴露于7.0％o2后，动物中游离血红蛋白水平发生轻微的、shp655剂量依赖性降低。血浆adamts13活性和抗原浓度的分析表明，tim townes ss小鼠以剂量依赖性方式暴露于shp655。从7.0％缺氧方法的动物获得的血浆样本中vwf活性和抗原水平的测定表明，在1000u/kg shp655(p《0.05)和3000iu/kg shp655(p《0.05)时，vwf活性/抗原比显著降低。这些发现通过半定量vwf多聚体分析得到证实，表明在用shp655治疗后，tim townes ss小鼠血浆中超大vwf多聚体的水平降低。
[0400]
总之，shp655在1000iu/kg和3000iu/kg的剂量下显著改善了tim townes ss小鼠在暴露于7.0％o2后的恢复并降低了vwf活性/抗原比，这与提出的shp655在scd中的作用机
制一致。
[0401]
该研究还表明，voc后的恢复也可用于为scd小鼠的药理功效研究提供信息。恢复读数证明了shp655在scd人源化小鼠模型中的剂量依赖性功效。
[0402]
已经根据发现或提议的特定实施方案描述了本发明，以包括用于实施本发明的特定模式。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，所描述的发明的各种修改和变化对于本领域技术人员来说将是显而易见的。尽管已经结合特定实施方案描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的本发明不应过度地限于这些特定实施方案。实际上，对于相关领域的技术人员而言显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修改旨在落入所附权利要求的范围内。