用于大规模生产培养食物的培养系统和方法与流程

用于大规模生产培养食物的培养系统和方法
发明领域
1.本发明涉及以商业规模生产培养食物产品，特别是培养肉(cultured meat)，特别是肉切割块(meat cuts)或内脏形式的培养肉的制造。
2.发明背景
3.在过去的几十年里，对用于人类消费、提供至少与肉相当的食用体验和营养价值而没有与基于动物的肉相关的环境危害和道德问题的食物产品有越来越大的兴趣。这种兴趣促进了食品工业和科学界二者对用于生产培养肉(也称为基于细胞的肉、清洁肉、培养肉(cultivated meat)和无屠宰肉)的系统、方法和组合物的研究。
4.制造培养肉产品的挑战包括生产大量细胞，以及在获得大量细胞后生产具有吸引消费者的感官品质，包括可见的外观、质地、风味和香味的产品。另一个挑战是扩大生产工艺，以便大量制造适合人类消费的肉产品。特别具有挑战性的任务是直接生产适合供应的肉部分(meat portion)，而不是单独培养需要被融合或连接以便获得适合供应的肉部分的肉的聚集体或层。
5.在药物研究和制药工业中，已经进行了产生大量哺乳动物细胞并将细胞粘附到基材上的尝试，例如以产生用于治疗用途和用于组织和器官移植的干细胞。例如美国专利第6,911,201号和美国申请公布第2010/0233130号公开了使用稳定期塞流式生物反应器(stationary phase plug-flow bioreactor)产生未分化造血干细胞的方法。在一些实施方案中，该方法包括将未分化的造血干细胞或祖细胞接种到稳定期塞流式生物反应器中，其中三维基质细胞培养物已经预先建立在片形式的基材上，该基材包括形成生理上可接受的三维纤维网络的非织造纤维基质。国际(pct)申请公布第wo2008/152640号公开了将包含造血干细胞的三维基质细胞培养物移植到受体内的方法。
6.美国专利第9,127,242号公开了一种一次性、单组织或多组织(multiple tissue)、器官和移植物生物反应器和环境控制系统。在一些实施方案中，公开了在支架导管上培养血管移植物(vascular graft)。
7.美国专利第9,987,394号公开了一种假体植入物及在生物反应器中产生所述假体植入物的方法。假体植入物包括生物相容性三维支架和选自由成骨细胞、破骨细胞和内皮细胞或其祖细胞组成的组的至少两种细胞类型。
8.美国专利申请公布第2011/0287508号公开了生物反应器和使用它们产生组织工程产品或培养细胞的方法。更具体地，公开了一种基于膨胀床生物反应器的组织和细胞培养方法，在该膨胀床生物反应器中，其上或其中附着、包封或固定有细胞的颗粒的初始静止床具有向上通过该床的流体以形成膨胀床，其中流体用于分离颗粒，即在塞流条件下，使得在培养细胞的步骤期间能够维持颗粒的相对位置以形成组织，并有助于减少颗粒与湍流或对流混合之间的碰撞。
9.国际(pct)申请公布第wo2013/016547号公开了形成为多于一个至少部分融合的层的工程肉产品，其中每个层包含至少部分融合的多细胞体，该多细胞体包含非人肌细胞，并且其中工程肉是可食用的。
10.国际(pct)申请公布第wo2013/116446号公开了产生用于管状器官修复或替换的管状生物工程平滑肌结构以及生物工程组织的方法。该方法可以包括以下步骤：获得平滑肌细胞；培养肌细胞以形成定向平滑肌细胞的平滑肌细胞构建体；将平滑肌细胞构建体置于管状支架周围；以及在生长培养基中培养构建体和支架直到获得平滑肌细胞结构。
11.国际(pct)申请公布第wo2015/038988号公开了可食用的微载体，该可食用的微载体包括适用于在生物反应器中使用以培养可用于形成可食用的工程肉产品的细胞的微载体珠、微球和微型海绵(microsponge)。
12.国际(pct)申请公布第wo2018/011805号公开了一种用于培养细胞的系统，包括用于培养细胞的生物反应器室；将灌注溶液递送到生物反应器室以将灌注溶液灌注通过细胞的递送系统；具有透析器、用于进行透析的透析液和用于降低所述透析液中氨含量的过滤器的透析系统；以及使灌注溶液循环通过透析器并且使透析液循环通过过滤器的控制器。
13.国际(pct)申请公布第wo2018/189738号公开了一种产生混杂食品(hybrid food stuff)的方法。该方法包括将植物来源的物质与一定量的培养的动物细胞组合以便增强混杂食品中肉的感官特性和/或肉的营养特性，其中动物细胞不形成组织，并且其中动物细胞及其物质的量低于混杂食品的30％(w/w)。
14.国际(pct)申请公布第wo2018/227016号公开了用于产生细胞培养食物产品的系统和方法。培养食物产品包括寿司级鱼肉、鱼糜、鹅肝酱和其他食物类型。多种细胞类型被利用以产生食物产品并且可以包括肌细胞、脂肪细胞和/或肝细胞。培养食物产品在无病原体的培养条件下生长，不暴露于毒素和其他不期望的化学物质。
15.国际(pct)申请公布第wo2019/016795号公开了一种产生可食用组合物的方法，包括孵育三维多孔支架和包括以下的多于一种细胞类型：成肌细胞或其祖细胞、至少一种类型的分泌细胞外基质(ecm)的细胞和内皮细胞或其祖细胞，和诱导成肌细胞分化为肌管。
16.没有公开或提出通过在生物反应器内的可食用支架上培养动物细胞使得产生包含支架和由细胞形成的组织的食物产品，来产生培养食物产品诸如培养肉。
17.对于用于提供培养肉产品的成本有效、快速和简单的制造的在商业规模上生产培养食物产品诸如培养肉的系统和方法存在需求。
18.发明概述
19.本发明提供了用于在商业规模上生产培养食物产品，特别是培养肉的系统和方法。
20.本发明的系统和方法包括在培养系统中的至少一个支架上培养非人动物来源的粘附细胞，该培养系统包括至少一个细胞培养生物反应器，通常是多于一个(a plurality of)细胞培养生物反应器。本发明的系统可以有利地向多于一个细胞培养生物反应器提供明确定义的培养基的受控流动，其中培养基供养在支架上生长的细胞，同时不干扰细胞对支架的粘附。根据本发明，流量和培养基组成优选适应细胞的生长速率和/或生长期。通常，培养系统以均匀流量向多于一个细胞培养生物反应器递送培养基，但是本发明的系统也能够实现为单独的细胞培养生物反应器调整流量。
21.根据本发明的培养食物产品包括至少一个三维、多孔、可食用支架和在支架上和支架内由接种到支架的动物细胞形成的组织。有利地并且与迄今描述的用于产生培养肉的方法不同，本发明的系统和方法产生肉部分，而不是需要连接以产生适于供应的肉部分的
单独聚集体或小块。此外，本发明的系统能够实现容易包装的无菌培养食物产品的生产。
22.根据一个方面，本发明提供了一种用于产生培养食物产品的培养系统，包括：
23.(a)一个或更多个细胞培养生物反应器，其中包含接种在至少一个三维多孔可食用支架上的两种或更多种类型的非人动物粘附细胞；和
24.(b)递送系统，所述递送系统被配置成以受控流量将培养基递送到一个或更多个细胞培养生物反应器中，其中流量被调整为滋养接种在至少一个三维多孔可食用支架上的细胞。
25.根据某些实施方案，受控流量被调整以防止在一个或更多个细胞培养生物反应器中的气泡形成。
26.根据一些实施方案，受控流量使得培养基能够以塞流方式在生物反应器内进行循环。
27.在一些实施方案中，该系统还包括一个或更多个摇杆，该摇杆用于在一个或更多个细胞培养生物反应器中径向混合培养基。不希望被任何特定理论或作用机制所束缚，径向混合有助于细胞在接种时在支架上的有效分布以及细胞与支架表面的粘附，促进细胞生长，并有助于培养食物产品的产生。
28.在一些实施方案中，该系统还包括一个或更多个温度控制元件，用于控制所述一个或更多个细胞培养生物反应器内的温度。在一些实施方案中，该系统包括围绕一个或更多个细胞培养生物反应器的一个或更多个加热元件，用于控制所述一个或更多个细胞培养生物反应器内的温度。
29.在一些实施方案中，该系统包括多于一个细胞培养生物反应器。根据这些实施方案，递送系统被配置成以受控流量向多于一个细胞培养生物反应器中的每一个单独递送培养基。均匀培养基以受控流量向多于一个细胞培养生物反应器的递送是本发明培养系统的显著优势，提供了成本有效、可再现的培养食物产品的大规模生产。培养基组成可以有利地适应细胞生长期。根据某些实施方案，培养基组成适于支持细胞增殖期。根据一些实施方案，培养基组成适于支持细胞分化期。根据又其他实施方案，培养基组成适于支持细胞稳定生长期(cell stationary growth phase)。
30.根据某些实施方案，受控流量使得培养基能够以塞流方式在多于一个细胞培养生物反应器中的每一个内进行循环。
31.在一些实施方案中，多于一个细胞培养生物反应器中的每一个单独安装在摇杆上。根据一些实施方案，多于一个细胞培养生物反应器中的每一个由温度控制元件单独控制。在一些特定实施方案中，多于一个细胞培养生物反应器中的每一个单独安装在摇杆上并由加热元件包裹。
32.在一些实施方案中，该系统还包括一个或更多个传感器，用于测量培养基中的至少一个参数，该参数选自由以下组成的组：液位、温度、ph、溶解氧、一种或更多种营养物的浓度以及一种或更多种不期望的化合物的浓度。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。根据某些实施方案，不期望的化合物选自由氨、乳酸盐、乙酸以及其他组成的组。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。
33.在一些实施方案中，该系统还包括与一个或更多个传感器可操作地通信的控制单元，该控制单元被配置成接收至少一个参数的测量值并基于该测量值调整所述至少一个参
数。
34.在一些实施方案中，该系统还包括：
35.(i)培养基贮存器，其用于将细胞生长培养基供应到培养系统中；
36.(ii)处理容器，其被配置成：接收培养基；在培养基中测量选自由以下组成的组的至少一个参数：液位、温度、ph、溶解氧、一种或更多种营养物的浓度以及一种或更多种不期望的化合物的浓度；以及基于所述测量值来调整至少一个参数，其中所述递送系统还被配置成使培养基从一个或更多个细胞培养生物反应器循环到处理容器中。
37.根据某些实施方案，递送系统还被配置成使培养基从处理容器循环到一个或更多个细胞培养生物反应器中。
38.根据某些实施方案，该系统还包括具有透析器和透析液的透析系统，该透析系统被配置成从培养基中去除不期望的化合物，其中递送系统还被配置成将培养基从一个或更多个细胞培养生物反应器或处理容器循环到透析系统中，并随后循环到所述处理容器中。
39.在一些实施方案中，该系统包括透析系统，其中透析液在透析后作为废弃物从透析器流出。
40.在一些实施方案中，处理容器包括：叶轮；用于测量至少一个参数的一个或更多个传感器；一个或更多个端口，其被配置用于添加营养物、用于中和不期望的化合物的中和剂以及两种或更多种类型的非人动物粘附细胞中的至少一种；热交换器；充氧器以及ph控制单元。
41.在一些实施方案中，该系统还包括感测单元，该感测单元被配置成在培养基中测量选自由以下组成的组的至少一个参数：温度、ph、溶解氧、一种或更多种营养物的浓度以及一种或更多种不期望的化合物的浓度。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。
42.根据某些示例性实施方案，感测单元被配置成在培养基中测量包括温度、ph、溶解氧、一种或更多种营养物以及一种或更多种不期望的化合物的参数的组合。
43.在一些实施方案中，该系统还包括控制单元，该控制单元与处理容器以及任选地与感测单元可操作地通信，用于控制调整至少一个参数。根据一些实施方案，控制单元与处理容器可操作地通信，用于控制培养基温度。在一些实施方案中，将处理容器中的培养基温度调整至约为细胞培养生物反应器的温度。
44.在一些实施方案中，控制单元还与递送系统可操作地通信，用于控制培养系统中培养基的流量和组成。根据某些实施方案，根据细胞的生长速率和/或生长期来控制流量。根据某些实施方案，控制单元还与处理容器可操作地通信，用于根据细胞的生长期来控制培养基组成。
45.在一些实施方案中，操作该系统从而以塞流方式将培养基递送至一个或更多个细胞培养生物反应器。根据这些实施方案，塞流量(plug-flow rate)适应于细胞的生长速率。
46.在一些实施方案中，系统以补料分批(fed-batch)模式运行。
47.根据某些实施方案，可食用支架包含按重量计的基于支架的干重的至少10％的蛋白质含量。根据一些实施方案，可食用支架包含按重量计的基于支架的干重的至少20％、至少30％或至少40％的蛋白质含量。
48.在一些实施方案中，可食用支架是植物、真菌或藻类来源的。
49.在一些实施方案中，置于细胞培养生物反应器内的可食用支架是无菌的。
50.选择两种或更多种类型的动物粘附细胞，以使得能够产生期望的肉产品。根据某些实施方案，期望的肉产品包括模仿肉块、肉部分或内脏的细胞组合。根据某些实施方案，内脏选自由肝脏、肾脏、心脏、胰腺、胸腺、大脑、舌和胃组成的组。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。
51.根据某些实施方案，两种或更多种类型的动物粘附细胞选自由以下组成的组：基质细胞、内皮细胞、脂肪细胞、肌细胞、肝细胞、心肌细胞、肾细胞、淋巴细胞、上皮细胞、神经细胞、纤毛上皮细胞、肠细胞、其祖细胞及其组合。根据某些实施方案，两种或更多种类型的动物粘附细胞还包括分泌细胞外基质(ecm)的细胞及其祖细胞。
52.在一些实施方案中，两种或更多种类型的动物粘附细胞选自由以下组成的组：肌细胞、分泌细胞外基质(ecm)的细胞、脂肪细胞、内皮细胞、其祖细胞及其任何组合。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。
53.根据某些实施方案，该系统包括来自单一动物物种来源的细胞。在一些实施方案中，该系统包括来自多于一种不同动物物种来源的细胞。根据某些实施方案，动物是选自由有蹄动物、家禽、水生动物、无脊椎动物和爬行动物组成的组的物种。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。
54.根据某些实施方案，有蹄动物选自由以下组成的组：牛(bovine)、绵羊(ovine)、马、猪、长颈鹿、骆驼、鹿、河马或犀牛。根据一些实施方案，有蹄动物是牛。根据某些示例性实施方案，牛是母牛(cow)。
55.在一些实施方案中，动物粘附细胞包括选自分泌细胞外基质(ecm)的细胞、肌细胞、脂肪细胞、内皮细胞、其祖细胞及其组合的牛来源细胞。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。
56.在一些实施方案中，牛来源的细胞是牛多能干细胞(bpsc)。在一些实施方案中，bpsc是胚胎干细胞。在一些实施方案中，bpsc是牛诱导的psc(bipsc)。
57.在一些实施方案中，牛来源的细胞是从牛多能干细胞(bpsc)分化的细胞。
58.在一些实施方案中，培养食物产品是培养肉。
59.在一些实施方案中，支架被调理为具有增强的粘附非人动物细胞的能力。
60.在一些实施方案中，细胞培养生物反应器至少具有允许培养基流入和流出所述细胞培养生物反应器的入口和出口。
61.在一些实施方案中，细胞培养生物反应器是柔性袋。根据这些实施方案，袋至少包括允许培养基流入和流出所述袋的入口和出口。
62.在一些实施方案中，细胞培养生物反应器用于一次性使用。
63.根据某些实施方案，柔性袋形式的细胞培养生物反应器被配置成允许在插入至少一个支架后将所述柔性袋形式的细胞培养生物反应器密封。
64.在一些实施方案中，细胞培养生物反应器的内部体积是无菌的。
65.根据某些实施方案，细胞培养生物反应器内面由食品安全材料制成。根据某些实施方案，生物反应器内面由具有最小细胞粘附能力或没有细胞粘附能力的材料制成。根据一些实施方案，细胞培养生物反应器由选自由以下组成的组的材料制成：保护光敏材料免于暴露于光的材料、基本上不渗透水蒸气和/或氧气的材料及其组合。
66.在一些实施方案中，柔性袋形式的细胞培养生物反应器被配置成允许在细胞生长
后将其密封，以形成在柔性袋内包含培养食物产品的包装食物产品。
67.柔性袋可以由单层或多于一个层制成。根据某些实施方案，柔性袋内层是食品安全材料。根据一些实施方案，内层由具有最小细胞粘附能力或没有细胞粘附能力的材料制成。根据某些示例性实施方案，柔性袋由包括食品安全材料的内层的层压材料制成。根据某些实施方案，层压材料还包括基本上不透水蒸气和/或氧气的至少一个层。根据一些实施方案，层压材料包括保护光敏材料免于暴露于光的至少一个层。根据一些实施方案，层压材料包括为柔性袋提供支撑和强度的至少一个层。
68.在一些实施方案中，柔性袋包括食品安全聚乙烯的内层、尼龙层和任选的至少一个另外的聚乙烯层。在一些实施方案中，柔性袋还包括保护光敏材料免于暴露于光的层。
69.根据某些实施方案，细胞培养生物反应器的体积为约1升至约500升。根据某些实施方案，体积为约2升至400升、约3升至300升或约3升至200升。根据某些示例性实施方案，组织培养生物反应器的体积选自约3升、约50升和约200升。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。根据某些示例性实施方案，细胞培养生物反应器是具有本文描述的体积的柔性袋。
70.在一些实施方案中，递送系统包括一个或更多个蠕动泵。
71.在一些实施方案中，该系统还包括一个或更多个气泡捕集器(bubble trap)。
72.根据另一个方面，本发明提供了一种用于产生培养食物产品的细胞培养生物反应器，该细胞培养生物反应器呈柔性袋的形式，该柔性袋具有食品安全材料的内面并且至少包括允许培养基流入和流出袋的入口和出口，该袋在其中包含至少一个三维多孔可食用支架。
73.根据某些实施方案，可食用支架包含按重量计的基于支架的干重的至少10％的蛋白质含量。
74.在一些实施方案中，袋被配置成当支架在袋内时允许细胞接种在支架上。
75.根据一些实施方案，插入袋中的单个裸露支架或多于一个裸露支架的总体积为柔性袋体积的约20％至约95％。应当明确理解，裸露支架体积不包括粘附在裸露支架上的细胞/组织的体积。根据一些实施方案，单个裸露支架或多于一个裸露支架的总体积为柔性袋体积的约30％至约95％、约40％至约95％或约40％至约80％。
76.根据某些实施方案，至少一个三维多孔可食用支架和柔性袋的内部体积是无菌的。
77.在一些实施方案中，细胞培养生物反应器用于一次性使用。
78.根据某些实施方案，细胞培养生物反应器被配置成允许在将至少一个支架插入细胞培养生物反应器后密封袋。
79.在一些实施方案中，细胞培养生物反应器被配置成允许在细胞在至少一个支架上生长以及产生培养食物产品后密封袋，以在袋内形成包含培养食物产品的包装食物产品。
80.在一些实施方案中，培养食物产品是培养肉。
81.在一些实施方案中，袋包括多于一个层。根据这些实施方案，内层由食品安全材料制成。
82.在一些实施方案中，袋具有食品安全聚乙烯的内层。
83.在一些实施方案中，袋具有食品安全聚乙烯的内层、尼龙层和任选的另外的聚乙
烯层。
84.在一些实施方案中，袋具有保护光敏材料免于暴露于光的层。
85.在一些实施方案中，袋具有基本上不渗透水蒸气和/或氧气的层。
86.根据另一方面，本发明提供了一种包装食物产品，包括：
87.密封的无菌袋，其包括食品安全材料的内面；和
88.基本上填充所述袋的整个内部体积的袋内的培养肉部分，培养肉部分包括包含附着于至少一个可食用三维多孔支架的多于一种动物粘附细胞类型的细胞组织。
89.根据某些实施方案，三维多孔可食用支架包含按重量计的基于支架的干重的至少10％的蛋白质含量。根据一些实施方案，三维多孔可食用支架包含按重量计的基于支架的干重的至少20％、至少30％或至少40％的蛋白质含量。
90.在一些实施方案中，袋包括多于一个层。根据这些实施方案，内层是食品安全材料的，其中食品安全材料不是细胞粘附的。
91.根据某些实施方案，袋包括食品安全聚乙烯的内层。
92.在一些实施方案中，袋包括食品安全聚乙烯的内层、尼龙层和任选的另外的聚乙烯层。
93.在一些实施方案中，袋还包括保护光敏材料免于暴露于光的层。
94.在一些实施方案中，袋包括基本上不渗透水蒸气和/或氧气的层。在一些实施方案中，多于一种动物粘附细胞类型选自由以下组成的组：基质细胞、内皮细胞、脂肪细胞、肌细胞、肝细胞、心肌细胞、肾细胞、淋巴细胞、上皮细胞、神经细胞、纤毛上皮细胞、肠细胞、分泌细胞外基质(ecm)的细胞、其祖细胞及其任何组合。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。
95.在一些实施方案中，多于一种动物粘附细胞类型选自结缔组织细胞、肌细胞、脂肪细胞和内皮细胞。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。
96.根据某些实施方案，细胞是非人动物的，非人动物选自由牛、家禽、水生动物、无脊椎动物和爬行动物组成的组。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。根据某些示例性实施方案，非人动物细胞是牛细胞。
97.根据某些实施方案，培养肉部分是无菌的。
98.根据又一方面，本发明提供了一种以商业规模产生培养食物产品的方法，包括：
99.(i)将两种或更多种类型的非人动物粘附细胞接种在至少一个支架上，所述支架置于包含细胞生长培养基的细胞培养生物反应器内，其中所述至少一个支架是三维多孔可食用支架；
100.(ii)以受控流量将细胞生长培养基递送到细胞培养生物反应器中，并调整流量以滋养接种在至少一个支架上的细胞；和
101.(iii)培养细胞直到获得期望的组织质量，从而获得培养食物产品。
102.根据某些实施方案，该方法还包括将细胞生长培养基从细胞培养生物反应器循环至处理容器和/或透析系统，并且随后返回细胞培养生物反应器。
103.根据某些实施方案，该方法还包括在一种或更多种营养物的浓度变得不足的情况下向培养基中添加营养物，并且任选地添加一种或更多种用于中和在该工艺中产生的不期望的化合物的中和剂。根据某些实施方案，将一种或更多种营养物和/或中和剂添加到培养
基中，其中所述培养基在处理容器内。
104.根据某些实施方案，接种是单细胞的。根据其他实施方案，接种是细胞聚集体的。
105.根据某些实施方案，该方法还包括在接种细胞后径向旋转细胞培养生物反应器，以允许细胞粘附到支架上。
106.根据某些实施方案，调整受控流量以防止细胞从所述支架上脱附和/或在细胞培养生物反应器中的气泡形成。
107.根据某些实施方案，调整受控流量以将细胞维持在所需的细胞期。根据某些实施方案，细胞期选自由细胞增殖期、细胞分化期和细胞稳定生长期组成的组。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。
108.根据某些实施方案，接种步骤(i)在产生培养食物产品的整个过程中重复至少一次。
109.根据某些实施方案，三维多孔可食用支架包含按重量计的基于支架的干重的至少10％的蛋白质含量。根据一些实施方案，三维多孔可食用支架包含按重量计的基于支架的干重的至少20％、至少30％或至少40％的蛋白质含量。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。
110.根据某些实施方案，根据细胞生长速率和/或细胞生长期调整流量。根据一些实施方案，按照细胞生长期调整培养基组成。根据某些实施方案，生长期选自由细胞增殖期、细胞分化期和细胞稳定生长期组成的组。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。
111.本发明的系统有利地使得能够在培养食物产品的整个细胞生长和形成过程中监测培养基组成。本发明示出了，细胞培养基中葡萄糖浓度的降低和/或乳酸盐浓度的增加是反映细胞生长速率的可靠参数。根据某些实施方案，葡萄糖和/或乳酸盐浓度由本发明系统的感测单元测量。根据其他实施方案，在经由细胞培养生物反应器的一个开口从细胞培养生物反应器获得的样品中测量葡萄糖和/或乳酸盐浓度。
112.根据某些实施方案，该方法还包括对细胞生长培养基取样并测量所述生长培养基中葡萄糖和/或乳酸盐的浓度。根据某些实施方案，取样被重复至少一次。根据一些当前示例性的实施方案，取样每天进行。
113.根据某些实施方案，培养细胞以达到形成期望的培养食物产品的质量。
114.在一些实施方案中，培养细胞直到葡萄糖摄取速率(gur)变得基本上恒定。
115.在一些实施方案中，培养细胞持续5天-14天。
116.在一些实施方案中，该方法还包括在基于水的溶液中洗涤食物产品以去除生长培养基。
117.根据某些实施方案，包含至少一种支架、细胞和生长培养基的细胞培养生物反应器的内部体积在整个工艺过程中保持无菌。
118.在一些实施方案中，细胞培养生物反应器是一次性使用的柔性袋的形式。
119.在一些实施方案中，该方法还包括在细胞达到稳定期后密封袋，以获得包装食物产品，包装食物产品包括密封的袋和所述袋内的培养食物产品。
120.根据某些示例性实施方案，密封包括使用真空去除袋中的残留培养基或洗涤液以及所有气体。
121.根据另一个方面，本发明提供了一种培养食物，该培养食物包括包含附着在至少
一个三维多孔支架上的多于一种非人动物粘附细胞类型的细胞组织，通过本发明的方法产生。
122.根据某些实施方案，三维多孔可食用支架包含按重量计的基于支架的干重的至少10％的蛋白质含量。根据一些实施方案，三维多孔可食用支架包含按重量计的基于支架的干重的至少20％、至少30％或至少40％的蛋白质含量。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。
123.本发明的其他目的、特征和优势从以下描述、实施例和附图将变得清楚。
124.附图简述
125.图1图示了根据本发明一些实施方案的用于产生培养食物产品的培养系统。
126.图2图示了根据本发明另外的实施方案的用于产生培养食物产品的培养系统。
127.图3示出了根据本发明一些实施方案的产生一部分培养肉的生产工艺的流程图。
128.图4图示了根据本发明一些实施方案的柔性袋生物反应器。
129.图5展示了在柔性袋生物反应器内的基于植物的支架上/中生长的细胞在接种后存活持续250小时。箭头表示培养基中的葡萄糖浓度降至低于4g/l时的时间点处添加葡萄糖。
130.图6展示了根据本发明一些实施方案的细胞生物反应器内的支架上存在两种细胞类型—肌肉祖细胞和成纤维细胞。在生长过程结束时，从支架的多个区域采集的样品被均质化，并且总rna被提取并转化为互补dna(cdna)。对编码pax7(肌肉祖细胞的标志物)和1型胶原蛋白(成纤维细胞的标志物)的基因进行rt-pcr扩增。泳道1和泳道4：分别是从无细胞支架获得的样品中pax7和1型胶原蛋白扩增的rt-pcr产物。泳道2和泳道5：分别是在从接种有肌肉祖细胞和成纤维细胞的支架边缘获得的样品中pax7和1型胶原蛋白扩增的rt-pcr产物。泳道3和泳道6：分别是在从接种有肌肉祖细胞和成纤维细胞的支架相对的边缘获得的样品中pax7和1型胶原蛋白扩增的rt-pcr产物。
131.发明详述
132.本发明提供了用于大规模生产培养食物产品，特别是培养肉的培养系统和方法。
133.本发明的培养系统是流量受控的培养系统(也称为连续管式培养系统)，其中培养基以受控的方式以被配置成在置于细胞培养生物反应器内的至少一个三维多孔可食用支架内和支架上维持细胞生长的速率流动通过系统，为一个或更多个细胞培养生物反应器提供均匀的培养基。受控流量有利地提供了可以供给在支架上/中生长并模拟动物体内肌肉块生长的细胞的流。根据本发明，流量优选适应细胞的生长速率和/或生长期。根据一些实施方案，受控流量是塞流式的。
134.根据本发明的培养食物产品包含至少一个可食用支架和由非人动物细胞在支架上形成的组织。因此，支架不与细胞/组织分离，而是形成了模拟了屠宰肉的切割块的最终食物产品的一部分。本发明首次公开了用于大规模制造肉切割块或肉部分形式的培养肉产品的系统和方法。本发明的培养肉切割块包括由培养细胞形成的肉样组织，不同于培养的肉汉堡、肉块(nugget)、肉肠或肉饼。
135.术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(having)”及其同源词意指“包括但不限于”。
136.如本文使用的，除非上下文另外清楚地指出，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”、和“该(the)”包括复数指示物。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可以包括多于一种化合物，包括其混合物。
137.在整个本技术中，本发明的各种实施方案可以以范围格式来呈现。应当理解，以范围格式的描述仅是为了方便和简洁并且不应当被解释为对本发明的范围的不可改变的限制。因此，范围的描述应当被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在该范围内的单独的数值。例如，范围的描述诸如从1至6应当被认为是已经具体地公开了子范围诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及在该范围内的单独的数字例如1、2、3、4、5和6。不论范围的宽度如何，这都适用。
138.本文使用的术语“约”指指定数值的 10％或-10％的指定数值的变化。
139.术语“动物”和“非人动物”在指来源于其的细胞时在本文中可互换使用并且仅指非人动物的细胞。
140.现在参考图1，其图示了根据本发明一些实施方案的用于产生培养食物产品的培养系统100。培养系统100包括培养基贮存器130、处理容器140、多于一个细胞培养生物反应器110a-110e、感测单元150和透析系统160，全部通过使培养基在培养系统中循环的递送系统120连接。
141.培养系统100包括平行布置的多于一个细胞培养生物反应器110a-110e。在图1中图示的实施方案中的细胞培养生物反应器呈柔性袋的形式。每个袋单独安装在用于径向混合袋中的培养基摇杆上，并由温度控制元件单独控制，例如由加热毯包裹用于控制袋内的温度(未示出)。根据接种在支架上的细胞类型来选择在袋中维持的温度。每个袋还受到压力控制。压力通常由至少一个排气系统(未示出)控制。每个袋在其中包含能够粘附非人动物细胞的至少一个可食用支架112。在一些实施方案中，支架在被置于细胞培养生物反应器中之前接种细胞。在其他实施方案中，当支架在细胞培养生物反应器中时，细胞被接种在支架上。在图示的实施方案中，每个袋在其中包含单个支架。在其他实施方案中，每个袋可以包含超过一个支架。在一些实施方案中，当存在超过一个支架时，每个支架连同其上形成的组织构成单独的或一个单个培养食物产品。
142.递送系统120被配置成以受控流量，例如以塞流方式，将均匀的培养基递送到细胞培养生物反应器110a-110e中的每一个中。递送系统120包括多于一个蠕动泵122a-122e，每个泵以使得培养基能够在生物反应器内进行循环的速率将培养基递送到细胞培养生物反应器110a-110e中的一个中，以使得细胞生长同时防止细胞从支架脱附和/或气泡形成。在某些实施方案中，生物反应器内的培养基循环是塞流方式。细胞培养生物反应器110a-110e中的每一个单独地接收均匀的培养基，所述均匀的培养基通过递送系统120以使细胞能够生长的受控流量递送到所有细胞培养生物反应器110a-110e。在某些实施方案中，受控流量使得培养基能够以塞流方式在多于一个细胞培养生物反应器110a-110e中的每一个内进行循环。泵122a-122e与控制单元(未示出)可操作地连通，该控制单元控制和调整流量以提供期望的培养基循环和防止细胞从支架上脱附和/或气泡形成。在一些优选实施方案中，根据支架上的细胞的生长期和/或生长速率来进一步调整流量。应当明确理解，泵122a-122e中的每一个可以将培养基递送到在细胞培养生物反应器的近端或远端的所述细胞培养生物反应器110a-110e中的每一个。近端和远端的细胞培养生物反应器110a-110e之间的变化可以通过旋转所述培养生物反应器中的每一个、通过旋转近端和远端的细胞培养生物反应器
之间的泵122a-122e(未示出)中的每一个的连接、或者通过使用双向泵并通过控制单元(未示出)控制流动方向来实现。
143.调整培养基的流量以到达细胞培养生物反应器中的每一个，并滋养接种和附着在生物反应器内的一个或更多个支架上的细胞。流量通常根据细胞生长速率，并且特别是根据细胞生长期来调整，细胞生长期包括细胞增殖期、细胞分化期和细胞稳定期。根据某些实施方案，调整流量以形成导致细胞分化的剪切力。
144.当培养基进入生物反应器时，细胞培养生物反应器内的塞流可以通过产生湍流而不是层流来获得。如果流足够湍急，那么由生物反应器壁引起的层流底层相对于生物反应器的直径是如此薄以至于层流底层是可忽略不计的(δs《《d)。
145.湍流产生可以使用雷诺数(reynold number)来预测。对于具有圆形开口(cut)的生物反应器，当雷诺数小于2300时，流将是层流，并且如果雷诺数超过4000，流将是湍流(在2300-4000之间的雷诺数是过渡数)。
146.对于管道或管(诸如根据本发明的管式生物反应器)中的流，雷诺数(“re”)通常定义为：
147.re＝(ρυdh)/μ＝(udh)/ν＝(qdh)/νa
148.q＝体积流量(m3/s)
149.dh＝管道或管的内径(m)
150.ν＝运动粘度(ν＝μ/ρ)(m2/s)
151.a＝管道的横截面积(m2)
152.u＝流体的平均速度(m/s)
153.μ＝流体的动态粘度(pa
·
s＝n
·
s/m2＝kg/(m
·
s))
154.ρ＝流体的密度(kg/m3)
155.可选地或另外地，细胞培养生物反应器内的塞流可以通过在流动管线中添加合适的混合器(静态的或动态的)来获得。
156.培养基贮存器130将细胞生长培养基供应到培养系统中。培养基贮存器130通过液位泵(level pump)132连接到培养系统，液位泵132被配置成基于培养系统内的液位来控制培养基从培养基贮存器流动进入培养系统。
157.处理容器140被配置成接收培养基并调整培养基中的温度、ph、溶解氧、一种或更多种营养物以及一种或更多种不希望的化合物的浓度。处理容器140包括营养物添加端口142、热交换器144、充氧器146和ph控制单元148。在一些实施方案中，处理容器还包括用于测量前述参数，即培养基中的温度、ph、溶解氧、一种或更多种营养物以及一种或更多种不期望的化合物的浓度的传感器(未示出)。在其他实施方案中，诸如图1图示的实施方案，培养系统包括单独的感测单元150，其被配置成测量培养基中的前述参数。在一些实施方案中，与感测单元和处理容器(未示出)可操作地通信的控制单元基于测量值根据需要控制参数的调整。处理容器140还被配置成测量液位，并基于测量值根据需要来调整液位。
158.透析系统160被配置成从培养基中去除不期望的化合物诸如氨和乳酸。透析系统160包括透析器162、新鲜透析液贮存器164和用过的透析液贮存器166。
159.在图示的实施方案中，递送系统120使培养基从细胞培养生物反应器110a-110e循环进入透析系统并且随后进入处理容器，或者如果不需要透析则直接进入处理容器。进入
透析系统或直接返回处理容器的培养基的流由三通阀124控制。在其他实施方案中，不包括透析系统，并且培养基在处理容器和细胞培养生物反应器之间循环。
160.透析器162接收来自贮存器164的新鲜透析液和来自细胞培养生物反应器110a-110e的用过的培养基(spent medium)，该用过的培养基需要被透析以去除可能干扰细胞生长的不期望的化合物。分别通过泵168a和168b来控制用过的培养基和新鲜透析液进入透析器162的流。在图示的实施方案中，透析之后，透析培养基流向处理容器140，并且用过的透析液流向贮存器166并且随后作为废弃物丢弃。
161.培养系统100还包括气泡捕集器170a、170b，以防止在培养系统运行期间在细胞培养生物反应器内形成气泡。培养系统100还可以包括采样点172。
162.在一些实施方案中，使用培养系统100产生培养食物产品包括以下步骤：
163.细胞接种：其中包含能够粘附非人动物粘附细胞的至少一个可食用支架的细胞培养生物反应器110a-110e中的每一个安装在摇杆上。经由泵122a-122e用细胞生长培养基来填充每个细胞培养生物反应器，直到培养基填充细胞培养生物反应器的体积的5％-80％。然后关闭泵122a-122e，并且在支架在细胞培养生物反应器中时，将细胞接种在支架上。可选地，细胞被接种在处理容器140中，并且通过递送系统120被递送至细胞培养生物反应器110a-110e中的每一个。细胞可以作为单个细胞或作为细胞聚集体接种。每个细胞培养生物反应器由摇杆径向旋转以维持细胞悬浮，从而增强它们在整个支架上的分布和粘附。细胞的接种可以进行一次，或者可以进行顺序接种步骤。根据某些实施方案，第一次接种是在培养过程开始时，刚好在培养生物反应器被培养基填充之后并且支架不含有细胞(bare from cells)时进行的。顺序接种步骤可以在此后的培养过程期间的任何时间在细胞已经粘附到支架上之后进行。在某些实施方案中，将细胞接种在至少一个支架上后，将支架放置在细胞培养生物反应器内。根据这些实施方案，用细胞生长培养基经由泵122a-122e来填充包含至少一个接种支架的细胞培养生物反应器中的每一个，直到培养基填充细胞培养生物反应器的体积的5％-80％。
164.培养：在细胞粘附之后，通常在接种后6小时-24小时之间，启动泵122a-122e，并且细胞生长培养基在培养系统中的循环开始。培养基以受控流量例如以塞流被递送到细胞培养生物反应器110a-110e中的每一个。在培养系统运行期间，调整流量以防止细胞从支架脱附和/或在细胞培养生物反应器中的每一个中形成气泡。在培养系统运行期间，监测培养基中的温度、ph、溶解氧、一种或更多种营养物的浓度以及任选的一种或更多种不期望的化合物的浓度。如果需要，在处理容器中调整这些参数中的一个或更多个。例如，如果某种营养物的浓度变得不足，则经由处理容器140的营养物添加端口142将营养物供应到培养系统中。在一些实施方案中，从细胞培养生物反应器流出的培养基被递送到透析系统中，以便从培养基中去除不期望的化合物，诸如氨。培养基随后被递送到处理容器(并再次被递送到细胞培养生物反应器)。在其他实施方案中，培养基直接从细胞培养生物反应器流动到处理容器(并随后流动到细胞培养生物反应器)。细胞在细胞培养生物反应器中生长，直到细胞达到稳定期和/或期望的质量，并形成包含由细胞和支架形成的组织的培养食物产品。在一些实施方案中，培养细胞直到葡萄糖摄取速率(gur)变得基本上恒定。在一些实施方案中，培养细胞持续5天-21天。当培养完成时，可以用基于水的溶液(例如在盐水中)洗涤获得的食物产品，以去除生长培养基，并任选地向培养食物产品添加添加剂，例如增加其维生素含量
的添加剂和/或影响其外观和/或味道的添加剂。
165.现在参考图2，其图示了根据本发明一些实施方案的用于产生培养食物产品的培养系统200。培养系统200包括用于安装多于一个细胞培养生物反应器的多于一个托盘210a-210b。每个托盘在每一端具有开口212，该开口212用于放置每个细胞培养生物反应器的管道系统。培养系统200还包括用于力传递和摇摆速度控制的轴承箱214。培养系统200还包括以经由管道系统连接到细胞培养生物反应器，并以受控流量将培养基递送到细胞培养生物反应器的泵222a-222b。培养系统200还包括处理容器240，处理容器240被配置成接收培养基并调整温度、ph、溶解氧、培养基中一种或更多种营养物的浓度以及任选的一种或更多种不期望的化合物的浓度。培养系统200还包括控制单元280，控制单元280包括用于调整ph、多于一种成分的基础泵282、被配置成添加营养物和/或用于中和培养基中的不期望的化合物的剂的泵284a-284c、以及培养基液位泵286。控制单元280经由管道系统(未示出)连接到处理容器240，用于在培养系统运行期间根据需要控制ph、向培养基供应营养物并维持培养基液位。控制单元280和处理容器240还经由co2、o2和空气的气体歧管290连接，用于控制和供应co2、o2和/或空气进入培养基。在图2图示的系统中，处理容器包括用于测量温度、ph等的电极/传感器。
166.细胞培养生物反应器
167.根据本发明的细胞培养生物反应器是无菌容器，其被配置成容纳其上接种有细胞的一个或更多个支架，并允许细胞在支架上和/或支架内生长以形成培养食物产品。在一些实施方案中，细胞培养容器是柔性管状袋。在一些实施方案中，细胞培养生物反应器是一次性的。细胞培养生物反应器至少包括入口和出口，以允许培养基流入和流出细胞培养生物反应器。在一些实施方案中，细胞培养生物反应器被配置成当支架在细胞培养生物反应器内时允许将细胞接种到支架上。
168.在一些实施方案中，细胞培养生物反应器呈柔性袋的形式。适于形成适于用作细胞培养生物反应器的柔性袋的材料是本领域已知的，并且可以为袋提供期望的强度、柔性以及食物产品工业要求的可萃取物和可滤出物的标准。
169.根据某些实施方案，柔性袋形式的细胞培养生物反应器由食品安全材料制成。根据一些实施方案，食品安全材料的进一步特征在于最小的细胞粘附能力或没有细胞粘附能力。在其他实施方案中，柔性袋形式的细胞培养生物反应器由包含食品安全材料的内层的层压材料制成。食品安全材料的实例是食品安全聚乙烯。在一些实施方案中，根据本发明的细胞培养袋的层压材料还包括提供支撑和强度的层，诸如尼龙层。在一些实施方案中，层压材料包括聚乙烯的内层和至少一个尼龙外层。在一些实施方案中，层压材料包括聚乙烯的内层、尼龙层和至少一个另外的聚乙烯层。在一些实施方案中，层压材料包括至少一个保护光敏材料免于曝露于光的层，例如由不透明材料制成的层，诸如铝层。根据某些实施方案，层压材料至少包括基本上不透水蒸气和/或氧气的层。
170.现在参考图4，其图示了柔性袋400形式的培养生物反应器，用于将两种或更多种类型的动物粘附细胞接种在置于细胞培养生物反应器内的一个或更多个支架上，以获得培养食物产品。柔性袋400被配置成具有位于柔性袋400的相对的短的面420a-420b处的两个末端端口410a-410b的细长袋，例如端口410a是被配置成经由递送系统(例如图1中的递送系统120)接收来自培养基贮存器(例如图1中的培养基贮存器130)的培养基的入口，以及端
口410b被配置成经由例如图1中的递送系统120将培养基递送到处理容器(例如图1中的处理容器140)。柔性袋400还包括一个或更多个开口430a-430b，用于将两种或更多种类型的动物粘附细胞接种在一个或更多个支架上，并且任选地用于在细胞生长期间的任何时间用柔性袋400对培养基取样。细长的面(elongated face)440a或440b可以仅在至少一个支架插入柔性袋400之后、将袋安装在培养系统上之前焊接。根据本发明的细胞培养生物反应器的体积可以根据其预期用途，例如，它是意在形成在其中产生培养食物产品的包装，或是用作培养食物产品然后从生物反应器中收获食物产品的容器而变化。体积可以在例如1升直至200升之间变化。
171.在一些实施方案中，柔性袋形式的细胞培养生物反应器在产生培养食物产品后形成培养食物产品的包装。根据这些实施方案，细胞在细胞培养袋中的支架上/支架中生长，直到获得期望的生长，并且形成包含支架和细胞的培养食物产品。然后袋被密封并与培养系统分离，以获得包含在袋内的培养食物产品的包装食物产品，培养食物产品基本上填充袋的整个内部体积。根据一些实施方案，袋是真空密封的。根据一些实施方案，在去除剩余培养基之后，并且任选地在洗涤食物产品并且去除洗涤溶液之后，将袋密封。根据某些实施方案，洗涤溶液是基于水的溶液。
172.由于生长过程是无菌的，所得包装食物产品是无菌的，并且因此具有比常规新鲜产品诸如鲜肉长得多的保质期。此外，由于获得的食物产品是无菌的，其可以在不需要冷却的情况下运输，从而显著降低所涉及的成本。
173.支架
174.如本文使用，术语“支架”指的是包含提供适合细胞粘附/附着和增殖的表面的材料的三维结构。支架还可以提供机械稳定性和支撑。支架可以呈特定的形状或形式，以便影响或限定由增殖细胞群体呈现的三维形状或形式。
175.根据本发明的支架是由适于人类消耗的可食用材料制成的三维多孔基材。在一些实施方案中，支架材料包含至少10％的蛋白质(w/w-干重)、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的蛋白质(w/w-干重)。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。在一些实施方案中，支架是植物、真菌或藻类来源的。在一些实施方案中，支架是植物或真菌来源的。
176.在一些实施方案中，基于植物/真菌/藻类的三维多孔可食用支架包含植物、真菌或藻类蛋白质，其任选地与植物、真菌或藻类多糖组合。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。
177.在一些实施方案中，支架包含至少一种植物蛋白质，任选地连同至少一种植物多糖，其中植物选自由小麦、大豆、红花、玉米、花生、豌豆、向日葵、鹰嘴豆、棉花、椰子、油菜籽、马铃薯和芝麻组成的组。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。
178.蛋白质和任选的多糖可以从包含它们的任何植物部分获得，该植物部分包括种子、叶、根、茎、块茎、球茎以及其他，并且在一些实施方案中形成从中获得的提取物的一部分。在一些实施方案中，基于干重计，该提取物包含至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的蛋白质。在一些实施方案中，支架包含纯植物蛋白。
179.在一些实施方案中，支架是真菌来源的。在一些实施方案中，支架材料是从可食用
真菌，通常是大型真菌中获得的。可以使用可食用真菌的任何部分，包括菌丝体、菌丝和子实体(果实体(sporocarp))。在一些实施方案中，支架材料由选自由以下组成的组的可食用蘑菇获得：双孢蘑菇(agaricus bisporus)(普通蘑菇、褐菇(portobello mushroom))、平菇(pleurotus ostreatus)(蚝蘑(oyster mushroom))、羊肚菌(morchella esculenta)(羊肚菌(morel))和鸡油菌属(genera chanterelle)的蘑菇。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。
180.在一些实施方案中，来源于植物或真菌或藻类的蛋白质或多糖包含长链结构单元。长链蛋白质/多糖为支架提供纤维组织(fibrous texture)。植物蛋白质或真菌蛋白质可以通过本领域已知的任何方法并且例如在wo2019/016795中描述的而被组织化为三维多孔支架。
181.根据本发明的支架由于其相互连接的孔结构和机械性能而支持细胞的生长。支架的多孔结构对于允许细胞渗透到支架的深度并允许分散体均匀地覆盖支架是至关重要的。此外，相互连接的孔允许液体流入支架，并且保证细胞的营养状况。
182.初始细胞接种密度必须是有效的，同时允许支架内的最佳细胞增殖。待接种的细胞的数量进一步取决于支架材料的孔隙率及其液体吸收能力。支架能够吸收的越多，可以被接种的细胞的数量就越大。在一些实施方案中，每克支架(干重)的细胞数量在2
×
106至50
×
106个细胞的范围内。此外，支架的孔隙率和支架纤维的内部组织有助于细胞保留在支架内和支架上。细胞可以被接种一次，或者可以在整个培养过程中采取顺序接种步骤。
183.通常在使用前对支架灭菌。灭菌可以例如通过γ辐照、通过高压灭菌、通过用醇洗涤或通过环氧乙烷(eto)气体处理来进行。
184.在一些实施方案中，支架选自组织化蛋白质(textured protein)和非组织化蛋白质，任选地还包含多糖。在一些实施方案中，组织化蛋白质是组织化大豆蛋白质。
185.在一些实施方案中，支架包括具有范围在20至1000微米的平均直径的孔。
186.在一些实施方案中，多孔支架的平均孔径的范围为20微米(μm)至1000μm、20μm至900μm、20μm至800μm、20μm至700μm、20μm至600μm、20μm至500μm、20μm至400μm、20μm至300μm、20μm至200μm、20μm至100μm、50μm至1000μm、50μm至900μm、50μm至800μm、50μm至700μm、50μm至600μm、50μm至500μm、50μm至400μm、50μm至300μm、50μm至200μm、50μm至100μm、100μm至1000μm、100μm至900μm、100μm至800μm、100μm至700μm、100μm至600μm、100μm至500μm、100μm至400μm、100μm至300μm、100μm至200μm、500μm至1000μm、500μm至900μm、500μm至800μm、500μm至700μm或500μm至600μm。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。
187.在一些实施方案中，多于一种细胞的覆盖百分比(coverage％)为至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少99％。术语“覆盖百分比”指的是在整个培养过程中与细胞接触的多孔支架的面积或体积。在一些实施方案中，多于一种细胞的覆盖百分比为5％-20％、15％-30％、25％-40％、35％-50％、45％-60％、55％-70％、65％-80％、75％-90％、85％-100％，或其间的任何范围。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。
188.细胞的接种和/或培养在生长培养基的存在下进行。在一些实施方案中，生长培养基包含生长因子、小分子、生物活性剂、营养物、氨基酸、抗生素化合物、抗炎化合物或其任何组合。
189.在一些实施方案中，支架包含组织化蛋白。在一些实施方案中，组织化蛋白是组织化植物蛋白。在一些实施方案中，组织化蛋白是组织化大豆蛋白(例如，tsp)。如本文中关于蛋白使用的术语“组织(texture)”指的是单个细胞的刚性块或柔性块，其可以容易地形成各种尺寸、形状和构型，并且其不可分散在水中。
190.用于形成本发明支架的合适的颗粒组织化蛋白材料可以由基于干重计的从40％至100％的蛋白和从0％至60％的与蛋白来源材料或添加的辅助材料(adjuvant material)相关的材料组成。辅助材料的实例是碳水化合物、维生素、调味剂、色素或其他。
191.可被组织化以形成组织化颗粒蛋白材料的合适的非组织化蛋白是从多种来源可获得的。例如，这种蛋白的来源是植物蛋白和某些真菌蛋白。合适的植物蛋白来源的实例是大豆、红花籽、玉米、花生、小麦、小麦麸质、豌豆、葵花籽、鹰嘴豆、棉籽、椰子、油菜籽、芝麻、叶蛋白、麸质以及类似物。也可以使用单细胞微生物诸如酵母的蛋白。
192.通常如果蛋白来源是植物蛋白，则在使用前将蛋白以相对纯的形式放置。因此，例如，如果蛋白来源是大豆，则大豆可以被溶剂例如用己烷提取以从中去除油。所得的无油大豆材料含有约50％的蛋白。
193.可以以已知的方式加工大豆材料以去除碳水化合物并获得具有较高蛋白水平的产品，例如，含有约70％蛋白的大豆蛋白浓缩物或含有约90％或更多蛋白的大豆蛋白分离物。如wo 2019/016795中描述的，可以采用多种工艺将大豆材料、浓缩物、分离物和其他可食用的含蛋白材料转化成合适的组织化颗粒蛋白材料。
194.在一些实施方案中，支架被调理为增强细胞的粘附。
195.在一些实施方案中，可在细胞接种期间使用热可逆固化剂以改善细胞对支架的附着。在一些实施方案中，接种可以包括：
196.(a)将包含多于一种非人动物粘附细胞类型的接种培养基与支架和热可逆固化剂一起孵育，其中孵育条件使得培养基能够固化，从而形成包含支架和细胞的基本上半固体或固体的接种培养基；和
197.(b)在使所述培养基能够液化的条件下孵育基本上半固体或固体的接种培养基。
198.在一些实施方案中，当接种在细胞培养生物反应器中进行时，本发明的系统还包括使培养基能够凝固的冷却系统。
199.根据某些实施方案，当柔性袋形式的细胞培养生物反应器在产生培养食物产品后形成培养食物产品的包装时，插入袋中的单个支架的体积或多于一个支架的总体积为袋内部体积的20％至约99％。根据某些实施方案，支架或多于一个支架的体积为袋内部体积的约20％至约95％、96％、97％或98％。在一些实施方案中，支架或多于一个支架的体积为袋内部体积的约20％至约80％、85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％或94％。在一些实施方案中，支架或多于一个支架的体积为袋内体积的约25％、26％、27％、28％、29％、30％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％或50％至约95％。根据一些实施方案，支架或多于一个支架的体积为袋内部体积的约40％至约80％。
200.细胞
201.根据本发明，在每个支架上接种两种或更多种类型的动物粘附细胞。根据本发明的细胞是非人动物、非遗传修饰的粘附细胞。
202.为了产生培养肉，根据要产生的肉部分的期望类型来选择两种或更多种类型的非
人动物粘附细胞。产生的肉部分可以模仿屠宰肉的切割块(cut)、内脏，或设计用于某种菜肴的准备。
203.根据某些实施方案，非人动物粘附细胞包括基质细胞和/或内皮细胞和/或脂肪细胞，以及根据期望的最终肉产品的至少一种细胞类型，包括肌细胞(肉切割块)；肝细胞(肝脏)；心肌细胞(心脏)；肾细胞(肾脏)；淋巴和上皮细胞(由胸腺和胰腺制成的杂碎(sweetbread))、神经和神经元细胞(大脑)；纤毛上皮细胞(舌)和胃细胞(肚)。
204.根据某些实施方案，非人动物粘附细胞选自由以下组成的组：肌细胞、分泌细胞外基质(ecm)的细胞、脂肪细胞、内皮细胞及其祖细胞。在一些实施方案中，两种或更多种类型的非人动物粘附细胞包括肌细胞或其祖细胞和选自由以下组成的组的至少一种其他类型：分泌ecm的细胞、脂肪细胞、内皮细胞及其祖细胞。在一些实施方案中，非人动物粘附细胞包括肌细胞或其祖细胞、分泌ecm的细胞或其祖细胞、脂肪细胞或其祖细胞以及内皮细胞或其祖细胞。
205.根据某些实施方案，非人动物选自由有蹄动物、家禽、水生动物、无脊椎动物和爬行动物组成的组。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。
206.根据某些实施方案，有蹄动物选自由以下组成的组：牛、绵羊、马、猪、长颈鹿、骆驼、鹿、河马或犀牛。根据一些实施方案，有蹄动物是牛。根据某些示例性实施方案，牛是母牛。
207.在一些实施方案中，根据本发明的教导，接种在支架上的非人动物来源的粘附细胞包括多能干细胞。根据某些实施方案，待接种的非人动物来源的粘附细胞包含牛来源的多能干细胞(bpsc)。根据某些实施方案，bpsc是牛胚胎干细胞。根据某些实施方案，bpsc是牛诱导多能干细胞(bipsc)。接种的牛来源的粘附细胞在使得能够分化成期望细胞类型的条件下生长。在一些特定实施方案中，接种的牛来源的多能细胞分化成肌细胞、分泌ecm的细胞、脂肪细胞和/或内皮细胞。
208.在一些实施方案中，根据本发明的教导，接种在支架上的非人动物来源的粘附细胞包括分化的细胞。
209.在一些实施方案中，非人动物细胞通过使多能干细胞，例如牛来源的多能干细胞(psc)分化获得。根据这些实施方案，产生培养肉的工艺包括在细胞接种在支架上并在本发明的培养系统中孵育之前进行的扩增步骤和分化步骤。在一些实施方案中，该工艺包括以下步骤：(a)将psc接种在具有扩增培养基的细胞培养容器中，扩增培养基是包含生长因子组合的无血清液体培养基，以形成随时间生长的同质聚集体；(b)将psc分到四个细胞培养容器，用于分化成分泌ecm的细胞、成肌细胞、脂肪细胞和内皮细胞；和(c)根据本发明在至少一个支架上接种至少两种类型的分化细胞，并在本文描述的培养系统中培养细胞。
210.在一些实施方案中，非人动物细胞选自由以下组成的组：肌细胞、脂肪细胞、基质细胞、成纤维细胞、周细胞(pericyte)、内皮细胞及其祖细胞。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。
211.在一些实施方案中，多于一种细胞类型包括成肌细胞和/或其祖细胞以及至少一种类型的分泌细胞外基质(ecm)的细胞。
212.在一些实施方案中，多于一种细胞类型包括成肌细胞和/或其祖细胞以及内皮细胞和/或其祖细胞。
213.在一些实施方案中，多于一种细胞类型包括成肌细胞和/或其祖细胞、至少一种类型的分泌细胞外基质(ecm)的细胞和/或其祖细胞以及内皮细胞和/或其祖细胞。
214.在一些实施方案中，成肌细胞祖细胞是卫星细胞。
215.在一些实施方案中，分泌ecm的细胞选自由基质细胞、成纤维细胞、周细胞、平滑肌细胞及其祖细胞组成的组。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。在一些特定实施方案中，分泌ecm的细胞是成纤维细胞、成纤维细胞祖细胞或其组合。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。
216.在一些实施方案中，内皮细胞选自由骨骼微血管内皮细胞、主动脉平滑肌细胞及其组合组成的组。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。
217.在一些实施方案中，多于一种细胞类型包括成肌细胞、分泌ecm的细胞和内皮细胞。
218.在另外的实施方案中，多于一种细胞类型包括卫星细胞、分泌ecm的细胞和内皮细胞。
219.在一些实施方案中，成肌细胞和/或其祖细胞与分泌ecm的细胞的比在约10:1与约1:10之间。
220.在一些实施方案中，分泌ecm的细胞与内皮细胞的比在约1:1与约1:10之间。
221.在一些实施方案中，卫星细胞、分泌ecm的细胞和内皮细胞的比在约10:1:1与约2:1:10之间。
222.在一些实施方案中，卫星细胞和分泌ecm的细胞的比在约1:5至3:5之间。
223.在一些实施方案中，最终产品中各种细胞类型之间的比如下：55％-98％的成肌细胞、2％-10％的基质细胞、0％-25％的脂肪细胞、0％-10％的内皮细胞。
224.根据本发明使用的接种培养基和生长培养基是本领域已知的适于保持非人动物细胞的生存力、增殖和任选的分化的那些。根据某些示例性实施方案，在合适的时间添加rho相关蛋白激酶(rock)的抑制剂，以增强细胞存活和整体细胞增殖功效。
225.在一些实施方案中，生长培养基是用于非人动物细胞的无血清、无动物来源成分的液体培养基，其富含选自由至少一种天然着色剂、氰钴胺(维生素b12)、铁及其任何组合组成的组的补充剂，其中补充剂的量足以赋予细胞红棕色。在一些实施方案中，生长培养基的特征在于在约350nm与约700nm之间的多于一个波长处具有吸光度。在一些实施方案中，生长培养基还包含酵母提取物、细菌提取物或其组合。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。
226.在一些实施方案中，天然着色剂选自由以下组成的组：从至少一种非哺乳动物生物体获得的提取物、至少一种类胡萝卜素、至少一种甜菜色素及其任何组合。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。
227.在一些实施方案中，生长培养基还包含选自由以下组成的组的至少一种补充剂：叶酸、锌、硒、维生素d、维生素e、辅酶q10、至少一种不饱和脂肪酸及其任何组合。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。
228.在一些实施方案中，维生素d选自由维生素d3和维生素d2组成的组。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。
229.在一些实施方案中，非饱和脂肪酸选自由ω3脂肪酸、ω6脂肪酸及其组合组成的
组。
230.在一些实施方案中，生长培养基还包含至少一种防止培养细胞被污染的抗微生物肽(amp)。
231.包含多于一种非人动物细胞类型的细胞培养物可以通过本领域已知的任何方法产生。在一些实施方案中，细胞是牛细胞。在最佳和有效的条件下培养牛细胞之后，将牛细胞用于本文描述的培养肉部分的产生。培养肉部分是在至少一个3d支架上培养为共培养物的细胞(两种或更多种类型的细胞)的组合。最初，细胞以单细胞或聚集体接种在3d支架上，通常以细胞类型之间的设定比来接种。一个或更多个支架和细胞构成本文描述的最终食物产品(例如，培养肉部分)。
232.呈现以下实施例以便更充分地说明本发明的某些实施方案。然而，它们决不应当被解释为限制本发明的宽范围。本领域技术人员可以容易地设想本文公开的原理的许多变型和修改而不偏离本发明的范围。
实施例
233.实施例1：培养肉部分的产生
234.工艺流程图如图3中所描绘。
235.获得从牛psc分化的牛来源的分泌ecm的细胞、成肌细胞、脂肪细胞和内皮细胞的祖细胞。根据本发明，将分化的细胞接种在细胞培养生物反应器中的具有按重量(干重)计至少40％的蛋白质含量的支架上，并在本文描述的培养系统中培养持续10天-14天。形成了培养肉的一部分。
236.将部分分化的细胞以四种类型的细胞之间的设定比并以一定的顺序方式接种在支架上。在生产工艺开始时，新鲜培养基(不含动物成分)被接种到系统中，并且含有特定的生长因子和小分子。细胞培养生物反应器的多种参数被仔细监测和调整，以使细胞活力保持在最佳水平。维持细胞培养生物反应器的温度(38.6℃
±
0.5℃)和ph(6.7-7.2
±
0.1)。收集细胞培养生物反应器的每日样品(daily sample)，并分析细胞计数(活细胞计数和总细胞计数)、培养基组成(葡萄糖、氨、乳酸盐、渗透压)。当葡萄糖摄取率(gur)达到50克/天-500克/天之间的最大水平时，该工艺结束，并且收获培养肉的一部分。
237.实施例2：在作为本发明的细胞培养生物反应器的柔性袋中的细胞生长
238.设计并生产了2l的无菌袋。该袋由五层基于聚烯烃的无动物成分的膜组成，该膜提供优异的可萃取物和可滤出物谱、水蒸气和氧气屏障以及流体完整性(由meissner filtration products,ca生产)。该袋通过γ射线(25kgy-40kgy)灭菌。
239.以70ml生长培养基的规模以及具有约16.5ml体积的单个基于植物的支架和作为细胞培养生物反应器的一次性袋进行概念验证实验。
240.用在25ml体积的生长培养基中的325
×
106个牛成纤维细胞和成肌细胞接种包含支架的70ml袋。袋的顶部空间填充有空气，并且袋以2cpm的速度被摇动，在38.5℃的温度以10
°
的角度放置。一小时之后，添加另外的45ml培养基。接种后2小时取代表上清液的样品用于分析接种效率。在38.5℃和5％co2进一步静态孵育该袋。当测量的葡萄糖水平低于4克/升时，就更新全部生长培养基。
241.在接种的325
×
106个细胞中，2小时后上清液中仅剩下51.3
×
106个细胞。这些结果
表明84％的细胞已经粘附在支架上。
242.通过分析培养基中的葡萄糖和乳酸盐水平来跟踪细胞在支架上/支架中随时间的生长。细胞生长的特征在于培养基中葡萄糖浓度的降低(表明细胞对葡萄糖的摄取)和乳酸盐浓度的增加(表明细胞的代谢活性)。如图5中示出的，生长在支架上/支架中的细胞消耗葡萄糖并产生乳酸盐，这表明细胞在检查的前250小时内是存活的。
243.实施例3：两种细胞类型在细胞培养生物反应器内的支架上的生长
244.检查生长期结束时接种在支架上的成纤维细胞和成肌细胞的存在，以确保培养系统能够支持超过一种细胞类型的生长。使用pcr辅助检测。测试了肌肉祖细胞标志物pax7和成纤维细胞标志物1型胶原蛋白的基因表达。来源于支架的相对端的支架样品(重量＝150mg)被收集并被均质化，并使用ez rna试剂盒(biological industries,israel)进行rna提取。没有接种细胞的裸露支架作为阴性对照。如图6中所示，pax7和1型胶原蛋白在接种支架的两端被表达。如所预期的，在从没有细胞的裸露支架获得的样品中没有检测到这些标志物。这些数据表明，接种在支架上的牛肌肉祖细胞和成纤维细胞二者已经粘附在支架上并在支架上伴随生长。此外，通过显示细胞存在于支架的相对端展示了细胞分布在支架的整个区域。
245.特定实施方案的前述描述将如此完全地揭示本发明的一般性，以致其他人可以通过应用现有知识容易地修改和/或调整这样的特定实施方案用于多种应用，而不进行过度的实验并且不脱离一般概念，并且因此，这样的调整和修改应当且意图被包含在公开的实施方案的等效物的含义和范围内。应当理解，本文中采用的措辞或术语是为了描述的目的而非限制的目的。用于实施多种公开的功能的手段、材料和步骤可以采取多种可选择的形式而不脱离本发明。