用于保存DNA甲基化的组合物和方法与流程

技术特征：

1.一种组合物，其包含：

包含甲基化DNA序列的生物样品；和

包含甲醇的储存溶液；

其中所述甲基化DNA序列的甲基化模式得到保存。

2.权利要求1的组合物，其中所述甲基化模式保存至少2周。

3.权利要求1或2的组合物，其中在室温下保存所述甲基化模式。

4.权利要求1-3中任何一项的组合物，其中与储存之前的所述生物样品中的甲基化模式相比较，所述储存溶液中所述生物样品的甲基化模式保存至少65%。

5.权利要求1-4中任何一项的组合物，其中所述样品为人类生物样品。

6.权利要求1-5中任何一项的组合物，其中所述生物样品为来自以下任何一种的样品：胃肠道、呼吸消化道、呼吸道、泌尿生殖道或体液。

7.权利要求6的组合物，其中所述体液为以下的任何一种：血液、尿液、痰液、唾液、粪便、胆汁、胰液、鼻腔分泌物、眼泪、精液、阴道分泌物、脑脊液、胸膜液、腹膜液、胃液、心包液、汗液、淋巴液、囊液、胰腺囊液、滑液、关节液、月经液、子宫内膜冲洗液、乳房抽吸液或羊水。

8.权利要求1-5中任何一项的组合物，其中所述生物样品为来自以下任何一种的样品：食道、胃、结肠、小肠、胰腺、肝脏、口腔、口咽、气管、支气管树、肺部或乳房。

9.权利要求8的组合物，其中所述生物样品为食道生物样品。

10.权利要求1-9中任何一项的组合物，其中所述储存溶液包含100%甲醇。

11.权利要求1-9中任何一项的组合物，其中所述储存溶液包含与水混合的10%-100%甲醇。

12.权利要求1-9中任何一项的组合物，其中所述储存溶液包含与水混合的10-90%甲醇。

13.权利要求1-9中任何一项的组合物，其中所述储存溶液包含与水混合的20-90%甲醇。

14.权利要求1-9中任何一项的组合物，其中所述储存溶液包含与水混合的30-90%甲醇。

15.权利要求1-9中任何一项的组合物，其中所述储存溶液包含与水混合的30-80%甲醇。

16.权利要求1-9中任何一项的组合物，其中所述储存溶液包含与水混合的40-70%甲醇。

17.权利要求1-9中任何一项的组合物，其中所述储存溶液包含与水混合的40-60%甲醇。

18.权利要求10-17中任何一项的组合物，其中所述甲醇不含或者以低于或等于0.001%的水平含过氧化物。

19.权利要求11-18中任何一项的组合物，其中所述水通过蒸馏或超滤或反渗透来纯化。

20.权利要求11-19中任何一项的组合物，其中所述水不含DNA酶和/或RNA酶活性。

21.权利要求1-20中任何一项的组合物，其中所述甲基化DNA序列包含与波形蛋白、CCNA1、Up10、Up35-1、Up35-2、FER1L4、VAV3、DOCK10、ADCY1、BMP3、CD1D、ELMO1、ELOVL2、LRRC4、NDRG4、SFMBT2、ST8SIA1、TSPYL5、ZNF568、ZNF569、ZNF610、ZNF671、ZNF682、CDKN2A、DIO3和HUNK基因的任何核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的多核苷酸序列或其任何片段和/或互补物。

22.权利要求1-20中任何一项的组合物，其中所述甲基化DNA序列包含与SEQ ID NO: 1-45中的任何一个具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的多核苷酸序列或其任何片段和/或互补物。

23.权利要求1-22中任何一项的组合物，其中当在室温(23℃)下储存时，所述甲基化DNA模式在所述组合物中保存至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、两周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或2年。

24.权利要求1-22中任何一项的组合物，其中当在4℃下储存时，所述甲基化DNA模式在所述组合物中保存至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、两周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或2年。

25.权利要求1-22中任何一项的组合物，其中当在-30℃至50℃范围内的温度下储存时，所述甲基化DNA模式在所述组合物中保存至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、两周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或2年。

26.权利要求1-22中任何一项的组合物，其中当在-10℃至30℃范围内的温度下储存时，所述甲基化DNA模式在所述组合物中保存至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、两周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或2年。

27.在生物样品中保存甲基化DNA分子的甲基化模式的方法，包括用储存溶液处理所述生物样品，其中所述储存溶液包含甲醇，和其中在室温下保存所述甲基化模式。

28.权利要求27的方法，其中所述甲基化模式保存至少两周。

29.权利要求27或28的方法，其中与储存之前的所述生物样品中的甲基化模式相比较，所述储存溶液中所述生物样品的甲基化模式保存至少65%。

30.权利要求27-29中任何一项的方法，其中所述生物样品储存于所述储存溶液中。

31.权利要求27-30中任何一项的方法，其中所述样品来自人体组织或体液。

32.权利要求27-31中任何一项的方法，其中所述生物样品为来自以下任何一种的样品：胃肠道、呼吸消化道、呼吸道、泌尿生殖道或体液。

33.权利要求32的方法，其中所述体液为以下的任何一种：血液、尿液、痰液、唾液、粪便、胆汁、胰液、鼻腔分泌物、眼泪、精液、阴道分泌物、脑脊液、胸膜液、腹膜液、胃液、心包液、汗液、淋巴液、囊液、胰腺囊液、滑液、关节液、月经液、子宫内膜冲洗液、乳房抽吸液或羊水。

34.权利要求27-31中任何一项的方法，其中所述生物样品为来自以下任何一种的样品：食道、胃、结肠、小肠、胰腺、肝脏、口腔、口咽、气管、支气管树、肺部或乳房。

35.权利要求34的方法，其中所述样品为食道样品。

36.权利要求27-35中任何一项的方法，其中所述储存溶液包含100%甲醇。

37.权利要求27-35中任何一项的方法，其中所述储存溶液包含与水混合的10%-100%甲醇。

38.权利要求27-35中任何一项的方法，其中所述储存溶液包含与水混合的10-90%甲醇。

39.权利要求27-35中任何一项的方法，其中所述储存溶液包含与水混合的20-90%甲醇。

40.权利要求27-35中任何一项的方法，其中所述储存溶液包含与水混合的30-90%甲醇。

41.权利要求27-35中任何一项的方法，其中所述储存溶液包含与水混合的30-80%甲醇。

42.权利要求27-35中任何一项的方法，其中所述储存溶液包含与水混合的40-70%甲醇。

43.权利要求27-35中任何一项的方法，其中所述储存溶液包含与水混合的40-60%甲醇。

44.权利要求27-43中任何一项的方法，其中所述甲醇不含或者以低于或等于0.001%的水平含过氧化物。

45.权利要求37-44中任何一项的方法，其中所述水通过蒸馏或超滤或反渗透来纯化。

46.权利要求37-44中任何一项的方法，其中所述水不含DNA酶和/或RNA酶活性。

47.权利要求27-46中任何一项的方法，其中在波形蛋白基因的差异性甲基化结构域或CCNA1基因的差异性甲基化结构域内测定所述DNA甲基化的模式。

48.权利要求47的方法，其中所述波形蛋白的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 1-5或对应于chr10:17,270,838-17,271,717的SEQ ID NO: 18中的任何一个具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列或其互补物和/或片段。

49.权利要求47的方法，其中所述波形蛋白的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 1-5中的任何一个具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。

50.权利要求47的方法，其中所述CCNA1的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 6或7具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。

51.权利要求27-46中任何一项的方法，其中在Up10、Up35-1和/或Up35-2核苷酸序列的差异性甲基化结构域内测定所述DNA甲基化的模式。

52.权利要求51的方法，其中所述Up10的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 8-11中的任何一个具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。

53.权利要求51的方法，其中所述Up35-1的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 12-15中的任何一个具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。

54.权利要求51的方法，其中所述Up35-2的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 12-13和16-17中的任何一个具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。

55.权利要求38-54中任何一项的方法，其中所述核苷酸序列、所述互补物或所述片段的长度为至少20个核苷酸。

56.权利要求27-46中任何一项的方法，其中在与包含同波形蛋白、CCNA1、FER1L4、VAV3、DOCK10、ADCY1、BMP3、CD1D、ELMO1、ELOVL2、LRRC4、NDRG4、SFMBT2、ST8SIA1、TSPYL5、ZNF568、ZNF569、ZNF610、ZNF671、ZNF682、CDKN2A、DIO3和/或HUNK基因的任何核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列或其任何片段和/或互补物的DNA分子相关的差异性甲基化结构域内测定所述DNA甲基化的模式。

57.权利要求56的方法，其中所述差异性甲基化结构域与包含同由基因组坐标指定的任何核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段的DNA分子相关：

。

58.权利要求56的方法，其中所述ADCY1的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 19具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。

59.权利要求56的方法，其中所述BMP3的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 20或21具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。

60.权利要求56的方法，其中所述CD1D的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 22具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。

61.权利要求56的方法，其中所述CDKN2A的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 23或24具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。

62.权利要求56的方法，其中所述DIO3的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 25具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。

63.权利要求56的方法，其中所述DOCK10的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 26具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。

64.权利要求56的方法，其中所述ELMO1的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 27具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。

65.权利要求56的方法，其中所述ELOV12的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 28具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。

66.权利要求56的方法，其中所述FER1L4的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 29具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。

67.权利要求56的方法，其中所述HUNK的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 30具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。

68.权利要求56的方法，其中所述LRRC4的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 31具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。

69.权利要求56的方法，其中所述NDRG4的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 32具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。

70.权利要求56的方法，其中所述SFMBT2的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 33、34、35或36中的任何一个具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。

71.权利要求56的方法，其中所述ST8S1A1的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 37具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。

72.权利要求56的方法，其中所述TSPYL5的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 38具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。

73.权利要求56的方法，其中所述VAV3的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 39具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。

74.权利要求56的方法，其中所述ZNF568的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 40或41具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。

75.权利要求56的方法，其中所述ZNF569的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 42具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。

76.权利要求56的方法，其中所述ZNF610的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 43具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。

77.权利要求56的方法，其中所述ZNF671的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 44具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。

78.权利要求56的方法，其中所述ZNF682的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 45具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。

79.权利要求57-78中任何一项的方法，其中所述核苷酸序列、互补物或所述片段的长度为至少20个核苷酸。

80.权利要求27-79中任何一项的方法，其中所述DNA甲基化的模式通过包括用将胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的亚硫酸氢盐化合物处理DNA的步骤来测定。

81.权利要求27-80中任何一项的方法，其中当在室温(23℃)下储存时，所述甲基化DNA模式在所述组合物中保存至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、两周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或2年。

82.权利要求27-80中任何一项的方法，其中当在4℃下储存时，所述甲基化DNA模式在所述组合物中保存至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、两周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或2年。

83.权利要求27-82中任何一项的方法，其中在-30℃至50℃范围内的温度下，甲基化DNA模式在所述组合物中保存至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、两周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或2年。

84.权利要求27-82中任何一项的方法，其中在-10℃至30℃范围内的温度下，甲基化DNA模式在所述组合物中保存至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、两周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或2年。

85.保存生物样品的DNA甲基化模式的方法，其中所述生物样品用DNA/RNA Shield处理和/或储存于其中。

技术总结
本公开提供用于在一段时间内保存DNA甲基化模式的储存溶液的方法。本公开还提供使用储存于这种储存溶液中的甲基化DNA的方法。

技术研发人员：S·D·马科维茨;H·莫伊诺瓦;D·乌尔特曼;
受保护的技术使用者：卡斯西部储备大学;
技术研发日：2020.05.28
技术公布日：2022.03.18