一种药物缓释载体、缓释药物组合物及其应用的制作方法

discovery,2014,13(9):655-672.)。传统的缓释镇痛制剂往往仅搭载一种镇痛药物，因为缓释时长有限，难以进一步提高镇痛效果。同时，考虑到疼痛发生机制改变的现象，若能开发同时搭载两种不同机制的镇痛药物的缓释镇痛制剂，并能够顺应疼痛发生机制的改变释放相应镇痛机制的药物(如早期抑制疼痛刺激传入的局麻药和中期抑制外周和中枢炎症反应的nsaids)，就能在实现长效镇痛的同时，进一步满足多模式镇痛原则，提高镇痛效能。


技术实现要素：

6.为了弥补现有技术和应用效果的不足，本发明的目的在于提供多种活性成分的缓释药物组合物和系统。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.本发明第一方面提供了一种药物缓释载体/系统，所述缓释载体/系统包括负载第一药物的凝胶，和负载第二药物的静电纺丝。
9.进一步，所述凝胶为温敏凝胶。
10.进一步，温敏凝胶由共聚物溶解于缓冲液中制备而成。
11.进一步，所述共聚物选自聚环氧乙烷(peo)、果胶、cht-pegdma-maa(壳聚糖-聚乙二醇二甲基丙烯酸酯-甲基丙烯酸)共聚物颗粒、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(pegdma)、羟丙基甲基纤维素(hpmc)、结冷胶、明胶、聚甲基丙烯酸-共-乙基丙烯酸乙酯(eudragit)、壳聚糖、聚二甲基硅氧烷(pdms)、黄原胶、泊洛沙姆407、聚丙烯酸(paa)、藻酸盐、聚n-异丙基丙烯酰胺、聚磷腈、聚乳酸pla、聚乳酸-羟基乙酸共聚物plga、plga，pla衍生物中的一种或几种。
12.进一步，所述共聚物选自plga，pla衍生物。
13.进一步，所述plga，pla衍生物包括peg-plga、peg-pla、pei-plga、pei-pla、plga-peg-plga。
14.进一步，所述plga，pla衍生物为plga-peg-plga。
15.进一步，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
16.进一步，所述静电纺丝由聚合物制备而成。
17.进一步，所述聚合物选自聚环氧乙烷(peo)、果胶、cht-pegdma-maa(壳聚糖-聚乙二醇二甲基丙烯酸酯-甲基丙烯酸)共聚物颗粒、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(pegdma)、羟丙基甲基纤维素(hpmc)、结冷胶、明胶、聚甲基丙烯酸-共-乙基丙烯酸乙酯、壳聚糖、聚二甲基硅氧烷(pdms)、黄原胶、泊洛沙姆407、聚丙烯酸(paa)、藻酸盐、聚n-异丙基丙烯酰胺、聚磷腈、聚乳酸(pla)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)、plga及pla衍生物中的一种或几种。
18.进一步，所述聚合物为plga。
19.本发明第二方面提供了一种缓释药物组合物，所述药物组合物包括第一药物、第二药物和本发明第一方面所述的缓释载体/系统。
20.进一步，所述第一药物为局麻药。
21.进一步，所述局麻药选自酰胺类麻醉剂。
22.进一步，所述酰胺类麻醉剂选自利多卡因、布比卡因、左旋布比卡因、罗哌卡因、甲哌卡因、吡咯卡因、阿替卡因和/或丙胺卡因。
23.进一步，所述酰胺类麻醉剂为布比卡因。
24.进一步，所述布比卡因为盐酸布比卡因。
25.进一步，第一药物与凝胶溶液的重量体积比为0.5-1.5％。
26.进一步，第一药物与凝胶溶液的重量体积比为1％。
27.进一步，所述第二药物为消炎镇痛药。
28.进一步，所述消炎镇痛药选自非甾体类消炎药。
29.进一步，所述非甾体类消炎药选自阿司匹林、对乙酰氨基酚、吲哚美辛、舒林酸、依托度酸、甲灭酸、甲氯灭酸、甲氯灭酸钠、氟灭酸、托美汀、酮咯酸、双氯芬酸、双氯芬酸钠、布洛芬、萘普生、萘普生钠、非诺洛芬、酮洛芬、氟比洛芬、奥莎普秦、吡罗昔康、美洛昔康、安吡昔康、屈恶昔康、氯诺昔康、辛诺昔康、舒多昔康和/或替诺昔康。
30.进一步，所述非甾体类消炎药为对乙酰氨基酚。
31.进一步，第二药物与plga的质量比为50％。
32.本发明第三方面提供了本发明第二方面所述的缓释药物组合物的制备方法，所述制备方法包括将负载第二药物的静电纺丝混于负载第一药物的凝胶溶液中。
33.进一步，所述制备方法进一步包括低温搅拌形成悬浊液。
34.进一步，所述制备方法进一步包括37℃搅拌形成凝胶。
35.进一步，所述将电纺丝与凝胶溶液的质量体积比为4％。
36.进一步，负载第一药物的凝胶的制备方法包括：
37.1)将第一药物溶解于缓冲液中；
38.2)将共聚物低温溶解于含有药物的缓冲液中。
39.进一步，2)中共聚物按15％-25％质量体积比溶解于缓冲液中。
40.进一步，2)中共聚物按18％-22％质量体积比溶解于缓冲液中。
41.进一步，2)中聚物按20％质量体积比溶解于缓冲液中。
42.进一步，2)溶解的环境温度为22-24℃。
43.进一步，负载第二药物的静电纺丝的制备方法包括：
44.将第二药物溶解于制备静电纺丝的聚合物溶液中，制备纺丝液；
45.采用静电纺丝技术制备负载药物的静电纺丝。
46.进一步，使用六氟异丙醇溶解聚合物。
47.进一步，所述聚合物与六氟异丙醇的质量体积比为20-40:100。
48.进一步，聚合物与六氟异丙醇的质量体积比为25-35:100。
49.进一步，聚合物与六氟异丙醇的质量体积比为30:100。
50.进一步，静电纺丝参数设置：推注速度0.05mm/min，接收器的转速调至10-200r/min，电场内保持约1kv/cm，环境温度20-30℃，湿度30-40％。
51.本发明第四方面提供了如下任一项所述的应用：
52.1)本发明第一方面所述的缓释载体/系统在制备多种活性成分的缓释药物中的应用；
53.2)本发明第二方面所述的药物缓释组合物在制备治疗疾病的药物中的应用；
54.3)本发明第三方面所述的制备方法在制备多种活性成分的缓释药物中的应用。
55.进一步，所述疾病选自疼痛和炎症。
56.进一步，所述疼痛选自急性疼痛、慢性疼痛。
57.进一步，所述疼痛选自慢性疼痛。
58.进一步，所述疼痛为术后慢性疼痛。
59.进一步，所述药物还包括所述药物制剂还包括药学上可接受的载体。
60.进一步，所述药物的剂型包括口服剂，经皮剂，埋植剂，粘膜贴剂，注射剂。
61.本发明的第五方面提供了一种药物制剂，所述药物制剂包括本发明第二方面所述的缓释药物组合物。
62.进一步，所述药物制剂还包括药学上可接受的载体。
63.进一步，所述药物制剂包括口服剂，经皮剂，埋植剂，粘膜贴剂，注射剂。
64.本发明的优点及有益效果：
65.本发明的药物缓释载体，可以负载不同的活性成分，实现第一药物的充分释放，缓解静电纺丝的第二药物的早期少量丢失，同时利用静电纺丝的长时且后期释放的特点，实现第二药物的充分释放。
66.本发明的缓释药物组合物，可以实现不同活性成分的充分释放和缓释载体的充分降解，且不同活性成分的释放无相互影响。
67.本发明的镇痛缓释药物组合物，同时搭载两种不同机制的镇痛药物，能在实现长效镇痛的同时，进一步满足多模式镇痛原则，提高了镇痛效能。
附图说明
68.图1是静电纺丝的电镜图。
69.图2是药物的红外光谱图，其中，2a是盐酸布比卡因的红外光谱图，2b是plga-peg-plga的红外光谱图，2c是负载盐酸布比卡因的plga-peg-plga红外光谱图，2d是对乙酰氨基酚的红外光谱图，2e是plga静电纺丝的红外光谱图，2f是负载对乙酰氨基酚的plga静电纺丝的红外光谱图；
70.图3是药物的体外缓释结果图。
71.图4是各组的机械痛阈结果图。
具体实施方式
72.本发明经过广泛而深入的研究，首次构建了搭载不同活性成分的药物缓释系统，该缓释系统可以实现不同活性成分的充分、顺序释放，同时缓释载体可以充分降解，安全无毒性。
73.在本发明中，术语“药学上可接受的”载体是指在合理的医学判断范围内适合用于与受试者的组织接触而没有不适当的毒性、刺激性、过敏反应等的物质，其与合理的收益风险比相对应，并有效用于其预期用途。
74.术语“治疗”通常是指获得有益的或所需的临床结果的途径。例如，“治疗”在多个方面中是指改善、逆转、缓解、抑制受试者疾病/障碍或病症的进程，或者预防受试者疾病/障碍或病症，或者指预防受试者所述疾病/障碍或病症的一种或更多种症状。
75.术语“治疗有效量”是指当向受试者(包括哺乳动物，例如人)给药时足以获得所需结果的量。本文所描述的化合物的有效量可以根据诸如受试者的疾病状态、年龄、性别和体重等因素而变化。如本领域技术人员所理解的，可以调整剂量或治疗方案以提供最佳的治
疗反应。
76.术语“活性成分”、“活性药剂”或“活性物质”是指具有生物学、化学或生理学用途的任何化合物，包括但不限于：活性药物成分；药物；天然存在的化合物；核酸化合物；肽化合物；生物制剂；营养食品、农业或营养成分或者合成药物，包括成瘾性物质，如阿片类激动剂或麻药性止痛剂；安眠药；安定药；兴奋剂和抗抑郁药。在本发明的具体实施方式中所述活性成分为活性药物成分。
77.术语“磷酸盐缓冲液”是指含有磷酸氢二钠和氯化钠的任何缓冲溶液。一些这样的缓冲溶液除了钠阳离子之外还含有钾阳离子或代替钠阳离子。无论如何，本领域技术人员充分知晓可添加至这些溶液中的相容的无机化合物和有机化合物(可商购或在实验室中以标准方式制备)，因为只要不改变溶液保持合理的恒定ph值的能力，就可以根据需要进行小的修改/添加(诸如添加相对少量的ca
2
、fe
3
和/或乙二胺四乙酸(etda))。
78.根据本发明，以缓释制剂的形式给予本文所述的药物。本文所理解的其它表述，如“延释”、“控释”、“修饰的释放”、“迟释”或“制剂”具有与“缓释制剂”相同的意思。只要确保为缓释的，原则上这类制剂是本领域技术人员可以想到的任何形式，包括用于口服(固体、半固体、液体)、皮肤(皮肤贴剂)、舌下、肠胃外(注射)、眼部(滴眼剂、凝胶或软膏)或直肠(栓剂)给药的药物形式。
79.本文中所描述的药物制剂可以为片剂、丸剂、囊片、胶囊、含有粉末或颗粒的冲剂、粉剂、颗粒剂、球、珠、小丸、液体溶液或混悬液、乳剂、或者填充其的胶囊、贴剂、类似物、及其组合。
80.在本发明中，“缓释药物组合物”、“缓释药物”可互换使用。
81.局麻药/局部麻醉剂
82.术语“局麻药”、“局部麻醉剂”或“局部麻醉药物”在本发明中可互换使用，包含一组或多组物质，可于个体的限定区域经由减少神经末梢激发或抑制外周神经传导过程导致感觉减退或丧失。在一些实施方式中，局部麻醉药物为酰胺类麻醉剂。典型酰胺类麻醉剂结构包含亲脂部分以及藉由酰胺键结(
–
nhco
–
)的亲水部分。合适的酰胺类麻醉剂包括但不限于利多卡因、布比卡因、左旋布比卡因、罗哌卡因、甲哌卡因、吡咯卡因、阿替卡因、丙胺卡因。在本发明中，前述的酰胺类麻醉剂作为活性成分存在，通常还包括其碱、其药学上可接受的前药、其药学上可接受的衍生物、其药学上可接受的络合物、其药学上可接受的盐、其药学上可接受的多晶型物、其药学上可接受的水合物、其药学上可接受的溶剂化物、其对映异构体和其外消旋体中的至少一种。例如本发明所述的布比卡因包括但不限于布比卡因、其碱、其药学上可接受的前药、其药学上可接受的衍生物、其药学上可接受的络合物、其药学上可接受的盐、其药学上可接受的多晶型物、其药学上可接受的水合物、其药学上可接受的溶剂化物。
83.作为一种可选择的实施方式，局部麻醉剂为布比卡因。
84.作为一种优选的实施方式，所述局部麻醉剂为盐酸布比卡因。
85.消炎镇痛药
86.在本技术的实施方案中，消炎镇痛药负载在静电纺丝中。在优选的实施方案中，消炎镇痛药选自非甾体类消炎药(nsaids)。本技术的nsaids包括但不限于阿司匹林、乙酰氨基酚、吲哚美辛、舒林酸、依托度酸、甲灭酸、甲氯灭酸、甲氯灭酸钠、氟灭酸、托美汀、酮咯
酸、双氯芬酸、双氯芬酸钠、丙酸衍生物，例如布洛芬、萘普生、萘普生钠、非诺洛芬、酮洛芬、氟比洛芬和奥莎普秦，和烯醇酸，例如吡罗昔康、美洛昔康，和其他昔康类，例如安吡昔康、屈恶昔康、pivoxicam、氯诺昔康、辛诺昔康、舒多昔康、和替诺昔康。特别地，本技术的制剂中的nsaids可包括对乙酰氨基酚。
87.静电纺丝
88.静电纺丝是一种高效的纤维制备工艺，可用于组装包含纳米至微米范围的纤维直径的纤维聚合物膜。静电工艺方法使用高压电场将一定极性的电流注入到聚合物溶液/熔融物中，使该溶液/熔融物朝相反极性的收集表面加速，从而形成固体纤维。静电纺丝(形成)的纤维基质具有表面积相对较大的三维孔隙结构。良好的纤维形成要求溶液参数和静电纺丝构型的优化。静电纺丝过程中的控制性参数影响药物从膜基质中的释放模式。以这种方式，可定制静电纺丝膜基质以实现所需的药物释放模式。用于静电纺丝的聚合物诸如聚苯胺、聚乙炔、聚吡咯等，和(一种或多种)活性物质、溶剂和辅料一起，以溶液、悬液、乳液或熔融物形式混合，可施加从约1-20kv的电压至聚合物溶液、悬液、乳液或熔融物形式。可通过直接溶解、悬浮或以乳液形式将活性物质掺入。用于制备静电纺丝溶液的合适溶剂包括水以及有机和无机溶剂。典型的辅料是增塑剂、表面活性剂和/或消泡剂。还可使用催化剂，包括但不限于酸，诸如盐酸、乙酸和甲酸。
89.组合物、药学上可接受的载体
90.在本发明中，组合物可以是适合注射给药的剂型、适合口服摄取的剂型(如胶囊、片剂、囊片、酏剂)、适合局部给药的油膏、乳膏或洗剂形式、适合用作滴眼剂的递送剂型、适合通过吸入给药的气雾剂形式(如通过鼻内吸入或口吸入)、适合胃肠外给药的剂型，即皮下、肌肉内或静脉内注射。
91.对于可注射溶液或悬液的给药，无毒的胃肠外可接受的稀释剂或载体可包括林格氏溶液、等渗盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇和1，2丙二醇。
92.用于口服的合适载体、稀释剂、赋形剂和佐剂的一些实例包括花生油、液体石蜡、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、海藻酸钠、阿拉伯胶、黄耆树胶、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、明胶和卵磷脂。另外，这些口服剂型可含有合适的调味剂和着色剂。当以胶囊剂型使用时，胶囊可用能延缓崩解的化合物包被，如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
93.佐剂典型地包括润滑剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、杀菌剂和缓冲剂。
94.口服给药的固体剂型可包含在人和兽医药学实践中可接受的粘合剂、增甜剂、稀释剂、调味剂、包衣剂、防腐剂、润滑剂和/或延时剂(timedelayagent)。合适的粘合剂包括阿拉伯胶、明胶、玉米淀粉、黄耆树胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素或聚乙二醇。合适的增甜剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿斯巴特或糖精。合适的稀释剂包括乳糖、山梨醇、甘露醇、右旋糖、高岭土、纤维素、碳酸钙、硅酸钙或磷酸二钙。合适的调味剂包括薄荷油、冬青油、樱桃、柑橘或树莓调味剂。合适的包衣剂包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或它们的酯类的聚合物或共聚物、蜡、脂肪醇、玉米蛋白、虫胶或麸质。合适的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素e、α-生育酚、抗坏血酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或亚硫酸氢钠。合适的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石。合适的延时剂包括单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
95.用于口服给药的液体剂型除了上述药物以外，还可包含液体载体。合适的液体载
体包括水、油类如橄榄油、花生油(peanutoil)、麻油、向日葵油、红花油、花生油(arachisoil)、椰子油、液体石蜡、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、异丙醇、甘油、脂肪醇、甘油三酯或其混合物。
96.用于口服给药的悬液可进一步包括分散剂和/或悬浮剂。合适的悬浮剂包括羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙稀吡咯烷酮、海藻酸钠或乙酰乙醇。合适的分散剂包括卵磷脂、如硬脂酸之类的脂肪酸的聚氧乙烯酯类、聚氧乙烯山梨醇单-或二-油酸酯、-硬脂酸酯或-月桂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单-或二-油酸酯、-硬脂酸酯或-月桂酸酯和类似物。
97.用于口服给药的乳剂可进一步包括一种或多种乳化剂。合适的乳化剂包括上面所例举的分散剂或天然树胶，如瓜尔胶、阿拉伯胶或黄耆树胶。
98.术后镇痛的当前特征包括用局部麻醉剂进行伤口渗透，结合nsaids和阿片类药物的全身给药。阿片类药物具有相当大缺点，包括监测和治疗阿片类药物相关的副作用所需的时间选择和资源。因此临床实际应用期望减少使用术后阿片类药物以降低其副作用的发生率和严重程度，例如呼吸抑制、恶心、呕吐、便秘、嗜睡、瘙痒和尿潴留。本技术实施方案向创伤部位提供了局麻药和nsaids的延长释放制剂，由此减少甚至避免使用全身阿片类药物。
99.在任意实施方案中，本技术的药物制剂可通过推注给药，例如皮下推注、关节内推注、肌内推注、皮内推注等。在任意实施方案中，给药可通过输注进行，例如皮下输注、关节内输注、肌内输注、皮内输注等。在任意实施方案中，给药可为通过局部注射入伤口边缘内，或滴注入切口内，或其组合进行的直接伤口渗透。所述药物制剂也可通过其他给药途径进行给药以治疗局部炎症或疼痛，包括但不限于局部、眼部、眼内、鼻和耳递送。
100.在某些实施方案中，所述药物制剂任选地包括药物可接受的载体。包含这些化合物的有效可注射组合物可以为悬浮液或溶液形式。在合适制剂的制备中，将认识到一般而言酸加成盐的水溶性大于游离碱的水溶性。类似地，相比于中性溶液或碱性溶液，碱更易溶于稀释的酸或酸性溶液中。
101.在溶液形式中，所述化合物溶解于生理可接受的介质中。这样的介质包括合适的溶剂、等张剂例如蔗糖或盐水、防腐剂例如苄醇，若需要，和缓冲液。例如，有用的溶剂包括水和水性醇、乙二醇和碳酸酯，例如碳酸二乙酯。
102.可注射的悬浮液组合物需要含或不含佐剂的液体助悬溶媒作为介质。助悬溶媒可为例如氯化钠、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇或上述组合的水溶液。
103.适当的生理可接受的佐剂是保持化合物悬浮于悬浮液组合物所需要的。佐剂可选自增稠剂，例如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和藻酸盐。许多表面活性剂还可用作助悬剂。卵磷脂、烷基酚聚环氧乙烷加合物、萘磺酸盐、烷基苯磺酸盐和聚氧乙烯山梨糖酯是有用的助悬剂。
104.影响液体助悬溶媒的亲水性、密度和表面张力的许多物质可帮助在各个情况下制备可注射悬浮液。例如，有机硅消泡剂、山梨醇和糖可为有用的助悬剂。
105.如本文所使用，除非另外说明，药物的“释放的速率”、“释放速率”、或“溶出速率”是指每单位时间从剂型释放的药物的量，例如，每小时释放药物的毫克数(mg/hr)，或每小时释放的总药物剂量的百分比。剂型的药物释放速率通常按药物的体外释放速率测量，即，
在适当的条件下和适合的流体中测量的每单位时间从该剂型释放的药物量。通过将待测试的剂型置于适当的溶出池(dissolutionbath)，测量其中的介质中来测定本文中涉及的释放速率。将在预定时间间隔收集的介质的等分试样注射到装备有适当检测器的色谱系统中，以量化在测试间隔期间释放的药物的量。
106.在本发明中，药物治疗对象受包括指动物界的任何成员，通常是哺乳动物。术语“哺乳动物”是指归类为哺乳动物的任何动物，包括人类、其它高等灵长类、家养动物和农场动物，以及动物园、体育运动或宠物动物，如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔子等。作为优选的实施方案，所述治疗对象为人类。
107.下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。
108.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
109.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
110.实施例1复合顺序缓释系统的制备
111.1、实验材料
112.plga1654-peg1500-plga1654：x-pls35，10g，杭州
113.plga：lactide:glycolide 65:35,mw 40,000
–
75,000，p2066，美国
114.2、温敏凝胶的制备
115.向磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline,pbs)中加入1％w/v盐酸布比卡因，低温搅拌溶解，将plga-peg-plga共聚物按20％质量体积比溶解于含有盐酸布比卡因的pbs中，静止溶解，保持环境温度22-24℃。
116.3、plga静电纺丝的制备
117.使用六氟异丙醇以30：100的质量体积比溶解plga。向所得溶液中加入对乙酰氨基酚，使得对乙酰氨基酚与plga的质量比为50％。将获得的溶液装进注射器中，注射器针头距离接收器约10cm。静电纺丝参数设置为推注速度0.05mm/min，接收器的转速调至200r/min，针头接正极，接收器接负极，电场内保持约1kv/cm。
118.4、复合顺序缓释系统/程序缓释的制备
119.将获得的静电纺丝以4％质量体积比混于凝胶溶液中，低温搅拌24h，形成均质的悬浊液，再于37℃搅拌30min形成凝胶。
120.实施例2程序缓释镇痛载体材料学特性测试
121.1、电子显微镜成像
122.用液氮冻干裁剪一定大小的静电纺丝，将样品蒸涂金导电膜。在一定电压和放大倍数下观察。
123.2、ftir实验
124.称取一定量的plga-peg-plga、plga、盐酸布比卡因粉末、对乙酰氨基酚粉末。测试条件为40kv，150ma，开始角度为5
°
，结束角度为60
°
，以0.02
°
的间隔递增，结果以2θ表示。
125.3、缓释系统体外释放实验
126.将一定质量的载药温敏凝胶、静电纺丝、凝胶/静电纺丝混合物置入透析袋中。将1ml pbs注入透析袋中，悬吊于装有15ml pbs的离心管中，保证透析袋浸没于离心管的pbs中。将离心管在37℃，60rpm的条件下匀速转动。在特定的时间点取离心管中200μl pbs于ep
管中，保存至-20℃冰箱中。离心管中补足200μl新鲜pbs。使用高效液相色谱法测量各时间点样品中盐酸布比卡因和对乙酰氨基酚的浓度。
127.4、结果
128.电镜结果显示，静电纺丝是无序的，直径约为2μm(图1)。
129.ftir实验结果显示，载体和药物之间没有发现化学反应，没有破坏各个物质本身的化学键，以及没有形成新的化学键(图2)。
130.体外缓释结果如表1和图3所示，不管是包裹在外面的温敏凝胶，还是被包裹的静电纺丝，所搭载药物的释放速度都减慢了。避免了早期的药物突释，同时实现更长的释放时间。同时包裹在外面的温敏凝胶的释放速率比被包裹的静电纺丝释放速率快，能实现药物的先后释放。
131.表1体外缓释结果
[0132][0133]
实施例3程序缓释镇痛载体系统镇痛效能实验
[0134]
1.大鼠坐骨神经压迫慢性痛模型(chronic constriction injury of the sciatic nerve,cci)的建立
[0135]
按60mg/kg腹腔注射戊巴比妥钠，麻醉后用电剃须刀剃去右侧大腿毛发。随后大鼠俯卧位置于保温毯上，从肛门处轻轻置入温度探头，设置术中体温37～38℃。沿股骨的外侧切开大鼠皮肤约1cm，用弯头镊钝性分皮下组织，至肌肉层后沿着股二头肌肌肉纹理钝性分离，可见坐骨神经。用弯镊游离7mm的坐骨神经，使用4-0的缝线，依次从近心端向远心端四次。结扎程度以下肢出现轻微肌肉收缩或活动为宜。结扎后缝合皮肤，并消毒。
[0136]
2.大鼠cci模型的行为学实验
[0137]
将实验分为cci模型组，负载盐酸布比卡因的温敏凝胶组、负载对乙酰氨基酚的静电纺丝组、以及程序缓释组四组，每组6只大鼠，分别于术前3d获得大鼠机械痛阈基线值(0d)，术后1、3、7、14、21、28、35d测试大鼠机械痛阈值。测试当天，在安静环境中将大鼠单独置入多孔钢丝笼中适应15min。用电子von frey测试针垂直刺激大鼠手术部位周围2cm区域皮肤，出现躲避反射时记录记录仪上数值。每只大鼠测试3次，每次测试间隔30s。术后21d出现数值显著降低的大鼠即视为出现术后慢性疼痛(chronic post-surgical pain，cpsp)。
[0138]
3、大鼠cci模型脊髓胶质细胞标记物iba-1和gfap的检测
[0139]
取术后35d的各组大鼠，戊巴比妥钠腹腔麻醉后，取t3-t5节段大鼠术侧脊髓，进行iba-1和gfap的免疫荧光染色。
[0140]
4、结果
[0141]
行为学结果如图4和表2所示，程序缓释可以在单药缓释的基础上进一步延长药物作用时间，提高镇痛效果。
[0142]
表2机械痛阈值
[0143]
时间点cci温敏凝胶静电纺丝程序缓释015.883915.518615.926315.5813110.922211.824016.5744*14.83*36.338112.4919*9.7558*12.0389*76.53839.182311.2296*11.8922*148.824711.594510.728313.7828*2110.608111.170811.202813.43722812.359213.915312.117213.70653514.319415.567313.706514.3767
[0144]
*为各组和cci组对应时间点机械痛阈有显著差异
[0145]
免疫荧光染色结果如表3和表4所示，iba1和gfap在各组间存在显著性差异，程序缓释组＜温敏凝胶组＜静电纺丝组＜cci组。
[0146]
表3iba1的水平
[0147][0148]
表4gfap的水平
[0149][0150][0151]
实施例4程序缓释镇痛系统安全性实验
[0152]
1.肌肉毒性实验
[0153]
将大剂量不含药物的载体材料置入大鼠股四头肌周围，分别在术后1、7、21d取实
验组大鼠及正常大鼠的股四头肌任意部分或明显病变部分，固定于10％的甲醛溶液中，脱水、包埋、切片，并进行h&e染色。在10
×
20倍显微镜下观察肌肉样品是否出现明显病变(核位移、淋巴细胞及巨噬细胞聚集等)。
[0154]
2、神经毒性实验
[0155]
将大剂量缓释载体置入大鼠坐骨神经周围，分别在术后1、7、21d取实验组大鼠及正常大鼠的坐骨神经任意部分或明显病变部分，固定于10％的甲醛溶液中，所得样品脱水后进行树脂包埋，并进行半薄切片，后用甲苯胺蓝染色。在10
×
20倍显微镜下观察神经样品是否出现明显病变(脱髓鞘、轴突丢失、炎性细胞浸润等)。
[0156]
3、系统毒性实验
[0157]
分别在术后1、7、21d取实验组大鼠及正常大鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑任意部分或明显病变部分，固定于10％的甲醛溶液中，脱水、包埋、切片，并进行h&e染色。在10
×
10倍显微镜下观察器官组织中是否有水肿、坏死等改变。
[0158]
4、结果
[0159]
结果显示，毒性实验显示，静电纺丝组、凝胶组、程序缓释组肌肉样品和神经样品未出现明显病变；实验组大鼠及正常大鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑未出现水肿、坏死等改变，说明本技术的载体材料安全性较高。
[0160]
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。