一种用于抗肿瘤药物递送的糖胺聚糖改性物及其制备方法与应用与流程

1.本发明属于生物医学工程材料领域，特别涉及一种用于抗肿瘤药物递送的糖胺聚糖改性物及其制备方法与应用。


背景技术：

2.肿瘤治疗属于国际前沿研究课题。作为肿瘤的主要疗法之一，以化学药物来治疗肿瘤的化学疗法在临床中得到普遍应用，已有近百种抗肿瘤药物被批准上市。目前，肿瘤化疗从过去的单一化学药物治疗，步入到联合用药和综合用药时代，化疗取得了长足的进步，对于某些患者甚至达到治愈的效果。但现有抗肿瘤药远不能满足临床需要，存在毒副作用大、体内循环时间短等不足。
3.硫酸软骨素是一种硫酸化糖胺聚糖的异聚体，大量存在于皮肤、软骨、肌腱、心脏瓣膜和中枢神经系统等组织中，在体内发挥着重要的生理作用。硫酸软骨素优良的水溶性和带负电荷、结构中存在易于修饰改性的羧基和羟基，可与肿瘤细胞表面的cd44特异性结合，具有优良的生物相容性和肿瘤靶向性。近年来，大量工作致力于硫酸软骨素在治疗肿瘤的探索研究，发现硫酸软骨素对于肿瘤的迁移、侵袭、血管生成等过程起到了重要的调控作用，同时，硫酸软骨素可以被肿瘤细胞内中过表达的透明质酸酶(haase)降解，这有助于硫酸软骨素为骨架的纳米载体在肿瘤细胞内的快速裂解以及药物的快速释放，为治疗肿瘤这一前沿科学问题提供独特的解决方案。但目前的硫酸软骨素主要是作为表面材料，对其他粒子进行表面修饰，载体载药量不高，难以负载芳香类疏水性药物。其两亲性改性物的研究较少，有较大的发展前景。


技术实现要素：

4.本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种用于抗肿瘤药物递送的糖胺聚糖改性物的制备方法。
5.本发明的另一目的在于提供所述方法制备得到的用于抗肿瘤药物递送的糖胺聚糖改性物。
6.本发明的再一目的在于提供所述用于抗肿瘤药物递送的糖胺聚糖改性物的应用。
7.本发明的目的通过下述技术方案实现：
8.一种用于抗肿瘤药物递送的糖胺聚糖改性物的制备方法，包括如下步骤：
9.(1)将1-芘丁酸n-羟基琥珀酰亚胺酯溶于二甲基亚砜(dmso)中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl)进行活化，再加入氨基聚乙二醇马来酰亚胺(nh
2-peg-mal)水溶液，搅拌反应，待反应结束后透析、旋蒸，得到pb-peg-mal；
10.(2)将糖胺聚糖溶于水中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl)进行活化，再加入n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和胱胺二盐酸盐进行反应，最后加入二硫苏糖醇继续反应，待反应结束后超滤、旋蒸，得到巯基化的糖胺聚糖；
11.(3)将步骤(1)中得到的pb-peg-mal和步骤(2)中得到的巯基化的糖胺聚糖加入到二甲基亚砜(dmso)中，使用紫外交联灯照射，再透析、冷冻干燥，得到糖胺聚糖改性物。
12.步骤(1)中所述的1-芘丁酸n-羟基琥珀酰亚胺酯、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和氨基聚乙二醇马来酰亚胺的摩尔比为(1～2)：(1～2)：1；优选为1：1.1：1。
13.步骤(1)中所述的氨基聚乙二醇马来酰亚胺(nh
2-peg-mal)的分子量为600～10000；优选为600～1000；更优选为1000。
14.步骤(1)中所述的芘丁酸琥珀酰亚胺的用量为按每100毫升二甲基亚砜(dmso)配比1～5g芘丁酸琥珀酰亚胺计算；优选为按每100毫升二甲基亚砜(dmso)配比3.85g芘丁酸琥珀酰亚胺计算。
15.步骤(1)中氨基聚乙二醇马来酰亚胺(nh
2-peg-mal)水溶液的浓度为0.01～0.05g/ml；优选为0.01g/ml。
16.步骤(1)和(2)中所述的活化的时间为0.5～4h；优选为1h。
17.步骤(1)中所述的搅拌反应的时间为6～48h；优选为24h。
18.步骤(1)和(2)中所述的透析所用的透析液为水；优选为蒸馏水。
19.步骤(1)和(2)中所述的透析为采用截留分子量3000～6000的透析袋进行透析；优选为采用截留分子量3000～6000的透析袋透析6～72h。
20.步骤(2)中所述的糖胺聚糖、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺、胱胺二盐酸盐和二硫苏糖醇的摩尔比为2：(1～2)：(1～2)：(1～2)：(1～2)；优选为2：1：1：1：1。
21.步骤(2)中所述的糖胺聚糖的用量为按每毫升水配比0.01～0.1g糖胺聚糖计算；优选为按按每毫升水配比0.1g糖胺聚糖计算。
22.步骤(2)中所述的糖胺聚糖为硫酸软骨素、透明质酸和肝素中的至少一种；优选为硫酸软骨素。
23.步骤(2)中所述的反应的时间为6～48h；优选为12h。
24.步骤(2)中所述的继续反应的时间为0.5～4h；优选为2h。
25.步骤(3)中所述的pb-peg-mal和巯基化的糖胺聚糖的摩尔比为(1～10)：1；优选为10：1。
26.步骤(3)中所述的巯基化的糖胺聚糖的用量为按每毫升二甲基亚砜(dmso)0.01～0.1g巯基化的糖胺聚糖计算。
27.步骤(3)中所述的紫外交联灯照射的条件为：50～400w紫外交联灯照射0.5～4h；优选为：320w紫外交联灯照射2h。
28.步骤(3)中所述的冷冻干燥的条件为：-80℃下冷冻干燥48h以上。
29.一种用于抗肿瘤药物递送的糖胺聚糖改性物，通过上述任一项所述的方法制备得到。
30.所述的用于抗肿瘤药物递送的糖胺聚糖改性物在制备抗肿瘤药物载体或抗肿瘤药物中的应用。
31.一种糖胺聚糖改性物/药物纳米复合物，通过如下方法制备得到：将上述糖胺聚糖改性物配制成糖胺聚糖改性物溶液，然后加入抗肿瘤药物，超声处理后在5～35℃条件下搅拌混合均匀，透析、过滤、冷冻干燥，得到糖胺聚糖改性物/药物纳米复合物。
32.所述的配制成糖胺聚糖改性物溶液所用的溶剂为水或pbs缓冲溶液；优选为ph值为7.2～7.4的pbs缓冲溶液。
33.所述的糖胺聚糖改性物溶液的浓度为0.5～5mmol/l；优选为1mmol/l。
34.所述的抗肿瘤药物和巯基化硫酸软骨素的摩尔比为1：(5～20)。
35.所述的抗肿瘤药物为疏水性抗肿瘤药物；优选为二苯并碘鎓盐；更优选抗肿瘤药物ym，其结构式如式i所示。
36.所述的超声处理的时间为30～60分钟。
37.所述的搅拌的时间为12～24小时。
38.所述的透析所用的透析液为水；优选为蒸馏水。
39.所述的透析为采用截留分子量为3000的透析袋进行透析；优选为采用截留分子量为3000的透析袋透析6～24h。
40.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
41.(1)本发明在硫酸软骨素羧酸基团上连接巯基，然后将芘丁酸偶联一段马来酸酐修饰的聚乙二醇，利用巯基和马来酸酐进行点击反应，合成芘丁酸-聚乙二醇改性的软骨素改性物；将芘丁酸作为疏水链连接到软骨素上，其含有的疏水芳香环赋予软骨素改性物通过π-π连接包合疏水性抗肿瘤药物能力，使软骨素改性物在抗肿瘤药物传递领域有潜在应用价值。
42.(2)本发明利用磁力搅拌、超声使软骨素改性物包合疏水性抗肿瘤药物，其利用改性物纳米胶束的疏水内核对疏水性抗肿瘤药物进行物理包埋，然后在体内微环境中，利用肿瘤细胞表面的cd44与软骨素特异性结合可使抗肿瘤药物在肿瘤病灶中快速分布和富集，纳米颗粒可以靶向至肿瘤部位，实现药物靶向治疗，同时软骨素改性物可被酶解，释放包埋的药物杀伤肿瘤组织，实现抗肿瘤目的，且利用软骨素改性物和聚乙二醇自身的高生物相容性，可将抗肿瘤药物全身毒性降至最低，改善了药物副作用。
43.(3)本发明选用可生物降解的软骨素作为主要原材料，有利于降低产物细胞毒性，且本发明采用点击化学反应来制备软骨素改性物，不仅反应条件温和、易于操作，而且高效(产率为40％～70％)、具有选择性，有望在生物医学领域发挥其潜在的应用价值。
44.(4)本发明制备的软骨素改性物生物相容性好，可生物降解，含有可负载疏水性抗肿瘤药物的疏水内核，同时具有一定的肿瘤靶向性，在治疗癌症和抗肿瘤药物传递研究方面显示出良好的应用前景。
附图说明
45.图1是sgpp的核磁氢谱图。
46.图2是sgpp-cy5和sgpp-cy5复合物的体外药物释放曲线图。
47.图3是sgpp-cy5和sgpp-cy5复合物的载药量对比图。
48.图4是sgpp-ym和sgpp-cy5复合物的平均粒径图；其中，a为sgpp-ym复合物的平均粒径；b为sgpp-cy5复合物的平均粒径。
49.图5是sgpp-ym复合物的透射电镜照片图。
50.图6是sgpp-cy5复合物的细胞摄取图(panc-1细胞：cd44阳性；hek-293细胞：cd44阴性)。
51.图7是sgpp-cy5复合物对内吞抑制剂的影响图。
52.图8是sgpp-ym复合物对细胞相对活力的影响图。
具体实施方式
53.下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
54.本发明中所述的室温为5～35℃；优选为25～30℃。
55.本发明实施例中所涉及的抗肿瘤药物ym为二苯并碘鎓盐，可根据中国专利(专利号为“201310070771.3”、名称为“一种二苯并碘鎓盐及其抗癌应用”；化合物11)制备得到，其结构式如下所示：
[0056][0057]
实施例1
[0058]
(1)取0.385g 1-芘丁酸n-羟基琥珀酰亚胺酯(cas号:114932-60-4)溶于10ml二甲基亚砜(dmso)中，加入0.21g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl)活化1h，再加入1g氨基聚乙二醇马来酰亚胺(nh
2-peg-mal；购自上海阿拉丁m163887，其分子量为1000)(这里可先用100毫升蒸馏水溶解，再加入到反应体系中)，室温搅拌24h，在蒸馏水中采用留分子量为3000～6000的透析袋透析6～72h后旋蒸得到pb-peg-mal。
[0059]
(2)取2g硫酸软骨素(麦克林试剂c875626)溶于20ml去离子水中并加入0.34g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl)活化1h，再加入0.253g n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和0.45g胱胺二盐酸盐(cas号：56-17-7)，室温反应12h，加入0.34g二硫苏糖醇反应2h，超滤后旋蒸得到巯基化的硫酸软骨素。
[0060]
(3)将pb-peg-mal与巯基化的硫酸软骨素按摩尔比为10：1共混加入到50ml dmso中，使用320w紫外交联灯照射2h，再在蒸馏水中采用留分子量为3000～6000的透析袋透析6～72h，-80℃下冷冻干燥48h，得到硫酸软骨素衍生物，又称为软骨素改性物sgpp，产率为45％。核磁氢谱见图1。
[0061]
实施例2
[0062]
将实施例1所制得的软骨素改性物sgpp溶于pbs缓冲溶液(ph＝7.4)配制成1mg/ml的溶液，然后加入抗肿瘤药物ym使其终浓度为200μmol/l，超声2s、间隔2s共30分钟，并室温搅拌12小时。将样品用截留量3000的透析袋透析6h(以水为透析液)，再过滤、冷冻干燥，得到硫酸软骨素改性物/药物纳米复合物(sgpp-ym)。
[0063]
实施例3
[0064]
将实施例1所制得的软骨素改性物sgpp溶于pbs缓冲溶液(ph＝7.4)配制成1mg/ml
的溶液，然后加入疏水染料cy5-cooh(lumiprobe)使其终浓度为200μmol/l，超声2s、间隔2s共30分钟，并室温搅拌12小时。将样品用截留量3000的透析袋透析6h(以水为透析液)，再过滤、冷冻干燥，得到硫酸软骨素改性物/染料纳米复合物(sgpp-cy5)。
[0065]
实施例4
[0066]
将硫酸软骨素(麦克林试剂c875626)溶于pbs缓冲溶液(ph＝7.4)配制成1mg/ml的溶液，然后加入疏水染料cy5-cooh使其终浓度为200μmol/l，超声2s、间隔2s共30分钟，并室温搅拌12小时。将样品用截留量3000的透析袋透析6h(以水为透析液)，再过滤、冷冻干燥，得到硫酸软骨素/染料纳米复合物(sgag-cy5)。
[0067]
实施例5
[0068]
将实施例3和实施例4所得复合物(sgpp-cy5、sgag-cy5)在pbs缓冲液(ph＝7.4)中进行体外药物释放实验(sgpp和硫酸软骨素的浓度为1mg/ml，cy5-cooh浓度为200μmol/l)，紫外分光法测试cy5浓度，测定波长为680nm，浓度(μmol/l)＝(吸收值-0.046)/0.26。得到cy5释放曲线如图2所示，载药量对比如图3所示。
[0069]
实施例6
[0070]
将实施例2所得复合物(sgpp-ym)配制成水溶液(sgpp浓度为0.1mg/ml)，利用动态光散射对其平均粒径进行分析，结果如图4a所示：复合物的粒径变化逐渐稳定在60～100nm。
[0071]
实施例7
[0072]
将实施例3所得复合物配(sgpp-cy5)制成水溶液(sgpp浓度为0.1mg/ml)，利用动态光散射对其平均粒径进行分析，结果如图4b所示：复合物的粒径变化逐渐稳定在60～100nm。
[0073]
实施例8
[0074]
取10μl实施例2所得复合物(sgpp-ym)配制成水溶液(sgpp浓度为0.1mg/ml)，滴在200目表面渡有炭膜的铜网上，滤纸吸干，磷钨酸溶液染色，滤纸吸干，采用jem-2010hr型透射电子显微镜(japan)观察。
[0075]
结果如图5所示，复合物形成了紧密的球形结构，透射电镜照片粗略显示纳米粒子直径在50～100nm左右。因此，sgpp-ym可以在一定条件下形成纳米尺寸的颗粒。
[0076]
实施例9
[0077]
panc-1细胞(得克萨斯大学安德森癌症中心)(共聚焦小皿，2
×
105个)在玻璃底培养皿中培养12小时。将实施例3所得复合物sgpp-cy5(cy5-cooh终浓度为4μmol/l)在37℃与细胞在dmem培养基中孵育1h。样品使用cd44抗体(biolegend)进行孵育，多聚甲醛(4％)固定15min，hoechst 33342染色，选用
×
63物镜，使用共聚焦激光扫描显微镜成像(lsm 880,zeiss)。成像结果如图6所示：复合物可以特异性地被cd44阳性细胞摄取。
[0078]
实施例10
[0079]
使用50μm eipa(l593754；cas：1154-25-2)、75μm染料木素(genistein)或25μm盐酸氯丙嗪(chlorpromazine)与panc-1细胞(6孔板，每孔2
×
105个)孵育2h，再将实施例3中所得复合物(cy5-cooh终浓度为4μmol/l)与细胞在dmem培养基中孵育1h，以不加入复合物为空白对照(control)，加入复合物但不加入内吞抑制剂为阳性对照组(untreated)，加入复合物放入4℃培养作为阴性对照组(4℃)。流式细胞仪检测细胞中cy5.5荧光强度，三次重
复。结果如图7所示，复合物的内吞被盐酸氯丙嗪明显抑制，其内吞途径极大依赖于网格蛋白介导内吞。
[0080]
实施例11
[0081]
将panc-1细胞接种(每个孔5000个细胞)于96孔板(n＝3)中，在添加10％(v/v)胎牛血清(fbs)和1％(w/v)青霉素的dmem培基中培养，放于37℃并含5％(v/v)co2的增湿环境。用dmem稀释实施例1和实施例2中所得产物sgpp和sgpp-ym的溶液(最高浓度：sgpp浓度为5μg/ml，ym浓度为1μmol/l；其余梯度浓度依次递减)，以抗肿瘤药物ym为对照，然后加入每个孔中与细胞一起孵育。培养48小时后，向每个孔中加入mtt试剂。使用酶标仪(f200,tecan)测量细胞相对活力，三次重复。结果如图8所示：复合物可以有效抑制肿瘤细胞的增殖，同时降低了药物的细胞毒性。
[0082]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。