一种多功能引导骨再生复合膜及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及医学材料技术领域，尤其是涉及一种多功能引导骨再生复合膜及其制备方法和应用。


背景技术：

2.由创伤、肿瘤切除、先天性疾病、牙周病等原因导致的牙槽骨缺损是临床的常见病及多发病，会极大地影响牙周组织健康和义齿修复效果，特别是种植义齿修复的效果，大大地降低患者的生活质量。引导骨再生术是目前临床上解决牙槽骨骨量不足的可靠方法，已被广泛应用在牙槽外科、牙周及口腔种植修复领域，其原理是在牙龈软组织与骨缺损之间建立一道生物隔离屏障，选择性地将生长速度较快的上皮细胞和成纤维细胞阻挡于缺损之外，使生长速度较慢的骨组织在不受干扰的情况下完成修复再生。由此可见，引导骨再生膜所构筑的屏障质量直接决定了引导骨组织再生术的成败，而在这过程中，引导骨再生膜起关键作用。
3.临床常用的引导骨再生膜按是否可降解分为不可吸收膜和可吸收膜两大类。目前，针对新型引导骨再生膜的研究主要集中在可吸收膜领域。可吸收引导骨再生膜最经典的结构设计是不对称的双层结构。双层结构包括致密层和疏松层。致密层朝向牙龈软组织，结构相对致密，孔径小，可防止牙龈成纤维细胞长入，具有良好的隔离屏障作用。疏松层紧贴骨缺损区部位，疏松多孔，在稳定血凝块的同时，可为成骨细胞的黏附和骨沉积提供支架作用。该不对称双层结构可通过一种或多种材料复合制备而成。
4.理想的引导骨再生膜应具备良好的生物相容性、理想的屏障功能、与成骨速度匹配的降解速度、适当的机械性能、长效的抗菌性、优异的骨诱导性和骨传导性等特点。然而，尽管商品化的引导骨再生膜特别是可吸收膜已在临床上广泛应用，但仍存在降解较快、机械性能不足、缺乏抗菌性来预防术后感染以及在严重骨缺损区难以达到理想的骨再生效果等亟待解决的问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种多功能引导骨再生复合膜及其制备方法和应用。本发明的复合膜具有优异的屏障作用、抗菌性能及促成骨功能的优点，可以预防术后感染以及在严重骨缺损区达到理想的骨再生效果。
6.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
7.第一目的，本发明提供了一种多功能引导骨再生复合膜的制备方法，包括以下步骤：
8.s1、将细菌纤维素膜置于乙醇溶液中，然后加入乙酸和硅烷偶联剂常温搅拌，再加热搅拌，获得双键改性的细菌纤维素膜；
9.s2、将双键改性的细菌纤维素膜置于纯水中，加入丙烯酰胺单体和过硫酸钾引发剂，加热搅拌反应，获得接枝聚丙烯酰胺的细菌纤维素膜；
10.s3、将接枝聚丙烯酰胺的细菌纤维素膜浸泡于次氯酸钠溶液中，在冰乙醇浴下反应，获得n-卤胺改性的细菌纤维素致密层；
11.s4、将壳聚糖和羟基磷灰石纳米颗粒溶解分散于乙酸水溶液中，制得壳聚糖-羟基磷灰石分散液，向壳聚糖-羟基磷灰石分散液中加入戊二醛水溶液搅拌交联获得混合分散液，将混合分散液涂覆至n-卤胺改性的细菌纤维素致密层上，冷冻干燥，制得多功能引导骨再生复合膜。
12.细菌纤维(bacterial cellulose，bc)是一种天然聚合物，可形成超精细网络结构，纳米网孔的可调控性强，其抗拉强度及抗撕裂强度高，生物相容性好，可生物降解。壳聚糖(chitosan，cs)是一种天然氨基多糖，可加工性好，修饰改性容易，可生物降解，是骨组织工程的重要支架材料。n-卤胺化合物为有机非抗生素类抗菌剂，具有结构稳定、广谱抗菌、抗菌活性强、抗菌性可循环再生、生物安全性好及不易产生耐药性等特点。羟基磷灰石(hydroxyapatite，hap)与人体骨矿物质类似，具有优异的骨传导性，被认为是骨缺损修复的理想材料。
13.本发明采用自由基聚合反应在细菌纤维素膜表面接枝n-卤胺高分子形成n-卤胺改性的细菌纤维素(bc-ncl)致密层；并在n-卤胺改性的细菌纤维素致密层表面通过冷冻干燥技术引入壳聚糖及羟基磷灰石形成cs-hap疏松层。
14.本发明联合利用bc的孔径可调节性、n-卤胺化合物的长效抗菌性，壳聚糖的易加工性和羟基磷灰石的骨传导性，可制备具有优异屏障、抗菌及促成骨功能的多功能骨再生复合膜，使之不仅可以在引导骨再生过程中有效预防感染发生，又能在骨缺损区达到理想的骨再生效果，提高引导骨再生修复的成功率。
15.作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述乙酸和硅烷偶联剂的质量比为(1～3):1。更优选地，乙酸和硅烷偶联剂的质量比为2:1。
16.通过硅烷偶联剂处理细菌纤维素膜，使硅烷偶联剂与细菌纤维素膜的羟基发生反应，从而将c＝c双键引入细菌纤维素膜中，获得双键改性的细菌纤维素膜。
17.更优选地，硅烷偶联剂包括硅烷偶联剂kh570，硅烷偶联剂在此不仅限于硅烷偶联剂kh570，还可以包括本领域常规使用的硅烷偶联剂。
18.作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述丙烯酰胺单体和过硫酸钾引发剂的质量比为(2.5～4.5g):(25～45mg)。
19.本发明加入丙烯酰胺单体，可以与c＝c双键相连并聚合成聚丙烯酰胺而引入酰胺键，从而获得接枝聚丙烯酰胺的细菌纤维素膜。
20.作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤s1中，加热温度为70～75℃，加热时间为2.5～3.5h；所述步骤s2中，加热温度为60～70℃，加热时间为5～6h。
21.作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤s1和s2中还通入了氮气，通入时间为0.5h，通入氮气的目的是为了排净氧气。
22.作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述次氯酸钠溶液中次氯酸钠的浓度为1％，所述乙酸水溶液中乙酸的浓度为2％，所述戊二醛水溶液中戊二醛的浓度为1％。
23.将接枝聚丙烯酰胺的细菌纤维素膜浸泡于次氯酸钠溶液中，实现细菌纤维素膜的氮氯功能化，使得接枝聚丙烯酰胺的细菌纤维素膜表面上构建牢固稳定的高分子抗菌层，可以有效阻挡成纤维细胞穿透及防止细菌的黏附，并有效杀灭黏附的细菌，达到持久抗菌
的效果。
24.作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤s3中，壳聚糖与羟基磷灰石纳米颗粒的质量比为0.5:(0.17～0.25)；更优选地，壳聚糖与羟基磷灰石纳米颗粒的质量比为2:1；所述壳聚糖-羟基磷灰石分散液与戊二醛水溶液的质量比为(20～30):(1～3)，更优选地，所述壳聚糖-羟基磷灰石分散液与戊二醛水溶液的质量比为25:1.5。
25.在本发明中，当壳聚糖与羟基磷灰石纳米颗粒的质量比为1:1时，冻干的cs-hap疏松层的变脆，形貌维持不佳，而当壳聚糖与羟基磷灰石纳米颗粒的质量比为0.5:(0.17～0.25)时，其能很好地维持cs-hap疏松层的形貌。
26.作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述n-卤胺改性的细菌纤维素致密层的纤维间孔隙为20～150nm。所述n-卤胺改性的细菌纤维素致密层平整，呈三维多孔互通的纳米纤维堆叠结构，纤维分布均匀。
27.更优选地，分散液涂覆于n-卤胺改性的细菌纤维素致密层冻干成型后，涂覆分散液的一面形成cs-hap疏松层，cs-hap疏松层疏松多孔，孔隙之间相互连通，孔径约30～100μm，hap分布均匀。
28.第二目的，本发明提供了上述制备方法制备的多功能引导骨再生复合膜。
29.第三目的，本发明提供了上述多功能引导骨再生复合膜在促进骨再生产品中的应用。
30.通过生物相容性及屏障功能评估实验可知，本发明的复合膜对成纤维细胞和骨髓基质干细胞的增殖能力及细胞骨架均无明显影响，其生物相容性良好，且成纤维细胞细胞不易从n-卤胺改性的细菌纤维素致密层穿透到cs-hap疏松层。
31.本发明的复合膜还具有较佳的防黏附性能、抗菌性能、抗菌时效性及促成骨分化。
32.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
33.1)本发明创新地应用孔径可调节性优异的细菌纤维素膜作为引导骨再生复合膜的基底，通过调控孔隙结构，使该复合膜可以有效阻挡成纤维细胞的穿透及细菌的黏附；
34.2)本发明将n-卤胺高分子用于复合膜表面的改性，采用共价键结合法及聚合物接枝法在细菌纤维素膜表面构建牢固稳定的高分子抗菌层，达到持久抗菌的作用；
35.3)本发明的复合膜具有良好的细胞相容性，细胞屏障作用，防细菌黏附性，抗菌性能，抗菌时效性及促进成骨分化的优点。
附图说明
36.图1为实施例1制备的多功能引导骨再生复合膜的扫描电子显微镜图(左侧为bc-ncl；右侧为cs-hap)；
37.图2为本发明复合膜在抗细菌黏附性及抗菌性能检测实验中的结果图(标尺＝100μm)；
38.图3为本发明实施例1制备的复合膜在促成骨性能检测实验中的钙盐茜素红染色结果图((*p《0.05))；
39.图4为对比例1制备的复合膜在促成骨性能检测实验中的碱性磷酸酶活性检测结果图(
*
p《0.05)。
具体实施方式
40.为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
41.在以下实施例和对比例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
42.实施例1、一种多功能引导骨再生复合膜的制备方法
43.一种多功能引导骨再生复合膜的制备方法，包括以下步骤：
44.s1、取边长2cm、厚1mm的正方形细菌纤维素膜用双蒸水搅拌清洗20min，晾干；
45.s2、取10片晾干的细菌纤维素膜置于100ml 75％乙醇溶液中，通0.5h氮气以排净氧气，然后加入3ml乙酸和1.5ml硅烷偶联剂kh570常温搅拌0.5h，再置于70℃下加热搅拌反应3h，再用无水乙醇冲洗产物三次，用纯水冲洗一次，获得双键改性的细菌纤维素膜；
46.s3、将双键改性的细菌纤维素膜置于80ml纯水中，通0.5h氮气以排净氧气，加入3.5g丙烯酰胺单体和35mg过硫酸钾引发剂，60℃加热搅拌反应5h，用纯水冲洗产物三次，获得接枝聚丙烯酰胺的细菌纤维素膜；
47.s4、将接枝聚丙烯酰胺的细菌纤维素膜浸泡于100ml 1％次氯酸钠溶液中，在4℃冰乙醇浴下反应12h，用纯水浸泡产物2h，获得n-卤胺改性的细菌纤维素致密层；
48.s5、取0.5g壳聚糖和0.25g羟基磷灰石纳米颗粒，溶解分散于25ml 2％乙酸水溶液中，超声0.5h，配制成25ml的壳聚糖-羟基磷灰石分散液；取30μl50％戊二醛溶液溶解于1.5ml纯水中，配制成1.5ml 1％戊二醛水溶液；1.5ml戊二醛水溶液加入25ml壳聚糖-羟基磷灰石分散液中，搅拌均匀，常温静置5min交联后，于每一片n-卤胺改性的细菌纤维素致密层上均匀涂覆1ml混合分散液，液氮冷冻成型后，于-20℃的0.3m氢氧化钠乙醇溶液中洗去乙酸，纯水洗涤，再次用液氮冷冻，置于冻干机中干燥，得到bc-ncl/cs-hap复合膜(其中混合分散液冻干的一面为cs-hap疏松层)，即多功能引导骨再生复合膜。
49.实施例2、一种多功能引导骨再生复合膜的制备方法
50.一种多功能引导骨再生复合膜的制备方法，包括以下步骤：
51.s1、取边长2cm、厚1mm的正方形细菌纤维素膜用双蒸水搅拌清洗20min，晾干；
52.s2、取10片晾干的细菌纤维素膜置于100ml 75％乙醇溶液中，通0.5h氮气以排净氧气，然后加入3ml乙酸和1.5ml硅烷偶联剂kh570常温搅拌0.5h，再置于70℃下加热搅拌反应2.5h，再用无水乙醇冲洗产物三次，用纯水冲洗一次，获得双键改性的细菌纤维素膜；
53.s3、将双键改性的细菌纤维素膜置于80ml纯水中，通0.5h氮气以排净氧气，加入2.5g丙烯酰胺单体和25mg过硫酸钾引发剂，60℃加热搅拌反应5h，用纯水冲洗产物三次，获得接枝聚丙烯酰胺的细菌纤维素膜；
54.s4、将接枝聚丙烯酰胺的细菌纤维素膜浸泡于100ml 1％次氯酸钠溶液中，在4℃冰乙醇浴下反应12h，用纯水浸泡产物2h，获得n-卤胺改性的细菌纤维素致密层；
55.s5、取0.5g壳聚糖和0.25g羟基磷灰石纳米颗粒，溶解分散于25ml 2％乙酸水溶液中，超声0.5h，配制成25ml的壳聚糖-羟基磷灰石分散液；取30μl50％戊二醛溶液溶解于1.5ml纯水中，配制成1.5ml 1％戊二醛水溶液；1ml戊二醛水溶液加入20ml壳聚糖-羟基磷灰石分散液中，搅拌均匀，常温静置5min交联后，于每一片n-卤胺改性的细菌纤维素致密层上均匀涂覆1ml混合分散液，液氮冷冻成型后，于-20℃的0.3m氢氧化钠乙醇溶液中洗去乙
酸，纯水洗涤，再次用液氮冷冻，置于冻干机中干燥，得到bc-ncl/cs-hap复合膜，即多功能引导骨再生复合膜。
56.实施例3、一种多功能引导骨再生复合膜的制备方法
57.一种多功能引导骨再生复合膜的制备方法，包括以下步骤：
58.s1、取边长2cm、厚1mm的正方形细菌纤维素膜用双蒸水搅拌清洗20min，晾干；
59.s2、取10片晾干的细菌纤维素膜置于100ml75％乙醇溶液中，通0.5h氮气以排净氧气，然后加入3ml乙酸和1.5ml硅烷偶联剂kh570常温搅拌0.5h，再置于75℃下加热搅拌反应3.5h，再用无水乙醇冲洗产物三次，用纯水冲洗一次，获得双键改性的细菌纤维素膜；
60.s3、将双键改性的细菌纤维素膜置于80ml纯水中，通0.5h氮气以排净氧气，加入4.5g丙烯酰胺单体和45mg过硫酸钾引发剂，60℃加热搅拌反应6h，用纯水冲洗产物三次，获得接枝聚丙烯酰胺的细菌纤维素膜；
61.s4、将接枝聚丙烯酰胺的细菌纤维素膜浸泡于100ml 1％次氯酸钠溶液中，在4℃冰乙醇浴下反应12h，用纯水浸泡产物2h，获得n-卤胺改性的细菌纤维素致密层；
62.s5、取0.5g壳聚糖和0.17g羟基磷灰石纳米颗粒，溶解分散于25ml 2％乙酸水溶液中，超声0.5h，配制成25ml的壳聚糖-羟基磷灰石分散液；取30μl50％戊二醛溶液溶解于1.5ml纯水中，配制成1.5ml 1％戊二醛水溶液；3ml戊二醛水溶液加入30ml壳聚糖-羟基磷灰石分散液中，搅拌均匀，常温静置5min交联后，于每一片n-卤胺改性的细菌纤维素致密层上均匀涂覆1ml混合分散液，液氮冷冻成型后，于-20℃的0.3m氢氧化钠乙醇溶液中洗去乙酸，纯水洗涤，再次用液氮冷冻，置于冻干机中干燥，得到bc-ncl/cs-hap复合膜，即多功能引导骨再生复合膜。
63.对比例1
64.与实施例1相比，区别仅在于，壳聚糖与羟基磷灰石纳米颗粒的质量比为5:1，即加入0.5g壳聚糖和0.1g羟基磷灰石纳米颗粒，其余参数与制备方法与实施例1相同。实验结果表明，对比例1的cs-hap疏松层上骨髓间充质干细胞的alp活性及钙盐沉积量均明显比实施例1低。
65.对比例2
66.与实施例1相比，区别仅在于，壳聚糖与羟基磷灰石纳米颗粒的质量比为1:1，即加入0.5g壳聚糖和0.5g羟基磷灰石纳米颗粒，其余参数与制备方法与实施例1相同。实验结果表明，对比例2的cs-hap疏松层脆性大，三维多孔网络结构的形貌难以维持。
67.对比例3
68.与实施例1相比，区别仅在于，使用丙烯酸单体和乙二胺替换丙烯酰胺单体，即双键改性的细菌纤维素膜先通过接枝聚丙烯酸引入羧基，然后再通过加入乙二胺将羧基转化为酰胺键。其余参数与制备方法与实施例1相同。具体制备方法如下：
69.(1)将边长2cm、厚1mm的正方形细菌纤维素膜用双蒸水搅拌清洗20min，晾干；
70.(2)取约10片晾干后的细菌纤维素膜，置于100ml75％乙醇溶液中，通0.5h氮气以排净氧气，然后加入3ml乙酸和1.5ml硅烷偶联剂kh570溶液，常温搅拌0.5h后，再置于70℃加热搅拌反应3h，再用无水乙醇冲洗产物三次，用纯水冲洗一次，获得双键改性的细菌纤维素膜。
71.(3)将获得双键改性的细菌纤维素膜置于80ml纯水中，通0.5h氮气以排净氧气，加
入7.2ml丙烯酸单体和161.64mg 2,2'-氮杂双(2-咪唑啉)二盐酸盐引发剂，65℃加热搅拌反应24h，用纯水冲洗产物三次，获得bc-g-paa膜。
72.(4)将得到的bc-g-paa膜置于100ml纯水中，通0.5h氮气以排净氧气，加入0.1g 2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪，缓慢滴加5ml乙二胺，滴加完后在80℃加热搅拌反应24h，纯水冲洗产物三次，获得接枝的细菌纤维素膜。
73.(5)将上述得到的接枝的细菌纤维素膜浸泡于100ml 1％次氯酸钠溶液中，在4℃冰乙醇浴下反应12h，用纯水浸泡产物2h。后续步骤与实施例1相同。
74.结果表明，对比例3的抗菌效果和抗菌时效性与实施例1基本相似，但是对比例3的反应步骤更复杂。
75.实验例一、多功能引导骨再生复合膜的结构及性能表征
76.1)用扫描电镜观察实施例1制备的复合膜的表面形貌，结果显示bc-ncl致密层平整，呈三维多孔互通的纳米纤维网络结构，纤维分布均匀，纤维间孔隙约20～150nm；cs-hap疏松层多孔，孔隙之间相互连通，孔径约30～100μm，羟基磷灰石纳米颗粒分布均匀(参见图1)。
77.2)采用傅里叶红外光谱分析n-卤胺改性的细菌纤维素致密层的化学结构，结果表明n-卤胺聚合物成功地接枝到细菌纤维素膜表面。
78.3)通过接触角分析复合膜中cs-hap疏松层的亲水性，结果表明cs-hap疏松层具有超亲水性。
79.实施例2-3制备的多功能引导骨再生复合膜的结构及性能表征与实施例1类似，均能得到上述实验的结果。
80.实验例二、生物相容性及屏障功能实验
81.细胞相容性实验：分别将l929成纤维细胞接种于实施例1-3制备的多功能引导骨再生复合膜的n-卤胺改性的细菌纤维素致密层，将大鼠骨髓间充质干细胞接种于多功能引导骨再生复合膜的cs-hap疏松层，结果发现多功能引导骨再生复合膜对细胞的增殖能力及细胞骨架均无明显影响，证明该多功能引导骨再生复合膜的细胞相容性良好。
82.细胞屏障实验：将l929成纤维细胞分别接种于实施例1-3制备的多功能引导骨再生复合膜的n-卤胺改性的细菌纤维素致密层，分别在第1、3、7天通过荧光共聚焦显微镜观察其在n-卤胺改性的细菌纤维素致密层的生长情况及其穿透到cs-hap疏松层情况。结果发现随着时间进展，n-卤胺改性的细菌纤维素致密层上的细胞密度均逐渐增加，而从n-卤胺改性的细菌纤维素致密层穿透到cs-hap疏松层的细胞明显较bio-gide胶原膜(目前临床上最广泛应用的进口引导骨再生膜)少，证明该多功能引导骨再生复合膜的细胞屏障作用良好。
83.实验例三、抗细菌黏附性及抗菌性能检测
84.1)抗黏附性能：以金黄色葡萄球菌及牙龈卟啉单胞菌作为模型菌，用活/死菌荧光染色法检测实施例1-3的未改性细菌纤维素膜(即选用步骤s1处理的细菌纤维素膜)相对于bio-gide胶原膜对细菌的抗黏附作用。
85.抗黏附率(％)＝(bio-gide的活细菌数-未改性细菌纤维素膜的活细菌数)/bio-gide的活细菌数
×
100％，bio-gide是对照组，抗黏附率是0。
86.结果表明实施例1-3的未改性细菌纤维素膜对金黄色葡萄球的抗黏附率均达到
80％以上；对牙龈卟啉单胞菌的抗黏附率达75％以上(实施例1结果参见图2)。
87.2)抗菌性能：以金黄色葡萄球菌及牙龈卟啉单胞菌作为模型菌，用细胞涂板计数法检测实施例1-3的多功能引导骨再生复合膜对细菌的作用，结果表明实施例1-3的多功能引导骨再生复合膜对两种细菌的抗菌率均达95％以上。对激光共聚焦显微镜和扫描电镜观察细菌的存活情况及形态，发现与多功能引导骨再生复合膜接触的细菌大部分死亡，且菌体形态变形(实施例1结果参见图2)。
88.3)抗菌时效性：将实施例1的多功能引导骨再生复合膜在人工唾液中37℃浸泡4周，随着浸泡时间的延长，多功能引导骨再生复合膜针对金黄色葡萄球菌的抗菌率逐渐从原来的98.5％下降到89％；针对牙龈卟啉单胞菌的抗菌率逐渐从原来的98.9％下降到91％。表明多功能引导骨再生复合膜中的有效氯在液体环境中稳定存在并缓慢持久释放，其抗菌时效较长。
89.实验例四、促成骨性能检测实验
90.1)将大鼠骨髓间充质干细胞分别接种于bio-gide胶原膜的疏松面和实施例1的多功能引导骨再生复合膜的cs-hap疏松层，检测早期成骨标志物碱性磷酸酶(alp)活性，茜素红染色检测晚期成骨标志钙盐沉积情况，结果表面cs-hap疏松层上骨髓间充质干细胞的alp活性及钙盐沉积均显著高于对照组bio-gide胶原膜(钙盐茜素红染色结果参见图3)。对比例1的cs-hap疏松层上骨髓间充质干细胞的alp活性(图4)及钙盐沉积量均明显比实施例1低。
91.2)rt-qpcr检测bio-gide胶原膜和实施例1的多功能引导骨再生复合膜表面细胞成骨分化相关基因(alp、col-1、ocn、runx2)表达情况，结果显示复合膜上的表达量明显高于bio-gide胶原膜。
92.3)western blot检测bio-gide胶原膜和实施例1的多功能引导骨再生复合膜表面细胞成骨分化相关蛋白(col-1、ocn、runx2)表达情况，结果显示复合膜上的表达量明显高于bio-gide胶原膜。
93.本发明基于精准的结构设计、精细的功能调控及各项性能验证，制备具有良好抗菌、屏障功能和促成骨功能的多功能引导骨再生复合膜。
94.最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。