一种检测副鸡禽杆菌外膜蛋白抗体的胶体金试纸及其制备方法与应用与流程

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测副鸡禽杆菌外膜蛋白抗体的胶体金试纸及其制备方法与应用。


背景技术：

2.副鸡禽杆菌(avibacterium paragallinarum,apg)是鸡传染性鼻炎(infectious coryza,ic)的病原菌，该病在我国各省市的养鸡场均有发生，是危害养禽业的重要细菌性传染病。它会造成蛋鸡产蛋量显著下降，下降率达10％-40％，也会导致育成鸡生长发育受阻和淘汰率增加。副鸡禽杆菌感染的是呼吸系统中最前沿的部位
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鼻道和鼻窦黏膜，是呼吸道疾病的门户病，第一屏障受到损害，其他病原的感染率就大大增加。若与其它病原如鸡传染性支气管炎病毒、鸡支原体、新城疫病毒等并发感染后会引起鸡呼吸道疾病综合征，会使症状加重、病程延长和死亡率增加。肉鸡发生鸡传染性鼻炎病时会引起严重的肉质下降，胴体淘汰率增加。该病严重威胁着养鸡生产，因此建立快速检测副鸡禽杆菌病诊断方法具有非常重要的公共卫生学意义。
3.胶体金免疫层析技术是20世纪末发展起来的一种新型体外诊断技术，其特点突出，如操作简便、检测迅速、特异性强等，成为快速检测药物残留、传染病、早孕等的首选。胶体金标记由于标记物制备简便，方法敏感、特异，不需要辅助仪器和试剂且操作人员不用进行技术培训，方便于广大基层检验人员，检测结果判断清楚直观，用时短，可对大批量样品进行现场检测和大面积普查等。但是由于抗原的选择是决定检测效率的关键，选择有免疫原性、特异性强的抗原，对于检测结果阳性与准确性起决定性作用。
4.目前，在兽医临床实践中，对于检测副鸡禽杆菌抗体的胶体金免疫层析试纸条未有报道。随着集约化养殖的快速发展，该病的发生和流行呈上升趋势，给养禽业造成了严重的经济损失。因此，必须对该病予以高度重视，加强对该病的防控，如何快速准确地检测副鸡禽杆菌抗体，是实际工作中急需解决的问题。


技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本发明提供一种检测副鸡禽杆菌外膜蛋白抗体的胶体金试纸条及其制备方法与应用。该试纸适用于检测副鸡禽杆菌抗体，制备过程经过多种条件的优化，能在10min内完成样品检测，具有特异性强、灵敏度高、稳定性好、易携带、使用方便等优点。
6.为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
7.一种检测副鸡禽杆菌外膜蛋白抗体的胶体金试纸条，其包括由样品垫、胶体金结合垫、c/t线的承载体和吸水垫依次搭接并贴在底板上，所述胶体金结合垫包被有胶体金标记的兔抗鸡igg蛋白，所述c/t线的承载体为包被有羊抗兔igg作为质控线和包被副鸡禽杆菌外膜蛋白p9为检测线。
8.如上所述的胶体金试纸条，优选地，所述副鸡禽杆菌外膜蛋白p9的氨基酸序列如seq id no.1所示。
9.如上所述的胶体金试纸条，优选地，所述副鸡禽杆菌外膜蛋白p9的表达采用的基因序列如seq id no.2所示。
10.如上所述的胶体金试纸条，优选地，所述胶体金结合垫使用的材料为玻璃纤维膜，优选为gls-17930，所述c/t线的承载体使用的材料为硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane,nc膜)，优选为millipore hi flow-135，所述底板为pvc板。
11.如上所述的胶体金试纸条，优选地，所述胶体金的粒径为10～50nm，胶体金标记时的ph值为7.0～10.0，兔抗鸡igg蛋白的标金量为6μg/ml～18μg/ml；所述副鸡禽杆菌外膜蛋白p9的包被浓度为0.5～2mg/ml；所述羊抗兔igg的抗体的包被浓度为0.5～2mg/ml。
12.如上所述的胶体金试纸条，优选地，所述胶体金的粒径为20nm，胶体金标记时的ph值为8.2，兔抗鸡igg蛋白的标金量为10μg/ml；副鸡禽杆菌外膜蛋白p9的包被浓度为1mg/ml；所述羊抗兔igg抗体的包被浓度为1mg/ml；所述胶体金标记兔抗鸡igg蛋白在膜上的喷涂量为1.2μl/cm；所述副鸡禽杆菌外膜蛋白p9和羊抗兔igg的抗体在c/t线的承载体的包被量均为1.2μl/cm。
13.一种检测副鸡禽杆菌外膜蛋白抗体的胶体金试纸条的制备方法，其包括如下步骤：
14.s1、在胶体金溶液加入k2co3溶液调节ph值，加入兔抗鸡igg蛋白搅拌进行标记，获得胶体金标记兔抗鸡igg；
15.s2、将胶体金标记兔抗鸡igg喷涂在玻璃纤维膜上，烘干，获得胶体金结合垫；
16.s3、c/t线的承载体上设有质控线和检测线，质控线上包被羊抗兔igg，检测线上包被副鸡禽杆菌外膜蛋白p9，烘干，获得包被垫；
17.所述副鸡禽杆菌外膜蛋白p9的氨基酸序列如seq id no.1所示；
18.s4、将样品垫、胶体金结合垫、c/t线的承载体和吸水垫依次沿长度方向贴于底板pvc板上，再切割成宽0.3～0.5cm/条，即获得检测副鸡禽杆菌抗体的胶体金免疫层析试纸条。
19.如上所述的制备方法，优选地，在步骤s1中，所述胶体金的粒径为10～50nm，ph值为7.0-10.0，加入兔抗鸡igg蛋白的量按6μg/ml-18μg/ml进行。
20.进一步优选地，所述胶体金的粒径为20nm，ph值为8.2，加入兔抗鸡igg蛋白的量按10μg/ml进行。
21.如上所述的制备方法，优选地，在步骤s2中，胶体金标记兔抗鸡igg在玻璃纤维膜的喷涂量为1.2μl/cm。
22.如上所述的制备方法，优选地，在步骤s3中，所述羊抗兔igg的浓度为0.5～2mg/ml，所述副鸡禽杆菌外膜蛋白p9的浓度为0.5～2mg/ml，在c/t线的承载体的包被量均为1.2μl/cm。
23.通过大量实验证明，如果未按上述优选的浓度进行胶体金试纸条的制备，发现会有非特异性条带，空白对照溶液检测会出现假阳性。
24.如上所述检测副鸡禽杆菌外膜蛋白抗体的胶体金试纸条在检测副鸡禽杆菌抗体中的应用。
25.本发明的有益效果在于：
26.本发明提供的检测副鸡禽杆菌抗体的胶体金免疫层析试纸，在副鸡禽杆菌亚单位疫苗标准免疫血清稀释至1000倍时仍可检测；且与鸡新城疫、禽流感、鸡支原体、鸡大肠杆菌病阳性血清均无交叉反应；与elisa检测试剂盒(北京市农林科学院畜牧兽医研究所制备)相比的符合率为100％。所述试纸还具有较好的稳定性，37℃放置所述试纸28天后，灵敏度并没有明显下降；每次检测过程可在10min内完成，能够快速检测样品血清，适用于现场快速检测。
附图说明
27.图1为试纸条的特异性检测结果；
28.图2为试纸条的灵敏度检测结果；
29.图3为试纸条的稳定性检测。
具体实施方式
30.以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
31.若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
32.下述实施例中所用的氯金酸(haucl4·
4h2o)、柠檬酸三钠、吸水纸(paper-2030)、nc膜(millipore hiflow-135)、白色底板和金标垫(gls-17930，即胶体金结合垫，材料为玻璃纤维膜)均购于北京吉森生物科技有限公司。
33.下述实施例中所用的疫苗抗原蛋白-副鸡禽杆菌外膜蛋白p9、副鸡禽杆菌亚单位疫苗标准免疫血清、副鸡禽杆菌标准阳性血清和阴性血清由北京市农林科学院畜牧兽医研究所的实验室制备及保存；鸡新城疫阳性血清、禽流感阳性血清、鸡支原体阳性血清、鸡大肠杆菌阳性血清、由北京市农林科学院畜牧兽医研究所保存，200份被检鸡血清样品由北京市农林科学院畜牧兽医研究所提供。
34.下述实施例中所用的三位喷点系统(xyz3050tm)和切纸机系统(cm4000tm)均由美国biodot公司生产。下述实施例中的“％”如无特别说明，均为重量百分比含量。
35.实施例1副鸡禽杆菌抗体检测用胶体金免疫层析试纸的制备
36.影响胶体金免疫层析试纸质量的因素有很多，如胶体金颗粒大小、胶体金标记抗原量、包被抗体浓度、nc膜和玻璃纤维膜的类型、缓冲液的配制等。由于空间位阻等因素，不同的标记物需要胶体金的颗粒大小不同。胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。本发明经大量实验验证获得比较合适的胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量。
37.在胶体金免疫层析快速检测中，nc膜作为包被抗体的固相支持物，其种类选择是很重要的，需要从层析速度、灵敏度及非特异性结合等几方面综合进行筛选，选择一种既可以很好负载标记物和待检测样品，又不被吸附的nc膜，经大量实验验证选择millipore hiflow-135的nc膜，效果较佳。
38.1.兔抗鸡igg抗体制备
39.无菌心脏途径采集spf鸡血清，辛酸—硫酸铵法提取血清igg，sephadexg25柱层析，sds-page电泳检测igg纯度，分光光度计测定含量，透析袋浓缩。弗氏完全佐剂乳化后，免疫4只雄性健康家兔，采集高抗体效价心脏血。用常规方法辛酸—硫酸铵法纯化兔抗鸡igg，-20℃保存备用。
40.2.胶体金制备
41.采用柠檬酸盐还原法制备粒径为20nm的胶体金溶液。
42.具体操作方法如下：首先取200ml超纯水于500ml圆底锥形瓶中，加入2.0ml 1％haucl4溶液，将其置于微波炉中进行中高火加热5min，待沸腾后将其取出；然后搅拌下加入4.8ml 1％柠檬酸三钠溶液，继续置于微波炉中，中火加热4.5min；将锥形瓶取出，待金液冷却至室温，加超纯水定容至200ml，随后将其置于4℃备用；取出10ml烧好并且冷却的胶体金溶液，在波长400nm～700nm范围内进行扫描，扫描间距为1nm，最高吸收峰在519nm
±
2nm处为合格。将制备的胶体金溶液ph值调至8.2，4℃保存备用。
43.上述胶体金溶液的鉴定方法如下：
44.按照上述胶体金制备的方法操作，结果显示，胶体金溶液呈酒红色，用由紫外-可见光谱图可知：显示制备的胶体金尖峰位于520nm处，且峰型狭窄，说明制备的金颗粒粒径均一，分散性良好。
45.3.胶体金标记兔抗鸡igg蛋白
46.1)最佳兔抗鸡igg蛋白标记量的确定
47.通过试管观察法确定蛋白最佳标金量和最佳包被金标抗体浓度。具体操作方法如下：
48.取8支离心管，每管加入1ml步骤2制备得到的胶体金溶液(胶体金粒径20nm)，每管分别加入3、5、7、9、11、13、15或17μl k2co3和相对应的6、8、10、12、14、16或18μg的兔抗鸡igg蛋白，混匀搅拌20min，观察其颜色。当胶体金溶液不发生沉聚现象，颜色不变或变化不大，且呈酒红色，此时的兔抗鸡igg蛋白剂量即为最佳标记蛋白质量。
49.结果显示，胶体金标记加入7μl k2co3时，即最佳ph值为8.2时；兔抗鸡igg蛋白的最佳标金量为10μg/ml(每毫升溶液含0.02g粒径为20nm的胶体金颗粒)。
50.2)胶体金标记的兔抗鸡igg制备
51.取30ml步骤2得到的胶体金溶液置于50ml三角瓶内，平衡至室温，开启搅拌器；滴加入0.2m k2co
3 90μl使胶体金颗粒ph8.2；再加入300μg纯化的兔抗鸡igg，搅拌20min；再加入10％bsa 1.5ml，搅拌10min；再加入0.075ml 20％peg2000，搅拌10min；然后4℃静止1小时将标记好抗原的胶体金颗粒，置入50ml离心管，100 00rpm离心35min，然后垂直放置30分钟，弃上清，保留浓缩标记兔抗鸡igg蛋白的胶体金颗粒。用0.2m pb ph7.4(0.2m nah2po4，0.2m na2hpo4等体积混匀后加入0.5g bsa)定容至3ml，混均匀4℃保存备用。
52.4.副鸡禽杆菌外膜蛋白p9的制备
53.副鸡禽杆菌具有三个血清型，且各个血清型分离株均有不同程度致病力，经本研究利用生物信息学软件分析，获得了具有和三个血清型阳性血清都有结合活性的副鸡禽杆菌外膜蛋白p9，其氨基酸序列如seq id no.1所示序列，通过对密码子的优化，选择其基因片段，根据此dna序列设计一对引物(其核苷酸序列如seq id no.3和seq id no.4所示)，由两个引物的5’端分别引入ndei和xhoi酶切位点，通过pcr扩增得到p9的目的基因(其核苷酸
序列如seq id no.2所示)，将载体pet-28a及经过琼脂糖凝胶纯化的p9目的基因片段均用ndei xhoi进行双酶切处理，用t4 dna连接酶连接纯化后酶切产物，得到重组质粒pet-28a-p9，将重组质粒转化进入大肠杆菌dh5α，在含有卡那霉素的lb平板上挑选克隆，小量制备质粒，通过双酶切/pcr鉴定筛选出阳性克隆，测序结果表明重组的p9片段与设计的序列完全一致。
54.重组质粒pet-28a-p9经测序验证后，转化进入大肠杆菌(bl21)，在含有卡那霉素的lb培养基中培养，可在lb平板上挑选阳性克隆并进行质粒酶切鉴定，小量制备质粒，用双酶切pcr鉴定筛选出阳性克隆，最终获得含有p9的重组质粒工程菌。
55.在表达时，将p9的重组质粒工程菌于含100μg/ml卡那霉素的lb培养基中培养，分光光度计测得a600(600nm的吸光度)达到0.6-0.8之间，加入终浓度为0.5mm的isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside(iptg)于37℃诱导4h，诱导完成后的菌液4,000rpm离心10min，收集菌体，并用pbs洗涤沉淀；pbs重悬沉淀后置于冰浴中，超声破菌后12000rpm离心20min，上清和沉淀分别进行sds-page电泳，结果表明：表达的p9重组蛋白为胞浆可溶性表达，将该重组蛋白命名为p9。
56.将大量表达得到的菌体，经超声破碎后离心，用0.45μm滤膜过滤后用ge healthcare公司的his trap ff纯化柱将蛋白进行纯化(按照产品说明书进行试剂配制和纯化)。最终获得的蛋白用sds-page电泳进行分析，用bca蛋白定量试剂盒测得其浓度为2.3mg/ml。
57.5.羊抗兔igg抗体制备
58.无菌心脏途径采集雄性健康家兔血清，辛酸-硫酸铵法提取血清igg，sephadexg25柱层析，sds-page电泳检测igg纯度，bca法测定其浓度，透析袋浓缩。与弗氏完全佐剂乳化后，免疫4只雄性健康山羊，心脏途径采集高免血清。用辛酸-硫酸铵法纯化羊抗兔igg，-20℃保存备用。
59.6.最佳检测线(t线)和质控线(c线)浓度的确定
60.将副鸡禽杆菌外膜蛋白p9和羊抗兔igg蛋白用pbs溶液均依次稀释成0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml共4个浓度；将nc膜贴到底板上，然后将稀释好的副鸡禽杆菌外膜蛋白p9和羊抗兔igg蛋白相对应用划膜仪喷涂在nc膜上，分别为t线(检测线)和c线(质控线)；37℃烘干。根据t线和c线的颜色深浅确定t线和c线的最佳浓度。检测线的副鸡禽杆菌外膜蛋白p9和羊抗兔igg蛋白最佳包被量均为1mg/ml。
61.7.胶体金免疫层析试纸的组装
62.用喷膜仪将步骤3标记好兔抗鸡igg的胶体金溶液喷在玻璃纤维膜上，金标垫上的喷涂量为1.2μl/cm，37℃恒温烘干获得胶体金结合垫。用划膜仪将1mg/ml副鸡禽杆菌外膜蛋白p9和1mg/ml羊抗兔igg蛋白固定在c/t线的承载体即nc膜，分别作为检测线(t线)和质控线(c线)，两线间隔0.5cm，包被量均为1.2μl/cm，置于37℃真空恒温干燥箱中干燥2h以上。将样品垫(2cm长)、胶体金结合垫(5mm长)、c/t线的承载体和吸水垫(2cm长)依次沿长度方向贴于底板pvc板上，再切割成宽0.4cm/条，即检测副鸡禽杆菌抗体的胶体金免疫层析试纸。将制好的试纸装入铝箔袋中，加入干燥剂密封，4℃保存。
63.8.胶体金免疫层析试纸的检测方法和判定标准
64.将100μl的待检血清加入样品孔中，取步骤7中制好的试纸，将样品垫一端浸入样
品孔中，10min内观察结果。若试纸条质控线和检测线处出现两条红色的条带，表明样品为阳性，含有副鸡禽杆菌抗体；若试纸条上只有质控线处出现红色条带，表明样品为阴性，不含有副鸡禽杆菌抗体；若质控线处不出现红色条带则说明试纸条失效。
65.实施例2、副鸡禽杆菌抗体检测用胶体金免疫层析试纸的性能检测
66.1.试纸条特异性实验
67.用按实施例1步骤7制备好的试纸条，同时检测用pbs缓冲液100倍稀释的鸡新城疫阳性血清(1)、禽流感阳性血清(2)、鸡支原体阳性血清(3)、鸡大肠杆菌病阳性血清(4)，同时以副鸡禽杆菌标准阴性血清(5)作为阴性对照，副鸡禽杆菌亚单位疫苗标准免疫血清作为阳性对照(6)，观察几种病的交叉性，判断所述试纸条的特异性。
68.检测结果如图1所示，其中，图中标号1为副鸡禽杆菌标准阴性血清(阴性对照)；2为鸡新城疫阳性血清；3为禽流感阳性血清；4为鸡支原体阳性血清；5为鸡大肠杆菌病阳性血清；6为副鸡禽杆菌亚单位疫苗标准免疫血清(阳性对照)。结果表明鸡新城疫、禽流感、鸡支原体、鸡大肠杆菌阳性血清均为阴性，说明鸡新城疫、禽流感、鸡支原体、鸡大肠杆菌阳性血清与本发明制备的副鸡禽杆菌抗体检测用胶体金免疫层析试纸均无交叉反应，说明实施例1制备的试纸条具有很好的特异性。
69.2.试纸条灵敏性实验
70.用实施例1制备的试纸条同时检测用0.01m pbs缓冲液稀释为1:10、1:100、1:1000、1:10000的副鸡禽杆菌亚单位疫苗标准免疫血清，同时以未稀释的副鸡禽杆菌标准阳性血清为阳性对照，出现阳性信号的血清最高稀释度作为试纸条的敏感度。
71.结果如图2所示，其中，图中标号1为副鸡禽杆菌标准阳性血清(阳性对照)；2-5分别为1:10、1:100、1:1000、1:10000稀释的副鸡禽杆菌亚单位疫苗标准免疫血清。表明实施例1制备的试纸条检测不同稀释倍数的副鸡禽杆菌亚单位疫苗标准阳性血清，当稀释度为1:10000时检测线仍可见，表明该检测试纸条灵敏性良好，为保证检测的准确性，试纸条检测时，样品稀释定为1:1000倍。
72.3.试纸条稳定性实验
73.将实施例1制备的试纸条与干燥剂装入铝箔袋中密封，置于37℃保存，保存的样本每隔一周用0.01m pbs缓冲液稀释1000倍的副鸡禽杆菌亚单位疫苗标准阳性血清进行一次检测。
74.结果如图3所示，其中，图中标号1-4分别为37℃保存1、2、3、4周的副鸡禽杆菌标准阴性血清检测试纸条(阴性对照)；5-8分别为37℃保存1、2、3、或4周的副鸡禽杆菌亚单位疫苗标准免疫血清。检测样品均稀释1000倍。结果表明实施例1制备的试纸条在37℃放置28天后仍能特异性检出，灵敏度并没有明显下降，说明该试纸条稳定性良好。
75.4.临床样品检测
76.使用同一批次实施例1制备的试纸条对200份副鸡禽杆菌标准免疫鸡血清样品(用pbs缓冲液1：1000稀释)进行检测，10min后记录结果。结果：在200份样品血清中，用实施例1制备的试纸条显示阳性结果的样品为200份，阴性结果的样品为0，实施例1制备的试纸条检测的符合率为100％。
77.实施例3：胶体金试纸条阳性率与亚单位疫苗免疫保护率的相关性试验
78.副鸡禽杆菌外膜蛋白p9作为疫苗抗原的亚单位疫苗，对副鸡禽杆菌感染具有很好
的免疫保护作用，免疫后的鸡会产生p9蛋白特异性血清抗体。该抗体水平的高低与疫苗抗原使用量、疫苗免疫次数以及免疫后持续时间有关。抗体水平直接决定了鸡只的免疫能力，二者存在相关性。用胶体金试纸条的检测结果推断鸡只的免疫水平，具有重要的应用价值。
79.1.副鸡禽杆菌外膜蛋白p9亚单位疫苗制备及免疫方法
80.将重组抗原蛋白副鸡禽杆菌外膜蛋白p9与弗氏完全佐剂等体积混合乳化，使疫苗中抗原蛋白终浓度为50μg/ml用于首次免疫，第二次免疫使用弗氏不完全佐剂，其余组分与首免相同。
81.2.免疫方法
82.42日龄spf试验鸡60只，平均分为6组，分组方法如表1所示。3个疫苗免疫组，每组10只，免疫p9亚单位疫苗，颈背部皮下注射0.5ml/只，抗原蛋白p9含量为25μg/0.5ml。3个pbs对照组，每组10只，颈背部皮下接种弗氏佐剂乳化的pbs 0.5ml/只作为非免疫对照。2周后相同剂量、相同途径加强免疫。二免后两周翅静脉取血，用于血清特异性抗体的监测。
83.血清抗体的检测采用本发明制备的胶体金试纸条法，同实施例2。
84.3.免疫鸡攻毒试验
85.对二次免疫两周后的spf鸡进行攻毒试验。即试验组或对照组的鸡分别眶下窦接种0.2ml/只浓度为5
×
106cfu/ml剂量的a/b/c型副鸡禽杆菌株菌(北京市农林科学院畜牧兽医研究所提供)。其中a型副鸡禽杆菌株菌为血清型hp8，b型副鸡禽杆菌株菌为血清型bj，c型副鸡禽杆菌株菌为血清型modesto，连续观察7天，记录试验鸡的临床发病情况，评价重组抗原蛋白的免疫保护力，结果参见表1，表1为本发明重组蛋白p9免疫spf鸡后对apg菌株攻毒的保护结果及抗体水平测试结果。
86.表1保护结果及抗体水平测试结果
[0087][0088]
*表示重组蛋白免疫组获得免疫保护的试验鸡数与pbs对照组比较，差异显著。
[0089]
结果显示，用apg强毒攻击，非免疫对照组所有试验鸡陆续全部发病，免疫组a型攻毒后3鸡只表现出鼻炎症状，保护率为7/10；b型攻毒后，2鸡只表现出鼻炎症状，保护率为8/10；c型攻毒后1鸡只表现出鼻炎症状，保护率为9/10，与非免疫组相比，有显著极差异。即由
表1结果可知，本发明提供的重组蛋白副鸡禽杆菌外膜蛋白p9作为抗原的疫苗免疫效果显著。
[0090]
4.胶体金试纸条检测结果与疫苗免疫保护率的相关性
[0091]
使用实施例1同一批次制备的试纸条对上述二免后两周所采的试验鸡血清进行抗体检测。鸡血清样品用pbs缓冲液按1:1000比例稀释进行检测，10min后记录结果。结果显示，试纸条检测在1:1000稀释的免疫鸡血清均呈现阳性条带，非免疫对照鸡血清均呈现阴性条带。与疫苗免疫保护率的相关度为70％以上。
[0092]
本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。以上所述仅为本技术的实施例而已，并不用于限制本技术。对于本领域技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的权利要求范围之内。