一种天山雪莲的再生培养方法与流程

1.本发明属于植物栽培技术领域，具体涉及一种天山雪莲的再生培养方法，特别涉 及在低海拔和平地环境下的天山雪莲动态水培养方法和天山雪莲组培快繁改良方法。


背景技术：

2.天山雪莲(saus-surea involucrata(kar.et kir.)sch.-bip.)是菊科风毛菊属多年生高 山草本植物。自古以来天山雪莲一直都是传统的名贵中药材，《中国药典》中记载， 天山雪莲性温，微苦，具有温肾助阳，强健筋骨，营养神经，通经活血等功效，在临 床上主要用于治疗风寒湿痹痛，小腹疼痛，月经不调等。雪莲的主要化学成分为生物 碱类、黄酮类、苯丙素类化合物，赋予了雪莲极高的药用价值。
3.天山雪莲生长于天山山脉，主要分布于2400-4000m高山雪线附近的高山流石滩、 高山草坡、高山沼泽草地以及山顶碎石间，生境特异，自然繁殖率低，生长缓慢，3-5 年才能开花结实，人工栽培困难。20世纪以来，由于人们的长期掠夺性采挖使野生资 源濒临灭绝。
4.由于天山雪莲严苛的生长条件、极低的种群自我更新能力及人们过度采挖，导致 天山雪莲的野生资源严重不足。尽管也曾有过利用种子进行人工繁殖的研究报道，但 由于较低的种子发芽率和较高的幼苗死亡率，所以人工繁育收效甚微。加之在全球变 暖的背景下，天山山脉积雪面积逐渐减少，雪线上升，适宜野生雪莲生存的环境越来 越少。为了保护雪莲野生资源及生物多样性，利用现代生物技术手段在低海拔环境中 建立天山雪莲的高效再生培养体系显得尤为重要。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种天山雪莲的再生培养方法。
6.本发明提供的天山雪莲的再生培养方法包括如下步骤：
7.1)使用赤霉素溶液浸泡天山雪莲种子，培养，得到萌发的天山雪莲种子；
8.2)采用水培的方式培养所述萌发的天山雪莲种子，得到水培苗；
9.3)以所述水培苗的叶片或叶柄作为外植体在愈伤诱导培养基中进行愈伤诱导和分 化培养，得到再生苗；
10.4)将所述再生苗在生根培养基中培养，得到天山雪莲再生植株。
11.上述方法中，所述步骤1)中，所述赤霉素溶液的浓度可为50-200mg/l；进一步 可为50-100mg/l或100-200mg/l；更进一步可为50mg/l或100mg/l或200mg/l。
12.所述浸泡的条件如下：在黑暗、低温条件下浸泡12-24h；具体为在黑暗、4℃条 件下浸泡12h。
13.所述培养的条件如下：在光照强度为2000-3000lx、温度为24-25℃、湿度为50-60 ％条件下培养3-5天。
14.所述培养的方法为将浸泡后的种子铺到滤纸或培养皿中进行培养。
15.上述方法中，所述步骤2)中，所述水培的培养液为ms培养液；所述ms培养 液为将
ms粉末与水(三级水)混匀后得到的溶液。
16.所述ms培养液的浓度可为1.10-4.43g/l，进一步可为1.10-2.43g/l或2.43-4.43 g/l，更进一步可为1.10g/l或2.43g/l或4.43g/l。
17.所述ms培养液的ph值为5.6-6.0。
18.所述水培的条件如下：光照强度为2000-3000lx；光照时间为16h/d；温度为24-25 ℃；湿度为50-60％；含氧量大于5mg/l；水泵流量为50-350l/h。进一步的，刚开始 培养时，所述水泵流量为50l/h，两周更换一次培养液；培养1个月后，可将水泵流 量调整到150l/h，一周更换一次培养液；培养2个月后，可将水泵流量调整到350l/h， 一周更换两次培养液。
19.所述培养的方法为将萌发的天山雪莲种子在装有陶粒的水培装置中进行培养。所 述水培装置可为本领域常见的水培装置或无土栽培设备或水耕种植箱等，在本发明的 一个例子中，所述水培装置和陶粒均是淘宝店铺[乾元水培]的产品，也可从河北乾元 水培电子科技有限公司获得。
[0020]
上述方法中，所述步骤3)中，所述外植体在进行愈伤诱导和分化培养前还包括 消毒的步骤：所述消毒的方法依次包括如下步骤：自来水冲洗、无菌水冲洗、naclo 溶液浸泡、酒精消毒和无菌水洗净；
[0021]
进一步的，所述自来水冲洗的时间可为1h。
[0022]
所述无菌水冲洗的次数可为3-5次。
[0023]
所述naclo溶液的浓度可为10％。
[0024]
所述浸泡的时间可为5-10min。
[0025]
所述酒精可为75％酒精。
[0026]
所述消毒的时间可为30s。
[0027]
所述外植体的大小为1cm2。
[0028]
上述方法中，所述步骤3)中，所述愈伤诱导和分化培养的方法包括如下步骤：
[0029]
3-1)将外植体在愈伤诱导培养基中进行诱导培养，得到愈伤组织；
[0030]
3-2)将所述愈伤组织在继代培养基中进行继代培养，得到丛生芽；
[0031]
3-3)将所述丛生芽在分化培养基中进行分化培养，得到再生苗；
[0032]
所述继代培养基和所述分化培养基均为所述愈伤诱导培养基；
[0033]
所述愈伤诱导培养基中包括萘乙酸(naa)和6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)。
[0034]
进一步的，所述naa在所述愈伤诱导培养基中的浓度可为1-2mg/l；进一步可 为1-1.5mg/l或1.5-2mg/l；更进一步可为1mg/l或1.5mg/l或2mg/l。
[0035]
所述6-ba在所述愈伤诱导培养基中的浓度可为0.2-2mg/l；进一步可为0.2-1 mg/l或1-2mg/l；更进一步可为0.2mg/l或1mg/l或2mg/l。
[0036]
所述3-1)的培养条件如下：在黑暗，温度为24-25℃，湿度为50-60％条件下培 养3周；
[0037]
所述3-2)的培养条件如下：在黑暗，温度为24-25℃，湿度为50-60％条件下培 养2-3周；
[0038]
所述3-3)的培养条件如下：先在黑暗，温度为24-25℃，湿度为50-60％条件下 培养1周，然后在光照强度为500-1000lx，温度为24-25℃，湿度为50-60％条件下 培养1周，再在光照强度为2500-3000lx，温度为24-25℃、湿度为50-60％条件下 培养2-3周。
导培养基和/或芽诱导培养基和/或生根培养基；
[0060]
a3)用于天山雪莲再生培养的成套试剂，包括上述天山雪莲再生培养方法中的赤 霉素溶液和/或ms培养液和/或愈伤诱导培养基和/或芽诱导培养基和/或生根培养基。
[0061]
本发明最后提供了如下b1)-b4)任一种应用：
[0062]
b1)上述方法或产品在培养天山雪莲中的应用；
[0063]
b2)上述方法或产品在繁育或扩繁天山雪莲中的应用；
[0064]
b3)上述方法或产品在缩短天山雪莲繁育或扩繁时间中的应用；
[0065]
b4)赤霉素或赤霉素溶液在促进天山雪莲种子萌发中的应用。
[0066]
本发明的有益效果如下：
[0067]
1、本发明的天山雪莲再生培养技术体系中采用水培的方式培养天山雪莲种子，首 次开发了天山雪莲水培方式，与现有技术中仅能通过组培方式获得天山雪莲无菌种子 苗相比，本发明突破了天山雪莲平地生长的限制，解决了天山雪莲在平地很难成活的 难题，通过水培方式成功获得天山雪莲水培苗，实现了天山雪莲在低海拔的平地环境 下的正常生长。
[0068]
2、本发明的天山雪莲再生培养技术体系中采用赤霉素处理天山雪莲种子，有效的 促进了天山雪莲种子的萌发，有利于提高种质资源利用率和节约天山雪莲野生种质资 源。
[0069]
3、本发明的天山雪莲再生培养技术体系中优化了天山雪莲组培快繁体系，本发明 将愈伤诱导与芽诱导两个过程合二为一，外植体在本发明的愈伤诱导培养基中培养5-6 周时就会出现丛生芽，与现有技术中“种子-无菌苗-诱导愈伤-诱导芽-生根”过程需要 6-8个月相比，本发明中“种子-水培苗-愈伤诱导与芽诱导-生根”仅需5个月就可完成天 山雪莲的再生培养，有效缩短了育种时间，节省人力、物力、财力。
[0070]
4、本发明的天山雪莲再生培养技术体系中的组培快繁方法中，在生根培养之前增 加了芽再诱导步骤，每个单株苗的基部又会生出2-3个新的芽，与现有技术中“诱导丛 生芽之后，培养一段时间，将丛生芽分开，挑选单株直接进行生根培养”相比，本发明 增加芽再诱导步骤后的扩繁系数可提高2-3倍。
[0071]
本发明提供的天山雪莲再生培养技术体系包括天山雪莲新的培育模式—水培体系 的开发及天山雪莲组培快繁体系的优化，二者的有机结合，不仅有效的解决了天山雪 莲野生资源短缺的问题，突破了天山雪莲平地生长的限制，还最大化的缩短了组培快 繁时间，节省人力、物力、财力。为天山雪莲的资源化和保护化研究提供了重要基础。
附图说明
[0072]
图1：雪莲种子萌发。
[0073]
图2：雪莲种子水培。
[0074]
图3：水培苗(1月龄)。
[0075]
图4：水培苗(3月龄)。
[0076]
图5：外植体愈伤诱导。
[0077]
图6：芽诱导。
[0078]
图7：芽分化。
[0079]
图8：组培苗瓶中培养。
具体实施方式
[0080]
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均可在常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。
[0081]
实施例1：天山雪莲动态水培养方法
[0082]
1.1雪莲种子萌发
[0083]
取天山雪莲种子放入50ml离心管中，加入200ml/l的赤霉素(ga3)，置于4 ℃冰箱中，黑暗、低温处理12h后，将处理后的种子铺到滤纸或培养皿中，光下培养， 培养条件如下：光照强度为2000-3000lx、温度为25℃、湿度为50-60％，培养3-5 天即可萌发，得到实验组萌发的种子(图1)。
[0084]
取天山雪莲种子放入50ml离心管中，置于4℃冰箱中，黑暗、低温处理12h后， 将处理后的种子铺到滤纸或培养皿中，光下培养，培养条件如下：光照强度为2000-3000 lx、温度为25℃、湿度为50-60％，培养3-5天即可萌发，得到对照组萌发的种子。
[0085]
统计实验组和对照组的种子萌发率。结果表明：对照组种子萌发率为20％，实验 组种子萌发率为65％。
[0086]
1.2水培液配置
[0087]
称取1.1g ms粉末(购自生工有限公司，货号：f3150901)，溶于1l三级水中， ph值为5.6-6.0。
[0088]
1.3种子水培
[0089]
将步骤1.1获得的萌发的种子置于装有陶粒的水培装置(水培装置和陶粒均是淘 宝店铺[乾元水培]的产品)中，每个水培孔槽放3-5颗萌发的天山雪莲种子(图2)， 然后将放入种子后的水培装置放置到光照培养架上在光照强度为2000-3000lx、光照 时间为16h/d、含氧量大于5mg/l、温度为25℃、湿度为50-60％、水泵流量为50l/h 条件下进行培养，两周更换一次培养液(步骤1.2中的水培液)。
[0090]
水培苗培养1个月后(水培苗如图3所示)，将水泵流量调整到150l/h，一周更 换一次培养液，其它条件不变，继续培养。
[0091]
水培苗培养2个月后，将水泵流量调整到350l/h，一周更换两次培养液，其它条 件不变，继续培养至得到3月龄的天山雪莲。3月龄的天山雪莲水培苗如图4所示。
[0092]
实施例2：天山雪莲的再生培养方法
[0093]
2.1外植体消毒
[0094]
取实施例1获得的2月龄天山雪莲的外植体(叶片、叶柄、根)作为材料，进行 消毒。消毒过程为：自来水冲洗1h，于超净工作台中，使用无菌水冲洗3-5次，10％naclo 浸泡5-10min，75％酒精消毒30s，无菌水洗净。
[0095]
2.2愈伤诱导
[0096]
用剪刀先将外植体剪成1cm2大小(图5)，然后置于愈伤诱导培养基上进行愈伤 诱导培养。
[0097]
愈伤诱导培养条件如下：黑暗培养，温度为25℃，湿度为50-60％。
[0098]
每升愈伤诱导培养基由ms粉末3.32g，蔗糖30g，naa 1.5mg，6-ba 1mg，植 物凝胶
4g和1l水组成。愈伤诱导培养基的ph值为5.9-6.0。
[0099]
每升愈伤诱导培养基’由ms粉末3.32g，蔗糖30g，naa 2mg，6-ba 0.2mg， 植物凝胶4g和1l水组成。愈伤诱导培养基’的ph值为5.9-6.0。
[0100]
在愈伤诱导培养基或愈伤诱导培养基’中培养3周后，统计愈伤诱导率。在愈伤 诱导培养基’中，根、叶片和叶柄的愈伤诱导率分别为90％、90％和90％。在愈伤诱 导培养基中，根、叶片和叶柄的愈伤诱导率分别为90％、90％和90％。
[0101]
2.3愈伤组织继代培养
[0102]
在愈伤诱导培养基中培养3周后，更换到新的继代培养基上继代培养。
[0103]
继代培养基同2.2中的愈伤诱导培养基或愈伤诱导培养基’。
[0104]
继代培养条件同2.2中的愈伤诱导培养条件。
[0105]
愈伤组织在继代培养基上诱导2-3周后，叶片和叶柄会有丛生芽出现(图6)， 而根没有丛生芽出现。
[0106]
在继代培养基中培养3周后统计芽诱导率。在愈伤诱导培养基’中，叶片和叶柄 的芽诱导率分别为89％和90％。在愈伤诱导培养基中，叶片和叶柄的芽诱导率分别为 90％和95％。
[0107]
2.4丛生芽诱导及分化
[0108]
将在继代培养基上诱导2-3周后出现的丛生芽挑出更换到新的分化培养基上继续 黑暗培养。分化培养基同2.2中的愈伤诱导培养基或愈伤诱导培养基’。
[0109]
黑暗培养1周后置于弱光下培养1周，培养条件如下：光照强度为500-1000lx， 温度为25℃，湿度为50-60％。
[0110]
弱光下培养1周后置于组培架上在正常条件下继续培养，培养条件如下：光照强 度为2500-3000lx，温度为25℃、湿度为50-60％。继续培养2-3周后，丛生芽分化 成苗，如图7所示。
[0111]
2.5芽再诱导
[0112]
将1月龄的组培苗更换到芽诱导培养基上，培养1-2周，组培苗基部会诱导出新 芽，继续培养1-2周，可发育成苗。培养条件如下：光照强度为2500-3000lx，温度 为25℃、湿度为50-60％。
[0113]
每升芽诱导培养基由ms粉末2.21g，蔗糖15g，6-ba 0.5mg，植物凝胶4g和 1l水组成。芽诱导培养基的ph值为5.9-6.0。
[0114]
2.6组培苗生根
[0115]
将步骤2.4中在分化培养基上生长4-5周后或步骤2.5中在芽诱导培养基上生长 4-5周后的组培苗更换到生根培养基上，培养条件如下：光照强度为2000-3000lx、温 度为25℃、湿度为50-60％，培养3周后得到再生植株(图8)。
[0116]
每升生根培养基由ms粉末2.21g，蔗糖15g，naa 0.3mg和1l水组成。生根 培养基的ph值为5.9-6.0。
[0117]
将步骤2.4中在分化培养基上生长4-5周后或步骤2.5中在芽诱导培养基上生长 4-5周后的组培苗更换到生根培养基上培养3周后，统计生根率。结果表明：两者生 根率均为60％。但与不经过芽再诱导，直接将步骤2.4中得到的丛生芽进行生根培养 相比，经过步骤2.5中的芽再诱导步骤后，每个单株苗的基部又会生出2-3个新的芽， 扩繁系数提高2-3
倍。
[0118]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进 和润饰也应视为本发明的保护范围。