一种C反应蛋白检测试剂处理液、试剂盒及检测方法与流程

一种c反应蛋白检测试剂处理液、试剂盒及检测方法
技术领域
1.本发明涉及化学发光检测技术领域，具体涉及一种c反应蛋白检测试剂处理液、试剂盒及检测方法。


背景技术：

2.c反应蛋白(c-reactive protein，crp)包括常规c反应蛋白和超敏c反应蛋白，是一种急性时相反应蛋白，在胎儿时期产生，非母体胎盘传递，健康人血清浓度低。其产生机理是:当机体受感染或组织受损伤时巨噬细胞和其他白细胞等被激活，产生白细胞介素-6(il-6)、白细胞介素-1(il-1)等细胞因子及其他介导物，这些细胞因子和介导物到达肝脏，刺激肝细胞和上皮细胞合成crp，可以激活补体和加强吞噬细胞的吞噬而起调理作用，从而清楚入侵机体的病原微生物和损伤、坏死、凋亡的组织细胞，在机体的天然免疫过程中发挥重要的保护作用。在结构上，人类的crp由5个相同的非糖基化多肽亚基组成，每个亚基包含206个氨基酸残基和两个钙离子结合位点，具有很好的稳定性及精确性，是炎症和组织损伤的非特异性标志物。
3.在健康人体中，血清crp含量一般低于5mg/l，在细菌感染时显著升高，早期细菌和严重病毒感染轻度升高，一般病毒感染不升高。在炎症、组织损伤和手术后，crp浓度显著增高；疾病后4-6h开始升高，6-12h就可以检测到血液中升高的crp，24-48h达到高峰，比正常值高100-1000倍，升高幅度与感染程度呈正相关，持续时间与病程相当。因此通过不同浓度的crp不仅可以鉴别细菌感染和病毒感染，还能反应机体炎症的严重程度等，是一项灵敏度高、特异性强的指标，已被公认为是目前最敏感的脓毒血症诊断指标，其对感染前期的诊断、鉴别感染类型和感染程度，指导抗生素应用等方面有很高的价值，因此，检测血清crp浓度在临床上有很高的指导意义。
4.c反应蛋白一般是通过化学发光检测法进行检测，但检测反应时间长，结果产出慢，并且检测线性范围比较窄，对于低浓度的c反应蛋白检测敏感度不高，影响检测效果，因此如何提高c反应蛋白试剂盒低端灵敏度，以及如如何扩大检测线性范围成为c反应蛋白检测技术的研究方向。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种c反应蛋白检测试剂处理液、试剂盒及检测方法，以解决现有技术检测c反应蛋白的时间长，结果产出慢，并且检测线性范围较窄的问题。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:一种c反应蛋白检测试剂处理液，处理液包括以下组分:柠檬酸、柠檬酸三钠、tween-20，该处理液的ph值为3.3～3.6。
7.进一步优选，所述处理液中，柠檬酸、柠檬酸三钠、tween-20的配制质量比为4.5～5.5:2.5～3.5:1。
8.一种试剂盒，包括权利要求1所述的c反应蛋白检测试剂处理液，还包括 r1试剂和r2试剂；
9.所述r1试剂为被tris缓冲液稀释的偶联磁珠，所述偶联磁珠包被着c反应蛋白抗体；
10.所述r2试剂为被mes缓冲液稀释的标记抗体。
11.进一步优选，所述处理液中，柠檬酸、柠檬酸三钠、tween-20的添加量的比例为4.5～5.5:2.5～3.5:1。
12.进一步优选，所述标记抗体包括c反应蛋白抗体和吖啶酮类化合物。
13.进一步优选，所述吖啶酮类化合物为吖啶酯。
14.一种检测方法，包括上述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒用于检测c 反应蛋白样本中c反应蛋白的浓度，所述c反应蛋白血清样本、处理液、r1试剂和r2试剂参与化学发光检验的测试体积比为1：8～12:5:10。
15.进一步优选，所述处理液、r1试剂和r2试剂与含有c反应蛋白的血清样本的孵育时间为5～7min。
16.有益效果：一种c反应蛋白检测试剂处理液、试剂盒及检测方法，其中处理液包括以下组分：柠檬酸、柠檬酸三钠、tween-20，试剂m的ph值为3.3～3.6，通过对处理液的ph值的设定，降低整体反应体系的ph，可以控制c反应蛋白检测的反应速率，消除hook效应，并且使样本中较低浓度的c反应蛋白也能被准确的检测出，从而达到提高检测的低端灵敏度的目的。
附图说明
17.图1是不同ph的试剂m制成的试剂盒对第一样品组检测结果的线性关系图；
18.图2是不同ph的试剂m制成的试剂盒对第二样品组检测结果的线性关系图；
19.图3是试剂m不同参与量对第一样品组检测结果的线性关系图；
20.图4是试剂m不同参与量对第二样品组检测结果的线性关系图。
具体实施方式
21.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
22.实施例1：
23.一种c反应蛋白检测试剂处理液、试剂盒及检测方法，是通过将处理液、 r1试剂和r2试剂加入到试剂盒中，并设定各试剂的反应量，对含有c反应蛋白的血清进行孵育，不仅能提高试剂盒检测的低端灵敏度、扩大其线性范围，还能缩短孵育时间，快速完成检测。
24.其中处理液为试剂m，是将柠檬酸、柠檬酸三钠、tween-20按照质量比为 4.5～5.5:2.5～3.5:1溶于水中制得；r1试剂为被tris缓冲液稀释的偶联磁珠，偶联磁珠包被着c反应蛋白抗体；r2试剂为被mes缓冲液稀释的标记抗体。
25.包括试剂m、r1试剂和r2试剂的试剂盒，包括以下步骤制成：
26.r1试剂的配制：
27.a、制备超顺磁性微粒:选用亲水性的tosyl磁珠，且tosyl磁珠的粒径为 3.0μm，将tosyl磁珠与crp抗体进行偶联制得超顺磁性微粒，在偶联过程中使用1m的硫酸铵进行反应催化，其中催化温度为37℃，催化时间为24h；
28.b、通过浓度为50mmol/l的tris缓冲液、浓度为0.5g/l的proclin 300 和浓度为
0.8g/l的叠氮钠溶液对超顺磁性微粒进行稀释，稀释至超顺磁性微粒的浓度为0.25mg/ml，得到r1试剂。
29.r2试剂的配制：
30.c、将吖啶酮类化合物和crp抗体在25℃下进行混合，之后通过脱盐纯化得到crp抗体-吖啶酯标记物；
31.d、通过浓度为50mmol/l的mes缓冲液、浓度为0.5g/l的proclin 300和浓度为0.8g/l的叠氮钠溶液对crp抗体-吖啶酯标记物按照1/3000的比例稀释，得到r2试剂，r2试剂中crp抗体-吖啶酯标记物浓度为0.02μg/ml。
32.试剂m的配制：
33.e、称取16.43g的柠檬酸(一水)添加到500ml的一级纯净水内，并在磁力搅拌机上进行混合溶解；
34.f、柠檬酸溶解后加入7.58g的柠檬酸三钠进行溶解；
35.g、在柠檬酸三钠溶解完全后依次加入0.5g的pc300和3g的tween20；
36.h、在步骤g完全溶解后加入500ml的一级纯净水，最终得到ph值为3.3 的试剂m。
37.制备试剂盒：
38.将试剂m加入到试剂盒中的腔体内，并将上述配制好的r1试剂和r2试剂分别加入到对应的磁珠腔和吖啶腔，即可得到c反应蛋白试剂盒。在检测血清中c反应蛋白时，通过试剂m降低整体反应体系的ph，营造一个适宜的孵育环境，缩短孵化时间，实现快速检测。
39.c反应蛋白的检测：
40.样品准备：
41.第一样本组:准备不同c反应蛋白浓度的血清样本:0、10.7、21.4、42.8、 85.6、171.2、256.8、342.4、428(单位:mg/l)；
42.第二样本组，用于测试低端灵敏度:准备不同c反应蛋白浓度的血清样本:0、 2.14、4.28、6.42、8.56、10.7(单位:mg/l)；
43.设置实验组：将上述制得的c反应蛋白试剂盒放入到全自动化学发光免疫分析仪试剂仓相应位置，同时将第一样本组和第二样本组放到对应的样本位，并设置方法学为：(10μl)样本 (100μl)试剂m (50μl)r1 (100μl) r2，时间：5min，之后申请测试即可。
44.另外还设置有对照组，即在检测中不添加试剂m，按照实验组的方法对第一样本组和第二样本组进行检测。
45.在其他实施例中，分别调整试剂m的ph，使其ph分别为3.5和3.6，之后将试剂m、r1试剂和r2试剂加入到试剂盒中不同的腔体内；并将试剂盒分别放入到全自动化学发光免疫分析仪试剂仓相应位置，同时将第一样本组和第二样本组放到对应的样本位，设置实验组，并设置方法学为：(10μl)样本 (100 μl)试剂m (50μl)r1 (100μl)r2，时间：5min，之后申请测试即可。
46.上述实施例中不同ph的试剂m制成的c反应蛋白试剂盒，检测第一样本组时，所测出的发光值如下表1所示；且上述实施例测得的发光值的线性曲线如图1所示，其中以样本浓度(单位：mg/l)为横坐标，发光值为纵坐标绘出标准曲线。
47.表1不同ph的试剂m制成的试剂盒对第一样本组的检测结果
[0048][0049]
通过表1和图1可以看出，对照组的试剂盒对c反应蛋白检测过程中出现 hook效应；而包括ph＝3.3～3.6的试剂m的试剂盒，在检测第一样本组时，发光值与c反应蛋白的浓度线性相关性强,r值均大于0.99，可以解决hook效应。并且在试剂盒内加入ph为3.3～3.6的试剂m，孵育过程仅需要5min，就可以有效的检测出发光值，缩短了整体的反应时间，从而达到快速出结果的目的。
[0050]
上述实施例中不同ph的试剂m制成的c反应蛋白试剂盒，在检测第二样本组时，所测出的发光值如下表2所示；且上述实施例测得的发光值的线性曲线如图2所示，其中以样本浓度(单位：mg/l)为横坐标，发光值为纵坐标绘出标准曲线
[0051]
表2不同ph的试剂m制成的试剂盒对第二样品组的检测结果
[0052][0053][0054]
从表2和图2中可以看出，对照组在低浓度c反应蛋白检测过程中灵敏度不高，不能有效的检测出低浓度的c反应蛋白的含量；包括ph＝3.3～3.6的试剂m的试剂盒，在检测不同c反应蛋白浓度的样本时，发光值与c反应蛋白的浓度线性相关性强相关，系数均大于0.99，能准确的检测出低浓度的c反应蛋白含量，提高了低端灵敏度。
[0055]
实施例2：
[0056]
一种c反应蛋白检测试剂处理液、试剂盒及检测方法，是通过将处理液、 r1试剂和r2试剂加入到试剂盒中，并设定各试剂的反应量，对含有c反应蛋白的血清进行孵育，不仅
能提高试剂盒检测的低端灵敏度、扩大线性范围，还能缩短孵育时间，实现快速检测。
[0057]
其中处理液为试剂m，是将柠檬酸、柠檬酸三钠、tween-20按照质量比为 4.5～5.5:2.5～3.5:1溶于水中制得；r1试剂为被tris缓冲液稀释的偶联磁珠，偶联磁珠包被着c反应蛋白抗体；r2试剂为被mes缓冲液稀释的标记抗体。
[0058]
包括上述试剂的试剂盒，包括试剂m、r1试剂和r2试剂，其制备方法如下：
[0059]
r1试剂的配制：
[0060]
a、制备超顺磁性微粒:选用亲水性的tosyl磁珠，且tosyl磁珠的粒径为 3.0μm，将tosyl磁珠与crp抗体进行偶联制得超顺磁性微粒，在偶联过程中使用1m的硫酸铵进行反应催化，其中催化温度为37℃，催化时间为24h；
[0061]
b、通过浓度为50mmol/l的tris缓冲液、浓度为0.5g/l的proclin 300 和浓度为0.2g/l的叠氮钠溶液对超顺磁性微粒进行稀释，稀释至超顺磁性微粒的浓度为0.25mg/ml，得到r1试剂。
[0062]
r2试剂的配制：
[0063]
c、将吖啶酮类化合物和crp抗体在25℃下进行混合，之后通过脱盐纯化得到crp抗体-吖啶酯标记物；
[0064]
d、通过浓度为50mmol/l的mes缓冲液、浓度为0.5g/l的proclin 300和浓度为0.2g/l的叠氮钠溶液对crp抗体-吖啶酯标记物按照1/3000的比例稀释，得到r2试剂，r2试剂中crp抗体-吖啶酯标记物浓度为0.02μg/ml。试剂m的配制：
[0065]
e、称取13.45g/l的柠檬酸(一水)添加到500ml一级纯净水内，并在磁力搅拌机上进行混合溶解；
[0066]
f、柠檬酸溶解后加入10.56g/l的柠檬酸三钠进行溶解；
[0067]
g、在柠檬酸三钠溶解完全后依次加入0.5g/l的pc300和3.0g/l的tween20；
[0068]
h、在步骤g完全溶解后加入500ml的一级纯净水；最终得到ph值为3.6 的试剂m。
[0069]
制备试剂盒：
[0070]
将试剂m加入到试剂盒中的腔体内，并将上述配制好的r1试剂和r2试剂分别加入到对应的磁珠腔和吖啶腔，即可得到c反应蛋白试剂盒。在检测血清中c反应蛋白时，通过试剂m降低整体反应体系的ph，营造一个适宜的孵育环境，缩短孵育时间。
[0071]
c反应蛋白的检测：
[0072]
样品准备：
[0073]
第一样本组：准备不同c反应蛋白浓度的血清样本：0、10.7、21.4、42.8、85.6、171.2、256.8、342.4、428(单位：mg/l)；
[0074]
第二样本组，测试低端灵敏度：准备不同c反应蛋白浓度的血清样本：0、2.14、4.28、6.42、8.56、10.7(单位：mg/l)；
[0075]
设置实验组：将上述制得的c反应蛋白试剂盒放入到全自动化学发光免疫分析仪试剂仓相应位置，同时将第一样本组和第二样本组放到对应的样本位，并设置方法学为：(10μl)样本 (80μl)试剂m (50μl)r1 (100μl)r2，时间：7min，之后申请测试即可。
[0076]
另外还设置有对照组，即在试剂盒中不添加试剂m，按照实验组的方法对第一样本组和第二样本组进行检测。
[0077]
在其他实施例中，试剂盒中的不同腔体内加入试剂m、r1试剂和r2试剂，之后将试
剂盒分别放入到全自动化学发光免疫分析仪试剂仓相应位置，同时将第一样本组和第二样本组放到对应的样本位，设置实验组，并设置试剂m的添加量而分别为100μl和120μl，时间：7min，之后申请测试即可。
[0078]
上述实施例中设置试剂m不同反应量，在检测第一样本组时，所测出的发光值如下表3所示；且上述实施例测得的发光值的线性曲线如图3所示，其中以样本浓度(单位：mg/l)为横坐标，发光值为纵坐标绘出标准曲线。
[0079]
表3试剂m不同反应量对第一样品组的检测结果
[0080][0081][0082]
通过表3和图3可以看出，对照组在没有试剂m参与的情况下，检测c反应蛋白，出现了hook效应，而试剂m参与反应的实验组，在检测过程中内均有良好的线性关系，且无hook效应。并且试剂m、r1试剂和r2试剂的参与反应的体积比在8～12:5:10的范围内，孵育时间均比较短，仅需要7min，就可以有效的检测出发光值，缩短了整体的反应时间，从而达到快速出结果的目的。
[0083]
上述实施例中试剂m不同反应量，在检测第二样本组，所测出的发光值如下表4所示；且上述实施例测得的发光值的线性曲线如图4所示，其中以样本浓度(单位：mg/l)为横坐标，发光值为纵坐标绘出标准曲线。
[0084]
表4不同试剂m添加量对第二样品的组检测结果
[0085]
[0086]
从表4和图4中可以看出，对照组在没有试剂m参与的情况下，对于低浓度的c反应蛋白的检测灵敏度低，不能有效的检测出低浓度的c反应蛋白的含量；而试剂m、r1试剂和r2试剂的参与反应的体积比在8～12:5:10的范围内时，在检测不同低端c反应蛋白浓度时，均有良好的线性关系，并且对低浓度的c反应蛋白含量的血清进行检测均具有较高的灵敏度，可以有效的提高试剂盒检测c反应蛋白时的低端灵敏度。
[0087]
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本技术相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。