一种评判吐温80对水生生物危害程度的方法及应用与流程

1.本发明属于水环境技术领域，具体涉及一种评判吐温80对水生生物危害程度的方法及应用。


背景技术：

2.近几十年来，表面活性剂作为分散剂或乳化剂被广泛应用在人类生活和生产的诸多领域。人类使用的表面活性剂中无法利用的部分通过废水、废渣等途径进入到自然环境中，造成了越来越严重的环境污染问题。表面活性剂大体可以分为阴、阳离子表面活性剂，两性表面活性剂以及非离子表面活性剂四类，吐温80(聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯，简称聚山梨酯-80)是非离子表面活性剂的代表之一，化学式为c
24h44
o6(c2h4o)n。
3.吐温80可以有效的稳定油-水界面，与植物、食品等相互作用，因此其常被应用到食品领域中；并且，吐温80因其稳定性和可生物降解性也被广泛应用于水污染和土壤污染修复领域，通过增加难溶性有机物污染物的水溶性，从而增加其被水体微生物降解的能力。如受多环芳烃(pahs)、除草剂苯噻草胺(mf)污染的土壤，通常就是采用吐温80增加它们的水溶性，从而达到修复的目的。此外，吐温80还可以增加很多难溶性药品的可溶性，因此也被作为注射制药剂广泛应用于医药领域。由于用途广泛，导致吐温80大量排入水环境，对水生生物的生存产生了极大的危害。遗憾的是，水环境中吐温80的安全剂量范围还没有被界定清楚，如何用指示生物判断水体中吐温80污染浓度也还没有报道。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种评判吐温80对水生生物危害程度的方法及应用，通过建立浓度-效应响应关系，可以通过浮游生物响应模式判断水体吐温80污染程度，为制定该污染物的环境安全剂量范围提供科学依据。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种评判吐温80对水生生物危害程度的方法，包括以下步骤：以浮游生物为指示食物，以所述浮游生物为食的动物为指示动物，构建指示食物和吐温80的剂量效应关系、指示动物和吐温80的剂量效应关系及指示动物的滤食效应关系，综合所述指示食物和吐温80的剂量效应关系、指示动物和吐温80的剂量效应关系及指示动物的滤食效应关系评判吐温80对水生生物的危害程度。
7.优选的，所示指示食物包括小球藻，所述指示动物包括枝角类动物。
8.优选的，所述指示食物和吐温80的剂量效应关系的构建方法，包括：设置若干吐温80浓度梯度的体系，利用相同的初始指示食物密度进行培养，每隔相同的时间记录一次指示食物的密度，共记录5次指示食物的密度。
9.优选的，所述吐温80浓度梯度包括在所述体系中设置以下浓度的吐温80：0mg/l、0.001mg/l、0.01mg/l、0.1mg/l、1mg/l、10mg/l和100mg/l。
10.优选的，所述体系中包括吐温80和combo培养基。
11.优选的，所述培养时，初始指示食物的密度为1
×
105cell/ml。
12.优选的，所述指示动物和吐温80的剂量效应关系包括吐温80对大型溞的急性毒性关系和吐温80对大型溞生理行为的影响。
13.优选的，所述吐温80对大型溞的急性毒性关系的构建方法，包括：设置若干吐温80浓度梯度的体系，每个体系加入等量的新生的指示动物，每隔相同的时间记录一次指示动物的死亡率；
14.所述吐温80对大型溞生理行为的影响的构建方法，包括：设置若干吐温80浓度梯度的体系，每个体系加入10只新生指示动物，统计指示动物的生理行为包括：指示动物的心跳以及其运动能力。
15.优选的，所述指示动物的滤食效应关系的构建方法，包括：设置若干吐温80浓度梯度的体系，每个体系加入等量的指示食物和等量的新生的指示动物，进行滤食实验。
16.本发明还提供了上述方法在判断水体吐温80污染程度中的应用。
17.有益效果：本发明提供了一种评判吐温80对水生生物危害程度的方法，以环境敏感生物-浮游生物为指示食物，评判新型污染物吐温80对水生生物的危害。在本发明实施例中，以浮游植物(小球藻)、枝角类(大型溞)为实验对象，判断吐温80对小球藻的生长，大型溞死亡、心跳频率、划水次数及大型溞滤食效率的影响，结果表明0.001mg/l、0.01mg/l和0.1mg/l吐温80对小球藻密度有促进作用，而其它处理随着吐温80浓度增加，对小球藻密度的抑制作用越显著；大型溞的行为受到吐温80浓度的影响，且随着时间的增加而增加，高浓度(10mg/l和100mg/l)的吐温80对大型溞的运动有显著的抑制作用；随着吐温80浓度递增，大型溞死亡率增加，表现出剂量依赖性，经过概率分析后发现，大型溞的24h-lc
50
、48h-lc
50
、72h-lc
50
和96h-lc
50
浓度分别为198.20、171.59、139.77和126.87mg/l；暴露4h单因素方差分析表明，短时间内吐温80对大型溞对藻类的摄食率没有显著影响，但随着吐温80浓度的增加，滤食效率率呈下降趋势。上述结果表明吐温80对生物的生长有影响，是水环境污染的指示；在行业标准安全剂量不明确的情况下，以浮游植物(小球藻)为例，给出了大致的行业安全剂量标准范围；给出了水体环境中大概的安全范围。
附图说明
18.图1为吐温80浓度梯度下的小球藻密度；
19.图2为吐温80浓度梯度下大型溞的死亡率；
20.图3为吐温80浓度梯度下大型溞的心跳频率；
21.图4为吐温80浓度梯度对大型溞的运动能力影响；
22.图5为吐温80浓度梯度下，大型溞对藻类的摄食率影响。
具体实施方式
23.本发明提供了一种评判吐温80对水生生物危害程度的方法，包括以下步骤：以浮游生物为指示食物，以所述浮游生物为食的动物为指示动物，构建指示食物和吐温80的剂量效应关系、指示动物和吐温80的剂量效应关系及指示动物的滤食效应关系，综合所述指示食物和吐温80的剂量效应关系、指示动物和吐温80的剂量效应关系及指示动物的滤食效应关系评判吐温80对水生生物的危害程度。
24.本发明所述指示食物优选包括小球藻，所述指示动物优选包括枝角类动物，更优选包括大型溞。
25.本发明所述指示食物和吐温80的剂量效应关系的构建方法，优选包括：设置若干吐温80浓度梯度的体系，利用相同的初始指示食物密度进行培养，每隔相同的时间记录一次指示食物的密度，共记录5次指示食物的密度。本发明所述吐温80浓度梯度优选包括在所述体系中设置以下浓度的吐温80：0mg/l、0.001mg/l、0.01mg/l、0.1mg/l、1mg/l、10mg/l和100mg/l。本发明所述体系中优选包括吐温80和combo培养基。本发明所述combo培养基的配制方法优选包括8种主要母液的配制、藻类微量元素的配制、浮游动物微量元素的配制、维生素的配制和培养基调配。
26.本发明所述8种主要母液的配制优选包括分别称取：cacl2·
2h2o7.352g、mgso4·
7h2o 7.394g、k2hpo
4 1.742g、nano
3 17.002g、nahco
3 2.52g、na2sio3·
9h2o 5.684g、h3bo
3 4.8g和kcl 1.49g，各自在烧杯中用蒸馏水充分溶解之后转入200ml的容量瓶中定容，各装入200ml的棕色试剂瓶中，并贴上标签注明药品名称、浓度及日期。
27.本发明所述藻类微量元素的配制，优选包括：用量度为万分之一的电子天平各称取na2edta
·
2h2o 0.436g、fecl3·
h2o 0.1g、mncl2·
4h2o 18g、cuso4·
5h2o 0.1g、cocl2·
6h2o 1.0g、znso4·
7h2o 2.2g、namoo4·
2h2o2.2g、h2seo
3 0.16g和na3vo
4 0.18g，其中na2edta
·
2h2o和fecl3·
h2o用蒸馏水充分溶解后分别转入100ml容量瓶定容，分别装入100ml棕色试剂瓶中，标明为母液；从母液中各取0.2ml溶液转入200ml容量瓶定容，各装入200ml棕色试剂瓶中，贴标签注明药品名称、浓度及时间；mncl2·
4h2o、cuso4·
5h2o、cocl2·
6h2o、znso4·
7h2o、namoo4·
2h2o、h2seo3和na3vo4则合并用蒸馏水溶解转入200ml容量瓶中定容，共同装入一个100ml棕色试剂瓶，标明为母液；从母液中各取0.2ml溶液转入200ml容量瓶定容，装入200ml棕色试剂瓶中，标记为ate，及取量毫升数，标签上注明配置时间。
28.本发明所述浮游动物微量元素的配制，优选包括：分别称取licl 15.5g、rbcl 3.5g、srcl2·
h2o 7.5g、nabr 0.8g和ki 0.165g，合并用蒸馏水溶解，并转至100ml容量瓶中定容后，装入100ml棕色试剂瓶，标明为母液；从母液中各取0.4ml溶液转入200ml容量瓶定容，装入200ml棕色试剂瓶中，贴上标签animate及取量毫升数。
29.本发明所述维生素的配制，优选包括：用量度为万分之一的电子天平分别称取b
12
0.00011g、biotin 0.0001g、thiamin 0.02g，b
12
与biotin合并用蒸馏水溶解并定容至200ml，thiamin单独溶解、定容，转入棕色试剂瓶，各注明标签。维生素试剂母液在-4℃、避光条件下储存。
30.本发明所述培养基调配，优选包括用标准移液枪(5ml)各从13瓶储备液中分别移取5次(2
×
5)到2l容量瓶中，用蒸馏水定容，配置得到10lcombo培养基。
31.本发明在所述培养时，初始指示食物的密度优选为1
×
105cell/ml，并且每隔12h记录一次小球藻的藻密度，共记录5次，共60h。
32.本发明所述指示动物和吐温80的剂量效应关系优选包括吐温80对大型溞的急性毒性关系和吐温80对大型溞生理行为的影响，其中所述吐温80对大型溞的急性毒性关系的构建方法，优选包括：设置若干吐温80浓度梯度的体系，每个体系加入等量的新生的指示动物，每隔相同的时间记录一次指示动物的死亡率。本发明实施例中，优选对吐温80设置0、0.001、0.01、0.1、1、10和100(单位：mg/l)七个浓度梯度，每个浓度设置6个重复，实验容器
为250ml烧杯，实验体系为100ml。实验开始时，在每个烧杯中放入100ml培养基与吐温80的混合培养液，并随机选择10只新生(0～24h)大型溞于一个烧杯内。烧杯溶液中不加藻类，在实验过程中，每小时从光培养箱中取出所有烧杯，并在培养箱中以80转/分的速度机械搅拌10分钟以方便气体交换。并于24h、48h、72h、96h统计大型溞死亡数量，计算其死亡率以及相应的lc
50
数据。
33.本发明所述吐温80对大型溞生理行为的影响的构建方法，优选包括：设置若干吐温80浓度梯度的体系，每个体系加入等量的指示食物和等量的新生的指示动物，统计指示动物的生理行为。本发明在构建指示动物和吐温80的剂量效应关系时，优选设计0mg/l、0.001mg/l、0.01mg/l、0.1mg/l、1mg/l、10mg/l和100mg/l七个浓度梯度，每个浓度6个重复。在本发明实施例中，在500ml的烧杯中进行上述生理行为的观察和统计，实验体系为200ml(除大型溞体积外，包括吐温80和培养基组成的混合培养液共200ml)，加入藻密度1
×
105cell/ml，随机选择10只新生(0～24h)大型溞加入每一个处理中，大型溞密度为20ml/只，进行大型溞生理行为实验，在实验中记录大型溞的五分钟划水次数及每分钟的心跳次数。本发明所述培养基优选与上述相同，在此不再赘述。
34.本发明所述指示动物的滤食效应关系的构建方法，优选包括：设置若干吐温80浓度梯度的体系，每个体系加入等量的指示食物和10只新生的指示动物，进行滤食实验。本发明在构建所述指示动物的滤食效应关系时，优选0mg/l、0.1mg/l、1mg/l、和10mg/l四个浓度梯度，每个浓度梯度8个重复。在本发明实施例中，在500ml的烧杯中进行上述滤食效应的观察和统计，容器为500ml的烧杯，实验体系为200ml(除大型溞体积外，包括藻液、吐温80和培养基组成的混合培养液共200ml)，加入藻密度1
×
105cell/ml，随机选择10只新生(0～24h)大型溞加入每一个处理中，大型溞密度为20ml/只，进行滤食实验。在本发明中，优选还设计无大型溞的对照实验。
35.利用本发明所述方法，可在行业标准安全剂量不明确的情况下，以浮游植物(小球藻)为例，给出大致的行业安全剂量标准范围和水体环境中大概的安全范围，并且可借此判断水体中吐温80的污染程度。
36.本发明还提供了上述方法在判断水体吐温80污染程度中的应用。本发明所述应用优选与上述相同，在此不再赘述。
37.下面结合实施例对本发明提供的一种评判吐温80对水生生物危害程度的方法及应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
38.实施例1
39.浮游植物是小球藻(chlorella vulgaris)，并构建小球藻—大型溞食物链。
40.1、浮游植物急性毒性实验：设定7个吐温80浓度梯度，分别是0、0.001、0.01、0.1、1、10、100(单位：mg/l)，每个浓度设置6个重复，在相同的初始藻密度(1
×
105cell/ml)、不同浓度的吐温80下，每隔12h记录小球藻的藻密度，共记录5次，共60h。
41.结果如图1所示，在低浓度和短时间内，吐温80对小球藻的影响并不显著，但是在长时间和高浓度的暴露下，吐温80对小球藻呈现出了显著影响。低浓度吐温80对小球藻无影响，各处理与对照之间无显著差异。100mg/l处理组的藻密度显著低于对照。从整个实验周期看，相比对照，0.001、0.01和0.1mg/l吐温80对小球藻密度有促进作用，而其它处理随着吐温80浓度增加，对小球藻密度的抑制作用越显著。
42.2、吐温80对大型溞的急性毒性实验：吐温80设置0、0.001、0.01、0.1、1、10、100(单位：mg/l)七个浓度梯度，每个浓度设置6个重复，实验容器为250ml烧杯，实验体系为100ml。实验开始时，在每个烧杯中放入100ml培养基与吐温80的混合培养液，并随机选择10只新生(0～24h)大型溞于一个烧杯内。烧杯溶液中不加藻类，在实验过程中，每小时从光培养箱中取出所有烧杯，并在培养箱中以80转/分的速度机械搅拌10分钟(thz-103b，上海一恒科学仪器公司，中国上海)以方便气体交换。并于24h、48h、72h、96h统计大型溞死亡数量，计算其死亡率以及相应的lc
50
数据。
43.结果如图2所示，在整个96h的实验中，随着吐温80浓度递增，大型溞死亡率增加，表现出剂量依赖性。对照组的大型溞只有在96h出现死亡，死亡率为33.3％，与对照组相比，0.001mg/l浓度的吐温80对大型溞的死亡没有显著影响，100mg/l浓度的吐温80导致大型溞死亡率显著上升。给定的吐温80浓度下，大型溞的死亡率随着暴露时间增加而增加，表现出时间依赖性急性毒性。经过概率分析后发现，大型溞的24h-lc
50
、48h-lc
50
、72h-lc
50
和96h-lc
50
浓度分别为198.20、171.59、139.77和126.87mg/l。
44.3、大型溞生理行为影响实验：选择0、0.001、0.01、0.1、1、10、100(单位：mg/l)七个浓度梯度，每个浓度6个重复，容器为500ml的烧杯，实验体系为200ml(除大型溞体积外，包括吐温80和培养基组成的混合培养液共200ml)，加入藻密度1
×
105cell/ml，随机选择10只新生(0～24h)大型溞加入每一个处理中，大型溞密度为20ml/只，进行大型溞生理行为实验。分别于暴露的第2、4、6、8h用摄像机录制视频对大型溞划水次数进行统计，每个处理拍摄5min，大型溞暴露4h后，从每个烧杯中随机选取三只大型溞转移到长方体玻璃框中，玻璃框中含有相应暴露吐温80浓度的培养基，使用显微成像系统(奥林巴斯、日本)观测和录制大型溞的心跳，每只大型溞录制1min，观测结束后将大型溞放回原培养的烧杯中继续培养。
45.拍摄动物行为时，需搭建摄像机支架，把摄像机安置在垂直于实验烧杯的方向上，提前调整支架高度和光线亮度，保证烧杯内壁无光圈且大型溞无趋光行为。通过调整烧杯位置和摄像机角度以获得最佳的录制效果，能够较好的记录大型溞的运动轨迹。拍摄完成后，从每个烧杯中随机选取3只大型溞进行追踪，分别记录每个处理中大型溞在5min内的划水总次数。
46.心跳速率结果如图3所示，实验2、4、6、8h的结果表明，大型溞的行为受到吐温80浓度的影响，且这种影响随着时间的增加而增加。高浓度(10和100mg/l)的吐温80对大型溞的运动有显著的抑制作用，与对照组相比，暴露在10和100mg/l的吐温80中2、4、6和8h后，大型溞的运动能力分别下降了7.19％和9.42％；10.13％和14.61％；9.20％和19.54％；10.20％和25.95％。此外，大型溞的心跳速率与游泳运动呈显著正相关，大型溞的心跳速率越快，其游泳能力越强。
47.划水次数结果如图4所示，高浓度(10和100mg/l)的吐温80对大型溞的运动有显著的抑制作用，与对照组相比，暴露在10和100mg/l的吐温80中2、4、6和8h后，大型溞的运动能力分别下降了7.19％和9.42％；10.13％和14.61％；9.20％和19.54％；10.20％和25.95％。
48.4、大型溞滤食实验：选择0、0.1、1、10(单位：mg/l)四个吐温80浓度梯度，每个浓度梯度8个重复，容器为500ml的烧杯，实验体系为200ml(除大型溞体积外，包括藻液、吐温80和培养基组成的混合培养液共200ml)，加入藻密度1
×
105cell/ml，随机选择10只新生(0～24h)大型溞加入每一个处理中，大型溞密度为20ml/只，进行滤食实验，并且同时做无大型
溞的对照实验。
49.结果如图5所示，暴露4h单因素方差分析表明，短时间内吐温80对大型溞对藻类的摄食率没有显著影响，但随着吐温80浓度的增加，滤食效率率呈下降趋势。
50.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。