一种滇牡丹花粉生活力的快速检测方法与流程

1.本发明生物技术领域，具体涉及一种滇牡丹花粉生活力的快速检测方法。


背景技术：

2.中国西南山地，以云南的西北部为其分布中心，生长于1900-3600m海拔的山地树林边缘(洪德元，1999)，是我国特有的珍稀濒危物种，也是牡丹组植物中花色最丰富(张艳丽等，2011)、分布最广、居群最多的物种，是牡丹新品种选育和培育中不可替代的重要种质资源。因此，开展滇牡丹种质资源收集、引种驯化与栽培以及杂交育种等研究，是有效保护野生滇牡丹种质资源的重要基础工作，对促进牡丹产业的发展具有重要的现实意义。
3.牡丹品种改良、新品种培育目前仍依赖于杂交育种，而杂交亲本的花粉活力是杂交成功的必要条件，也是生产上选配授粉品种的重要依据。进行花粉生活力测定的方法主要为离体萌发法和染色剂染色法，根据不同的适用范围和不同的植物材料选取合适的测定方法。离体萌发法是最接近花粉真实活力的测定方法，能够准确表现花粉活力(chichiricco et al.，2019；xiong et al，2020)，已应用于牡丹(盖树鹏，2011)、竹叶兰(夏春英，2019)、蜡梅(沈植国，2021)、连翘(杨延红，2021)等植物；染色剂染色法可以在短时间内快速测定新鲜花粉的活力(melekber et al.，2014；kosel et al，2018；王士泉，2020，杨延红，2021)。已有研究显示，滇牡丹花粉形态和外壁纹饰的多样性及萌发特性与其居群来源和花色等密切相关且差异较大(李奎，2011；贾文庆，2021；李宗艳，2004；律春燕，2011)，对不同海拔居群来源滇牡丹花粉活力的培养条件及染色方法没有一致的探讨与比较。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了解决现有技术中的问题，具体提出了一种滇牡丹花粉生活力的快速检测方法。
5.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：本发明的一种滇牡丹花粉生活力的快速检测方法，其特征在于包括如下步骤：(1)取少量花粉于载玻片上分别用ttc、醋酸洋红、i2-ki和甲乙液对花粉进行染色，每个染色法做3个重复，每个重复观察3个视野测定，测定方法均在室温下静置5min后观察；(2)滇牡丹花粉在不同培养基条件下均能萌发，但不同培养基的萌发率存在显著差异(p《0.01)。
6.进一步地，在步骤(1)中，所述的测定方法为ttc法：滴加1～2滴0.5％的ttc溶液，在40℃的恒温培养箱培养15-20min后在显微镜下观察染色情况，统计染成红色的花粉粒所占的比率。
7.进一步地，在步骤(1)中，所述的测定方法为醋酸洋红法：滴加1滴1％的醋酸洋红溶液，统计染成红色的花粉粒所占比率。
8.更进一步地，在步骤(1)中，所述的测定方法为i2-ki法：滴加1滴2％的i2-ki溶液，统计染成蓝色花粉所占的比率；甲乙液法：加入1滴甲液，1～2min后加入乙液，统计染成红
色的花粉粒所占比例。
9.有益效果：本发明培养基150g/l蔗糖 30mg/l h3bo3适合进行滇牡丹花粉活力检测，醋酸洋红染色法得染色方法对滇牡丹花粉活力检测与上述离体培养检测活力的结果一致，因此，本醋酸洋红染色法在杂交育种工作中快速测定滇牡丹花粉活力，提高育种效率。
附图说明
10.图1为本发明的5种染色法检测滇牡丹花粉活力的示意图。
具体实施方式
11.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
12.实施例1
13.材料与方法
14.1试验方法
15.1.1滇牡丹花粉离体萌发法培养基的筛选
16.试验选择滇牡丹种源中育性较好的丽江红旗居群植株花粉为试验材料，根据预试验筛选出适宜花粉萌发的蔗糖浓度为150g/l，以及5个浓度的h3bo3溶液(0，25，30，35，40mg/l)和cacl2溶液(0，20，25，30，35mg/l)进行2因素5水平的正交试验，液体培养基ph均为6.0。将含有蔗糖、h3bo3和cacl2的培养液混合，滴在单凹载玻片上，用毛笔轻轻均匀的撒上滇牡丹花粉，每个处理3个重复玻片，将玻片放入保湿的培养皿内，置于25℃的恒温培养箱中培养4小时观察花粉萌发率，每个玻片观测3个视野，以花粉管长度超过花粉直径2倍作为萌发标准，统计花粉萌发率(张颖，2005；李宗艳，2004)。
17.1.2滇牡丹花粉染色剂的筛选
18.取少量花粉于载玻片上分别用ttc、醋酸洋红、i
2-ki和甲乙液对花粉进行染色，每个染色法做3个重复，每个重复观察3个视野。ttc法：滴加1～2滴0.5％的ttc溶液，在40℃的恒温培养箱培养15-20min后在显微镜下观察染色情况，统计染成红色的花粉粒所占的比率；醋酸洋红法：滴加1滴1％的醋酸洋红溶液，统计染成红色的花粉粒所占比率；i
2-ki法：滴加1滴2％的i
2-ki溶液，统计染成蓝色花粉所占的比率；甲乙液法：加入1滴甲液，1～2min后加入乙液，统计染成红色的花粉粒所占比例，以上3种测定均在室温下静置5min后观察。
19.试验例1
20.结果与分析
21.2.1滇牡丹花粉离体萌发培养基的筛选
22.滇牡丹花粉在不同培养基条件下均能萌发，但不同培养基的萌发率存在显著差异(p《0.01)，适宜滇牡丹花粉萌发的最优培养基为150g/l蔗糖 30mg/l h3bo(处理11)，萌发率最高，为94.34
±
1.19％(表2-1)。本试验中的2个因素的r(极差)值差异明显，h3bo3的r值最高，为64.896，是cacl2的6.46倍，表明h3bo3的水平变动对实验结果的影响大。除此之外，当培养基为蔗糖和h3bo3时，花粉萌发率为66.63％-94.34％，是培养基中仅有蔗糖的花粉萌发率的26.75-37.89倍；当培养基中不含h3bo3，为蔗糖和cacl2时，花粉萌发率为14.79％-55.52％，是培养基中仅有蔗糖的5.9-22.30倍。因此h3bo3是影响滇牡丹花粉萌发的关键因
子，说明向培养基中添加硼酸可以显著地促进滇牡丹花粉萌发。
23.2.2染色剂的筛选
24.试验表明不同染色剂对滇牡丹花粉活力的检测结果有显著差异(p《0.01)，最佳的染色剂为醋酸洋红试剂，其染色检测结果与离体萌发法检测结果相似，无显著差异(p《0.01)，仅相差2％(表1，图1)，且整个花粉粒的显色反应呈均匀的红色；采用ttc试剂染色，花粉染色率较低仅为19.69
±
0.95％，与离体萌发的检测结果具有显著差异(p《0.01)，花粉粒显色反应不均匀；采用i
2-ki染色，花粉粒基本被染为黄褐色；用甲乙液染色，未观察到花粉粒有显色反应，因此，醋酸洋红试剂可以作为快速测定滇牡丹花粉活力的染色方法，其他三种染色剂的显色反应不能准确判定滇牡丹花粉有无活力。5种方法测定滇牡丹花粉活力的比较如表1所示。
25.表1
[0026][0027]
注：表中数据为平均值
±
标准差；同行中的不同大写字母表示duncan’s检验在p《0.01下差异显著，-表示花粉粒未被染色。
[0028]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。