调节生物细胞分裂进程的方法及其应用与流程

1.本发明属于细胞生物学和基因工程领域，更具体地，本发明涉及调节生物细胞分裂进程的方法及其应用。


背景技术：

2.细胞分裂(cell division)是指活细胞增殖及其数量持续增加的过程。通常包括细胞核分裂和细胞质分裂两步。在核分裂过程中母细胞把遗传物质传给子细胞。真核细胞分裂包括有丝分裂、减数分裂、无丝分裂。从一次细胞分裂结束开始，经过物质积累过程，直到下一次细胞分裂结束为止，称为一个细胞周期。
3.在高等植物中，细胞分裂的速度决定细胞的数目和大小，与组织器官的形态和大小密切相关。细胞分裂异常将会导致多种人类疾病，细胞分裂受抑制会阻碍生长发育而不受控制的细胞分裂将会导致癌症的发生。
4.自然情况下，细胞分裂受到一系列基因、酶和蛋白质等内在因素的调控。不同的组织基因选择性表达所以会造成差异。但其它一系列因素也会导致细胞分裂受到影响，例如一些外界信号的刺激，有细胞因子(如肽类生长因子)、激素和细胞外基质等。非自然情况下，射线、低温﹑化学药剂、病毒等环境因素对细胞分裂的影响是通过内因起作用的，即通过导致基因突变或影响酶的活性而影响细胞分裂。
5.阐明细胞分裂的精细调控机制或发现新的细胞分裂调控基因不仅有助于深入了解细胞正常的生命活动和功能发挥，而且对更有效、更特异地预防细胞过度增殖相关疾病如癌症和恶性肿瘤具有重要意义。
6.因此，本领域还需要对这方面的研究进行进一步的深入，以期找到调控细胞分裂的新的有效途径。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供调节生物细胞分裂进程的方法及其应用。
8.在本发明的第一方面，提供一种通过调节植物细胞krp6蛋白及动物同源carf蛋白的稳定性进而调节细胞分裂或调节生物的生物量的方法。
9.在本发明的另一方面，提供一种调节细胞分裂或调节生物的生物量的方法，包括：调节细胞中krp6蛋白的磷酸化水平，所述的krp6蛋白包括其同源蛋白；较佳地，所述的krp6蛋白的同源蛋白包括动物来源的carf蛋白。
10.在本发明的另一方面，提供krp6蛋白的用途，用于作为调节细胞分裂或调节生物的生物量的靶蛋白，通过调节其磷酸化水平来调节细胞分裂或调节生物的生物量；所述的krp6蛋白包括其同源蛋白；较佳地，所述的krp6蛋白的同源蛋白包括动物来源的carf蛋白。
11.在一个优选例中，调节细胞中krp6蛋白或其同源蛋白的氨基酸位点以调节磷酸化水平，所述的氨基酸位点包括选自下组：相应于krp6蛋白氨基酸序列第75位；相应于krp6蛋白氨基酸序列第109位；相应于carf蛋白氨基酸序列第316位；和/或相应于carf蛋白氨基酸
序列第356位。
12.在另一优选例中，所述调节细胞中krp6蛋白的磷酸化水平能够增强或减弱krp6或其同源蛋白的蛋白稳定性；或，减弱或促进相关细胞周期进程。
13.在另一优选例中，提高krp6磷酸化水平可降低krp6稳定性、促进其降解，进而促进细胞分裂或增加生物的生物量。
14.在另一优选例中，降低krp6磷酸化水平可提高krp6稳定性、抑制其降解，进而抑制细胞分裂或降低生物的生物量。
15.在另一优选例中，所述方法包括：下调细胞中krp6蛋白的磷酸化水平，从而抑制细胞生长、抑制细胞分裂或降低生物的生物量；较佳地，所述下调细胞中krp6蛋白的磷酸化水平包括：在细胞中下调ael蛋白的表达；或，将相应于krp6蛋白氨基酸序列第75位和/或第109位改变为非磷酸化位点，较佳地改变为ser、thr、lys以外的氨基酸，更佳地改变为ala。
16.在另一优选例中，所述方法包括：上调细胞中krp6蛋白的磷酸化水平，从而促进细胞生长、促进细胞分裂或增加生物的生物量；较佳地，所述上调细胞中krp6蛋白的磷酸化水平包括：在细胞中上调ael蛋白的表达；或，将相应于krp6蛋白氨基酸序列第75位和/或第109位改变为磷酸化位点，更佳地改变为asp或glu。
17.在另一优选例中，所述方法包括：下调细胞中carf蛋白的磷酸化水平，从而抑制细胞生长、抑制细胞分裂；较佳地，所述下调细胞中carf蛋白的磷酸化水平包括：将相应于carf蛋白氨基酸序列第316位和/或第356位改变为非磷酸化位点，较佳地改变为ser、thr、lys以外的氨基酸，更佳地改变为ala。
18.在另一优选例中，所述方法包括：上调细胞中carf蛋白的磷酸化水平，从而促进细胞生长、促进细胞分裂；较佳地，所述上调细胞中carf蛋白的磷酸化水平包括：将相应于carf蛋白氨基酸序列第316位和/或第356位改变为磷酸化位点，更佳地改变为asp或glu。
19.在另一优选例中，所述的细胞为表达krp6蛋白或其同源蛋白的细胞。
20.在另一优选例中，所述krp6蛋白或其同源蛋白包括植物来源的蛋白或动物来源的蛋白；较佳地，所述植物包括双子叶植物，更佳地包括(但不限于)：十字花科植物、禾本科植物、茄科植物；较佳地，所述动物包括哺乳动物，更佳地包括(但不限于)：啮齿类动物、灵长类动物。
21.在另一优选例中，所述十字花科植物包括：拟南芥；所述的禾本科植物包括：水稻、小麦、玉米；或，所述的茄科植物包括：马铃薯、西红柿。
22.在另一优选例中，所述的哺乳动物包括：鼠、人。
23.在另一优选例中，所述动物细胞包括：人的293a细胞。
24.在另一优选例中，所述krp6同源蛋白为carf蛋白时，所述方法为体外方法，或为非治疗性的方法。
25.在另一优选例中，所述ael蛋白包括：ael1，ael2，ael3，ael4。
26.在另一优选例中，所述的调节细胞分裂或调节生物的生物量的方法包括制备转基因植物的方法。
27.在另一优选例中，所述的抑制细胞分裂包括：抑制细胞过度增殖。
28.在另一优选例中，所述的调节生物量为调节植物组织大小；较佳地，所述的组织包括：叶片，种子。
29.在本发明的另一方面，提供一种krp6蛋白或其同源蛋白的变体，其序列中磷酸化位点相关的氨基酸位点发生突变，所述同源蛋白包括carf蛋白；所述变体包括选自下组：相应于krp6蛋白氨基酸序列第75位突变的krp6蛋白变体；相应于krp6蛋白氨基酸序列第109位突变的krp6蛋白变体；相应于carf蛋白氨基酸序列第316位突变的carf蛋白变体；和/或相应于carf蛋白氨基酸序列第356位突变的carf蛋白变体。
30.在一个优选例中，所述的第75位、第109位、第316位和/或第356位改变为非磷酸化位点；更佳地改变为ser、thr、lys以外的氨基酸；更佳地，改变为ala。
31.在另一优选例中，所述第75位、第109位、第316位和/或第356位改变为磷酸化位点；更佳地，改变为asp或glu。
32.在本发明的另一方面，还提供了编码所述krp6蛋白或其同源蛋白的变体的多核苷酸。
33.在本发明的另一方面，还提供了表达载体，其包含有编码所述krp6蛋白或其同源蛋白的变体的多核苷酸。
34.在一个优选例中，所述krp6蛋白包括：(a)seq id no:1所示氨基酸序列的蛋白；(b)将seq id no:1所示氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；(c)氨基酸序列与(a)限定的氨基酸序列有85％以上(较佳地90％以上；更佳地95％以上；如98％以上或99％以上)相同性且具有(a)蛋白功能的蛋白；或(d)具有(a)蛋白功能的seq id no:1的片段。
35.在另一优选例中，所述carf蛋白包括：(a)seq id no:2所示氨基酸序列的蛋白；(b)将seq id no:2所示氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；(c)氨基酸序列与(a)限定的氨基酸序列有85％以上(较佳地90％以上；更佳地95％以上；如98％以上或99％以上)相同性且具有(a)蛋白功能的蛋白；或(d)具有(a)蛋白功能的seq id no:2的片段。
36.在本发明的另一方面，提供一种ael蛋白或其调节剂的用途，用于调节细胞分裂或调节生物的生物量；较佳地，其通过调节细胞中krp6蛋白的稳定性或磷酸化水平，调节细胞分裂或调节生物的生物量；更佳地，所述ael蛋白降低krp6蛋白的稳定性、促进krp6蛋白的磷酸化或降解，进而促进细胞分裂或增加生物的生物量。所述的ael蛋白包括其同源蛋白。
37.在另一优选例中，所述调节剂为ael蛋白上调剂，其降低krp6蛋白的稳定性、促进krp6蛋白的磷酸化水平或降解，进而促进细胞分裂或增加生物的生物量；或所述的调节剂为下调剂，其提高krp6蛋白的稳定性、降低krp6蛋白的磷酸化水平或降解，进而抑制细胞分裂或减少生物的生物量；较佳地，所述的ael包括ael1，ael2，ael3，ael4。
38.在另一优选例中，所述上调剂包括选自：重组表达ael的表达构建物(包括表达载体)，增强ael与krp6相互作用的多肽或化合物，ael的化学上调剂，促进ael基因启动子驱动能力的上调剂，ael基因特异性microrna的下调剂或其组合。
39.在另一优选例中，所述下调剂包括选自：敲除或沉默ael的试剂；特异性与ael结合的结合分子(如抗体或配体)；针对ael的化学小分子拮抗剂或抑制剂；抑制ael与krp6相互作用的多肽或化合物。所述敲除或沉默ael的试剂包括(但不限于)：针对ael的crispr基因
编辑试剂，特异性干扰ael表达的干扰分子，针对ael的同源重组试剂或定点突变试剂，所述同源重组试剂或定点突变试剂将ael进行功能丧失性突变。较佳地，所述干扰分子包括sirna、shrna，mirna，反义核酸等，或能形成所述sirna、shrna，mirna，反义核酸等的构建体。
40.在另一优选例中，所述的ael蛋白通过调节细胞中krp6蛋白的磷酸化水平：增强或减弱krp6的蛋白稳定性；或减弱或促进相关细胞周期进程。
41.在另一优选例中，所述ael蛋白包括：(a)表1中任一ael蛋白序列所示氨基酸序列的蛋白；(b)将表1中任一ael蛋白序列所示氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；(c)氨基酸序列与(a)限定的氨基酸序列有85％以上(较佳地90％以上；更佳地95％以上；如98％以上或99％以上)相同性且具有(a)蛋白功能的蛋白；或(d)具有(a)蛋白功能的表1中任一ael蛋白序列所示氨基酸序列的蛋白的片段。
42.在本发明的另一方面，提供ael蛋白和/或krp6蛋白的用途，用于筛选调节细胞分裂或调节生物的生物量的物质；或用于作为鉴定细胞分裂或植物生物量的标志物。
43.在本发明的另一方面，提供一种筛选调节细胞分裂或调节生物的生物量的物质(包括潜在物质)的方法，所述方法包括：(1)将候选物质加入到含有krp6蛋白的体系中；其中，所述krp6蛋白包括其同源蛋白；较佳地，其同源蛋白为carf蛋白；(2)检测(1)的体系中krp6蛋白或其同源蛋白的磷酸化水平的变化；若所述候选物质能够降低(显著降低，如降低10％、20％、30％、50％以上或更低)krp6蛋白或其同源蛋白的磷酸化水平，则表明该候选物质是抑制细胞分裂或减少生物的生物量的物质；若所述候选物质能够提高(显著提高，如提高10％、20％、30％、50％以上或更高)krp6蛋白或其同源蛋白的磷酸化水平，则表明该候选物质是促进细胞分裂或增加生物的生物量的物质。
44.在另一优选例中，还包括设置对照组，从而明确分辨测试组中krp6蛋白包括其同源蛋白的磷酸化水平与对照组的差异，或ael蛋白和krp6蛋白的相互作用与对照组的差异。
45.在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对ael蛋白和krp6蛋白或其编码基因或它们的上游或下游蛋白或基因设计的调控分子(如上调剂、小分子化合物基因编辑构建物等。
46.本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
47.图1、ael与krp6相互作用(左图)并体外磷酸化krp6(右图)的结果。ael1-4与krp6均存在相互作用且ck1可以对krp6蛋白进行磷酸化。
48.图2、ael1在体外降低krp6蛋白稳定性的结果。无细胞体系实验证明在ael突变体中krp6蛋白稳定性显著增强。
49.图3、ael1在体内降低krp6蛋白稳定性的结果。转基因材料体内蛋白稳定性证明在ael突变体中krp6蛋白稳定性显著增强。其中，l1、l3表示不同的拟南芥株系。
50.图4、s75和s109为krp6的磷酸化位点。通过体外预测，lc-ms验证以及点突变蛋白体外磷酸化实验验证krp6的磷酸化位点为第75和109位的丝氨酸。
51.图5、模拟非磷酸化点突变在体外促进krp6的蛋白稳定性的结果。无细胞体系实验证明模拟非磷酸化点突变的krp6蛋白稳定性显著增强。
52.图6、模拟非磷酸化点突变在体内促进krp6的蛋白稳定性的结果。转基因材料体内蛋白稳定性证明在模拟非磷酸化点突变的krp6蛋白稳定性显著增强。其中，l6表示拟南芥株系。
53.图7、模拟非磷酸化点突变krp6抑制细胞分裂导致叶面积减小的结果。其中l1～l4表示不同的植物转基因株系。
54.图8、植物ael123，ael124突变体近轴面与远轴面叶表皮细胞电镜扫描结果。
55.图9、流式细胞仪检测植物ael123，ael124突变体第一对真叶细胞倍性结果。
56.图10、krp6动物同源蛋白carf与淋巴肿瘤和血液肿瘤密切相关的分析结果。
57.图11、carf与krp6有保守的磷酸化位点的结果。
58.图12、模拟非磷酸化点突变carf抑制细胞分裂导致细胞增殖减慢的结果。右侧统计图为使用软件imagej对灰度进行的检测和统计，p value显示差异显著。
具体实施方式
59.本发明人经过深入的研究，揭示了拟南芥1型酪蛋白激酶(casein kinase 1，ck1)ael(arabidopsis el1-like)与krp6(kip-related protein6)具有相互作用，通过影响krp6特定位置的磷酸化水平和稳定性来调控细胞分裂的进程，该关键的磷酸化位点可在细胞分裂进程中发挥重要的调控作用；本发明人还发现了来自动物的carf(collaborator of arf)与krp6具有同源性，对该carf的调控也能够影响细胞分裂。本发明为植物的性状改良提供了新的途径，同时也可为人类精准医学提供了新的靶点。
60.蛋白靶点
61.如本发明所用，所述的ael可以包括ael1、ael2、ael3、ael4，其蛋白可以分别具有表1中所示的氨基酸序列。所述的krp6蛋白可以具有seq id no:1所示氨基酸序列。所述的carf蛋白可以具有seq id no:2所示氨基酸序列。
62.本发明还包括具有与上述ael、krp6和carf相同功能的序列变异形式。所述变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。任何与所述的上述ael、krp6和carf同源性高(同源性为70％或更高；优选地同源性为80％或更高；更优选地同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有上述ael、krp6和carf相同功能的蛋白也包括在本发明内。来源于拟南芥或鼠以外其它物种的与上述ael、krp6和carf的多肽序列的同源性较高、或在同样或相近的调控通路中发挥同样或相近作用的多肽也包括在本发明中。
63.本发明中，所述的ael、krp6和carf也包括其同源物。应理解，虽然本发明中优选研究了获自特定物种的ael、krp6和carf，但是获自其它物种的与它们高度同源(如具有60％以上，如70％，80％，85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它多肽或基因也在本发明考虑的范围之内。
64.编码所述ael、krp6和carf的多核苷酸(基因)可以是来自生物的天然基因，也可以
是它们的简并的序列。
65.包含所述编码序列的载体，以及用所述的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞也包括在本发明中。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含合适的表达载体。
66.宿主细胞可包括原核细胞或真核细胞，例如是植物细胞或动物细胞。更具体地例如，所述原核细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌或链霉菌，或所述真核细胞包括植物细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
67.转化植物一般可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法等；优选的是农杆菌法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得相对于野生型而言性状发生改变的植物。
68.当用于作为人工调控的靶标时或人为建立筛选系统时，以上的蛋白或编码基因可以是天然存在的，比如其可被纯化和分离自哺乳动物；也可以是重组制备的，比如可以根据常规的基因重组技术来生产重组的蛋白。此外，任何不影响这些蛋白的生物活性的变化形式都是可用的，如它们的功能未发生改变的衍生物或变异体。
69.蛋白靶点的调控作用
70.本发明中首次揭示，ael通过调控krp6调控细胞分裂的作用，以及可通过调控krp6的动物同源蛋白carf蛋白稳定性进而调控细胞分裂的作用。本发明中首次发现，ael蛋白可以磷酸化krp6蛋白，并且定位到krp6蛋白被磷酸化的两个关键氨基酸位点。本发明进一步发现krp6蛋白在动物中的同源蛋白carf与肿瘤相关且也具有保守的磷酸化位点，其突变导致人细胞的分裂改变。ael可以应用于植物细胞分裂进而器官大小和形态的调控，以改良植物品种；调控carf蛋白稳定性的氨基酸位点的发现可以应用于相关肿瘤疾病的精准治疗以及靶向药物的筛选。
71.本发明中，所述的“生物”包括“植物”或“动物”，所述的“植物”是多种可表达krp6蛋白或其同源蛋白，ael蛋白或其同源蛋白的植物。例如，包括但不限于：十字花科植物，禾本科植物、茄科植物、大戟科植物等。比如，所述的“植物”包括但不限于：水稻、小麦、玉米、马铃薯、木薯等。较佳的，所述的植物是十字花科植物。所述的“动物”是多种可表达carf蛋白或其同源蛋白(也可以是krp6蛋白的同源蛋白)的动物，包括哺乳动物。例如，包括但不限于啮齿类动物，灵长类动物。所述的灵长类动物也包括人，所述的啮齿类动物包括鼠。
72.本发明的技术方案中，所述的细胞为“生物”细胞，包括植物细胞和动物细胞，只要其中表达有krp6蛋白或其同源蛋白，如carf蛋白；较佳地，其还表达ael蛋白或其同源蛋白。
73.基于本发明人的新发现，本发明提供了一种调节细胞分裂或调节生物的生物量的方法，所述方法包括：调节细胞中krp6蛋白或其同源蛋白的磷酸化水平，所述的krp6蛋白包括其同源蛋白。优选的实施方式中，所述细胞为表达krp6蛋白或其同源蛋白的植物细胞，或为表达carf或其同源蛋白的动物细胞。
74.基于本发明人的新发现，本发明还提供了一种调节植物细胞分裂、调节植物生物量的方法，所述方法包括：调控植物体内ael或其同源蛋白，进而调节植物细胞分裂、调节植物生物量。
75.本发明中，所述的调节生物量是指调节生物体的组织的大小，通常细胞分裂快会使得生物体的组织更大，而细胞分裂慢则使得生物体的组织相对小。在本发明的具体实施
例中，所述的生物量以植物叶片来具体呈现，但是本发明也不限于叶片这一种组织，当细胞分裂被有效改变的情况下，可以理解的是，植物的其它组织也会有相应的生物量的改变。
76.应理解，在得知了所述krp6蛋白(包括其同源蛋白)的磷酸化水平和/或ael(包括其同源蛋白)的功能后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的krp6蛋白和/或ael的表达或活性或磷酸化水平。比如可以采用本领域人员熟知的多种方法来过表达krp6或降低krp6表达或使之缺失表达。或采用本领域技术人员熟知的方法来促进或减弱蛋白磷酸化，增强或减弱信号通路的运行。
77.一方面，本发明提供了一种抑制细胞生长、抑制细胞分裂或降低生物的生物量的方法，包括：下调细胞中krp6蛋白的磷酸化水平。其中，所述的下调细胞中krp6蛋白的磷酸化水平的一种优选方式是：在细胞中下调ael蛋白的表达。另一种优选方式，可将相应于krp6蛋白氨基酸序列第75位和/或第109位改变为非磷酸化位点，较佳地将所述第75位和/或第109位改变为ser、thr、lys以外的氨基酸，更佳地将所述第75位和/或第109位改变为ala。
78.另一方面，本发明提供了一种促进细胞生长、促进细胞分裂或增加生物的生物量的方法，包括：上调细胞中krp6蛋白的磷酸化水平。其中，所述上调细胞中krp6蛋白的磷酸化水平的一种优选方式是：在细胞中上调ael蛋白的表达。另一种优选方式，也可将相应于krp6蛋白氨基酸序列第75位和/或第109位改变为磷酸化位点，更佳地将所述第75位和/或第109位改变为asp或glu。
79.在本发明的具体实施例中，将底物蛋白krp6或carf的磷酸化位点突变为模拟非磷酸化(krp6
s75a
、krp6
s109a
、carf
s316a
、和carf
s356a
)形式，krp6或carf的蛋白稳定性增强，细胞分裂受到抑制；若将底物蛋白krp6或carf的磷酸化位点突变模拟磷酸化(krp6
s75d
、krp6
s109d
、carf
s316d
、和carf
s356d
)形式，krp6或carf的蛋白稳定性减弱，细胞分裂不受抑制，在动物中不受抑制的细胞分裂将有可能导致癌症的发生。
80.基于本发明的新发现，本发明还提供了krp6蛋白或其同源蛋白的变体，其序列中磷酸化位点相关的氨基酸位点发生突变，所述同源蛋白包括carf蛋白；所述变体包括选自下组：相应于krp6蛋白氨基酸序列第75位突变的krp6蛋白变体；相应于krp6蛋白氨基酸序列第109位突变的krp6蛋白变体；相应于carf蛋白氨基酸序列第316位突变的carf蛋白变体；和/或相应于carf蛋白氨基酸序列第356位突变的carf蛋白变体。更优选地，所述的第75位和/或第109位改变为非磷酸化位点。更佳地，所述第75位和/或第109位改变为ser、thr、lys以外的氨基酸；更佳地，所述第75位和/或第109位改变为ala。或者，所述第75位和/或第109位改变为磷酸化位点；更佳地，所述第75位和/或第109位改变为asp、glu。
81.除了通过点突变的形式进行，其它对于蛋白的特定位点进行磷酸化或去磷酸化的方法也可被包含在本发明中。例如，有一些酶在磷酸化和去磷酸的过程中起作用。
82.对于蛋白的磷酸化的检测是本领域已知的技术，例如可利用磷酸化特异性抗体、western blot、酶联免疫吸附分析、细胞内流式细胞术、质谱法或它们的组合。
83.本发明中，以所述的krp6蛋白或其同源蛋白carf、ael蛋白或其同源蛋白，或它们的编码基因的任一作为目的蛋白或目的基因，其上调剂包括了促进剂、激动剂、激活剂。所述的“上调”、“促进”包括了蛋白活性的“上调”、“促进”或蛋白表达的“上调”、“促进”，且它们为具有统计学意义的“上调”、“促进”。任何可提高目的蛋白的活性、提高目的蛋白的稳定
性、上调目的的表达、增加目的蛋白有效作用时间的物质、调节目的蛋白的磷酸化水平而促进蛋白激活，这些物质均可用于本发明，作为对于上调目的蛋白有用的物质。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括dna、rna)的，也可以是蛋白水平的。
84.本发明中，以所述的krp6蛋白或其同源蛋白carf、ael蛋白或其同源蛋白，或它们的编码基因的任一作为目的蛋白或目的基因，其下调剂包括：抑制剂、阻滞剂、拮抗剂等，是指任何可降低所述目的蛋白的活性、降低目的蛋白或其编码基因的稳定性、下调目的蛋白的表达、减少目的蛋白有效作用时间、抑制目的蛋白的转录和翻译的物质、或降低目的蛋白的磷酸化而抑制蛋白激活的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调这些目的蛋白或目的基因有用的物质。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括dna、rna)的，也可以是蛋白水平的。
85.在本发明的一种实施方式中，可以利用ael蛋白本身的或其上调剂来提高ael蛋白的表达，从而提高细胞中krp6蛋白的磷酸化水平，降低krp6蛋白的稳定性，促进krp6蛋白的降解，这使得细胞分裂抑制被解除，或生物的生物量发生增加。例如，所述的上调剂是：过表达ael蛋白的表达载体等。
86.在本发明的一种实施方式中，可以利用ael蛋白的下调剂来降低ael蛋白的表达，从而降低细胞中krp6蛋白的磷酸化水平，提高krp6蛋白的稳定性，降低krp6蛋白的降解，这使得细胞分裂被抑制，或生物的生物量减少。例如，所述的下调剂是：干扰rna分子或反义核苷酸；基因编辑试剂，等等。
87.以ael蛋白或krp6蛋白或它们的同源蛋白为靶点，对植物细胞分裂的调控可以应用于植物育种之中，实现植物品种改良，选育出果实大小形态更优良的植物品种。
88.以ael蛋白或krp6蛋白或它们的同源蛋白为靶点，对动物细胞分裂的调控则有望应用于临床医学的相关疾病治疗中，carf蛋白的磷酸化位点为相关细胞过度增殖相关疾病如肿瘤的精准治疗以及靶向药物的筛选提供新的思路和线索。
89.生物标志物/筛选靶点
90.在得知了krp6蛋白或其同源蛋白、ael蛋白或其同源蛋白的功能以后，可以以它们或它们的编码基因为分子标记物，来进行植物的定向筛选。也可基于该新发现来筛选通过调节这一机制，从而定向调控生物性状。
91.本发明提供了一种筛选调节细胞分裂或调节生物的生物量的物质(包括潜在物质)的方法，所述方法包括：(1)将候选物质加入到含有krp6蛋白的体系中；其中，所述krp6蛋白包括其同源蛋白；较佳地，其同源蛋白为carf蛋白；(2)检测(1)的体系中krp6蛋白或其同源蛋白的磷酸化水平的变化；若所述候选物质能够降低(显著降低，如降低10％、20％、30％、50％以上或更低)krp6蛋白或其同源蛋白的磷酸化水平，则表明该候选物质是抑制细胞分裂或减少生物的生物量的物质；若所述候选物质能够提高(显著提高，如提高10％、20％、30％、50％以上或更高)krp6蛋白或其同源蛋白的磷酸化水平，则表明该候选物质是促进细胞分裂或增加生物的生物量的物质。
92.以蛋白或基因或其上特定的区域作为靶点，来筛选作用于该靶点的物质的方法是本领域人员所熟知的，这些方法均可用于本发明。所述的候选物质可以选自：肽、聚合肽、拟肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗体或抗体片段、配体、有机小分子、无机小分子和核酸序
列等。根据待筛选的物质的种类，本领域人员清楚如何选择适用的筛选方法。
93.经过大规模的筛选，可以获得一类特异性作用于ael蛋白和/或krp6蛋白或它们的特定位点，对细胞分裂，生物性状有调控作用的潜在物质。
94.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
95.实施例1、ael的分离及其在体外对krp6蛋白的磷酸化
96.ael基因家族包括：ael1，ael2，ael3，ael4，它们的基因组、cds序列及其相应的蛋白序列如表1。上述ael序列信息为拟南芥来源。
97.拟南芥中，krp6基因组序列、cds序列及其编码的蛋白序列如表1。
98.表1
[0099][0100][0101]
其中，krp6蛋白序列(seq id no:1)如下：
[0102][0103]
其中，carf蛋白序列(seq id no:2)如下：
[0104][0105]
本发明人利用引物扩增出全长的ael1编码区，然后通过sali和noti酶切连接到pet-51b载体中，构建获得pet-51b-ael1表达载体。
[0106]
蛋白的表达和纯化方法如下：将构建的表达载体转入大肠杆菌蛋白表达菌株rosettabl21(de3)中，筛选阳性克隆后挑取单克隆接入含有相应抗性的2ml的lb液体培养基中，37℃过夜培养；将过夜培养的菌液按1/100的比例接种到30ml含相应抗性的lb液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养至od600约0.6；加入终浓度为1mm的iptg(isopropyl-b-d-thiogalactoside)，继续在16℃、160rpm、1mm iptg条件下诱导20h；收集用于重组蛋白诱导表达的鉴定。诱导细菌重悬在裂解缓冲液(100mm tris-hcl，150mm nacl and10mm咪唑，ph 7.5)中，用超声法(20s，间隔10s，至悬浮液呈清)破碎后鉴定诱导表达情况。成功诱导且正确表达的菌株重新进行较大量(100ml)的诱导。用ni-nta agarose(qiagen)及ni-nta agarose pruification in native condition handbook步骤在非变性条件下纯化。
[0107]
用类似的方法，本发明人也进行了krp6蛋白的表达和纯化。
[0108]
体外ael1磷酸化krp6蛋白的方法如下：在磷酸化反应缓冲液中(50mm tris-hcl，ph 7.5，10mm mgcl2，1mm dtt和10mm atp)加入ael1蛋白和krp6蛋白以及适量的32p-γ-atp(10mci)，将上述反应液在30℃反应1小时，加入蛋白上样缓冲液停止反应，95℃加热10min，进行sds-page蛋白电泳，120v，2h。磷屏压片6h或过夜。用fujifilm fla 9000plus dage扫描磷屏，得到磷酸化结果。具体结果见图1。
[0109]
根据上述结果，本发明人发现，ael蛋白可以磷酸化细胞周期关键调控因子krp6蛋白。
[0110]
实施例2、底物蛋白磷酸位点的检测和验证
[0111]
本发明人进一步研究了底物蛋白krp6的磷酸化位点。具体地包括：借助磷酸化位点预测网站scansite 4.0(https://scansite4.mit.edu)进行初步预测，lc-ms精确定位。更为重要地，本发明人通过模拟非磷酸化点突变蛋白或模拟磷酸化点突变蛋白进行了体外磷酸化研究，以确证发挥作用的位点。
[0112]
综合分析的结果见图4，krp6的磷酸化位点为第75和109位的丝氨酸。
[0113]
实施例3、ael1基因在体外和体内对krp6蛋白稳定性的调控
[0114]
(1)制备krp6蛋白突变体
[0115]
首先，本发明人利用常规方法，制备了一系列krp6蛋白突变体，包括：
[0116]
突变体krp6
s75a
：krp6蛋白第75位由s突变为a；
[0117]
突变体krp6
s109a
：krp6蛋白第109位由s突变为a；
[0118]
突变体krp6
s75a/s109a
：krp6蛋白第75位由s突变为a，第109位由s突变为a；
[0119]
突变体krp6
s75d/s109d
：krp6蛋白第75位由s突变为d，第109位由s突变为d；
[0120]
突变体krp6
s75d/s109a
：krp6蛋白第75位由s突变为d，第109位由s突变为a。
[0121]
ael123：由ael1，ael2，ael3三个拟南芥salk来源的t-dna插入单突变体杂交获得(参考chen et al.，2018，mol plant 11,706-719)。
[0122]
ael124：由ael1，ael2，ael3三个拟南芥salk来源的t-dna插入单突变体杂交获得(参考chen et al.，2018，mol plant 11,706-719)。
[0123]
(2)体外检测krp6蛋白变化
[0124]
本发明人在体外检测了krp6蛋白的变化。体外检测krp6蛋白变化的方法如下：利用蛋白降解缓冲液(25mm tris-hcl，ph 7.5，10mm nacl，10mm mgcl2，4mm pmsf，5mm dtt和10mm atp)分别提取对照组植株(col-0)和ael突变体植株(ael123、ael124)的总蛋白并进行蛋白定量。在等量对照组和突变体蛋白中分别加入体外纯合的krp6蛋白，并将上述反应液置于22℃，按照不同的时间点来取样。将上述样品分别进行sds-page电泳后进行western检测krp6蛋白的降解情况，以核酮糖二磷酸缩化酶(rubisco)作为内参。
[0125]
细胞的相对整合密度：hek-293a细胞获自美国典型培养物保藏中心(atcc，manaassas，vi，美国)。细胞系在补充有10％胎牛血清(fbs)的dulbecco改良版eagle培养基(dmem)中培养。按照制造商的规程，使用lipofectamine 3000(invitrogen)进行转染；使用软件imagej对灰度进行的检测和统计。
[0126]
(3)体内检测krp6蛋白变化
[0127]
本发明人在体内检测了krp6蛋白的变化。本发明人制备了多种krp6转基因拟南芥材料，包括：
[0128]
krp6转基因拟南芥krp6/col-0：krp6被转入野生型拟南芥；
[0129]
krp6转基因拟南芥krp6/ael123：krp6被转入ael突变体植株ael123中；
[0130]
krp6转基因拟南芥krp6/ael124：krp6被转入ael突变体植株ael124中。
[0131]
体内蛋白稳定性检测方法运用上述krp6转基因材料，用mg132预处理转基因株系使之积累相当的ha-krp6，清洗多次后，用蛋白翻译抑制剂chx处理，于不同的时间点分别取样后检测。
[0132]
体内和体外检测的结果见图2，3，5，6。ael突变体中krp6蛋白降解发生变化。所述结果表明，在ael发生功能缺失时，krp6蛋白会处于更为稳定的状态，降解比例下降；krp6第75位或109位突变为不能被磷酸化的状态(非磷酸化点突变形式，突变为a)后，其在植物体内也变得更为稳定，降解比例下降，且细胞培养中细胞整合密度低、细胞分裂能力弱。若将krp6第75位或109位突变为模拟磷酸化(突变为d)的状态，则其变得相对更不稳定，且细胞培养中细胞整合密度高、细胞分裂能力强。
[0133]
实施例4、动物同源蛋白carf的功能分析
[0134]
在分析过程中，发明人意外地发现，krp6的动物同源蛋白为carf(人源)，如图9。所述carf为一种已知与淋巴肿瘤和血液肿瘤密切相关的蛋白。氨基酸序列比对显示，krp6的第75和109位的丝氨酸在carf中对应第316和356位的丝氨酸，磷酸化位点保守。
[0135]
鉴于细胞分裂这一生物学过程的重要性和保守性，本发明人进一步利用ncbi比对
获得动物中krp6的同源基因carf。并继而采用癌症预后分析网站及单细胞测序数据库进行分析(http://bioinformatica.mty.itesm.mx:8080/biomatec/survivax.jsp；lenz staudt lymphoma gse10846database和gse110499single cell mrna sequencing dataset)。
[0136]
具体结果见图8左图。生物信息学分析显示，krp6在动物中的同源蛋白是carf，通过影响p53的活性参与细胞增殖的调控，临床数据关联性分析显示carf与淋巴肿瘤和血液肿瘤密切相关。
[0137]
实施例5、ael对底物磷酸化的生物学功能分析
[0138]
(1)植物中的功能分析
[0139]
本发明人制备了多种krp6转基因拟南芥材料，包括：
[0140]
krp6转基因拟南芥krp6
s75a/s109a
/col-0：突变体krp6
s75a/s109a
的编码基因被转入野生型拟南芥；
[0141]
krp6转基因拟南芥krp6
s75d/s109d
/col-0：突变体krp6
s75d/s109d
的编码基因被转入野生型拟南芥；
[0142]
krp6转基因拟南芥krp6
s75a/s109a
/ael123：突变体krp6
s75a/s109a
的编码基因被转入拟南芥突变体植株ael123中；
[0143]
krp6转基因拟南芥krp6
s75d/s109d
/ael123：突变体krp6
s75d/s109d
的编码基因被转入拟南芥突变体植株ael123中。
[0144]
在植物中，结合底物蛋白(krp6)及其模拟非磷酸化点突变形式(第75或109位突变为a)或模拟磷酸化点突变形式(第75或109位突变为d)的点突变蛋白对拟南芥的表型进行分析，结果如图7。
[0145]
结果发现，模拟非磷酸化点突变krp6后，其更加稳定，对细胞分裂的抑制更加明显，表现为莲座叶面积显著减小。模拟磷酸化点突变krp6后，则其变得不稳定，莲座叶面积与野生型col-0相比没有变化。并且，在ael功能缺失的ael123中表达模拟磷酸化点突变krp6则还能显著增加莲座叶面积。
[0146]
本发明的检测方法中，还结合了电镜分析叶表皮细胞的大小和数目以及流式细胞术对细胞分裂进程的检测，结果如图8-9。
[0147]
(2)动物中的功能分析
[0148]
在人体中，carf基因组序列、cds序列及其编码的蛋白序列如表1，其中图11中标示了其蛋白片段。
[0149]
根据图11，氨基酸序列比对显示，krp6的第75和109位的丝氨酸在carf中对应第316和356位的丝氨酸。
[0150]
本发明人将在carf中对应第316和356位的丝氨酸进行突变，制备获得了mcarf(第316位突变为a；第356位突变为a；发生突变后的蛋白可模拟非磷酸化的carf蛋白。
[0151]
carf蛋白以及其保守的磷酸化位点突变后的蛋白(mcarf)的编码基因被用于转化人的293a细胞。carf-nl为carf蛋白n端的30个氨基酸序列。以空质粒(vector)和空白处理组(ctrl)作为对照，培养细胞。
[0152]
通过流式细胞术对细胞数目进行分析。具体结果见图10右图。发现表达模拟非磷酸化的carf蛋白的细胞与表达野生型carf蛋白的细胞相比，其增殖受到非常明显的抑制。
[0153]
对carf进行模拟非磷酸化的点突变之后，相关转基因细胞系细胞增殖减缓，细胞分裂受抑制，如图12。
[0154]
图11右图也说明，对carf进行模拟非磷酸化的点突变(mcarf)，显著提高其稳定性，基因细胞系细胞增殖减缓，细胞分裂受抑制。
[0155]
实施例6、基于krp6蛋白的磷酸化水平的筛选
[0156]
筛选体系：如实施例1的体外krp6蛋白磷酸化测定体系。
[0157]
测试组：向该筛选体系给予候选物质；
[0158]
对照组：不向该筛选体系给予候选物质。
[0159]
分别检测测试组和对照组中krp6蛋白磷酸化情况，特别是其第75位和109位的磷酸化情况，并进行比较。如果测试组中krp6蛋白磷酸化水平在统计学上低于(如低30％或更低)对照组，就表明该候选物是抑制细胞分裂或降低生物的生物量的物质；反之，则表明该候选物是促进细胞分裂或增加生物的生物量的物质。
[0160]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。